草地贪夜蛾对苏云金芽孢杆菌BtCry1F毒素抗性基因的分子检测方法

本发明属于生物技术领域，涉及草地贪夜蛾对苏云金芽孢杆菌btcry1f毒素抗性基因突变的分子检测方法，专用于草地贪夜蛾腺苷三磷酸(atp)结合盒转运蛋白c2基因第15号外显子12-bp插入突变的高灵敏度、快速检测。

技术背景

草地贪夜蛾spodopterafrugiperda(j.e.smith)是一种原产于美洲热带和亚热带地区的世界性的害虫，主要为害玉米、高粱、棉花和大豆等作物。多食性、高繁殖力、迁飞能力强和易产生抗药性等生物学特性强化了草地贪夜蛾的害虫地位。草地贪夜蛾分为玉米型和水稻型，玉米型主要危害玉米、高粱、棉花等作物，水稻型主要危害水稻和牧草。2016年1月草地贪夜蛾入侵非洲西部地区，并在2年内扩散至整个撒哈拉沙漠以南非洲地区；2018年5月入侵印度，并在3个月内扩散至整个印度。草地贪夜蛾于2019年初自缅甸侵入我国云南普洱，截至2019年8月，已在云南、广东和河北等24个省(区)发现该虫为害，严重威胁我国农作物生产安全。

在草地贪夜蛾的原发地美洲地区，2000年以前主要传统化学杀虫剂(有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂)进行化学防治，并导致部分田间种群产生了抗药性。2000年以后主要依靠种植bt抗虫玉米(表达cry1f)，2007年首先在波多黎各报道该害虫对cry1f产生抗性并导致bt抗虫玉米防效下降，其后在巴西、阿根廷和美国南部也发现该害虫对cry1f产生高水平抗性。草地贪夜蛾的诸多生物学特性非常有利于抗性基因的扩散，加强抗药性监测预警及抗性治理对于我国草地贪夜蛾的有效防控尤为重要。

现有国内外研究表明，草地贪夜蛾对cry1f毒素靶标抗性的分子机理均为abcc2基因突变导致的蛋白结构变化。其中，三个抗性等位基因由国外学者报道，分别为该基因4号外显子错误剪接、13号外显子2-bp插入导致翻译的蛋白截短、14号外显子6-bp缺失导致翻译的蛋白截短。可见，abcc2基因编码蛋白的功能丧失将导致草地贪夜蛾对cry1f毒素产生抗性。

技术实现要素：

本发明的目的是针对新发现的草地贪夜蛾abcc2基因突变缺乏精准、快速检测手段的问题，提供草地贪夜蛾abcc2基因第15号外显子12-bp插入突变的分子检测方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种草地贪夜蛾对苏云金芽孢杆菌btcry1f毒素抗性的分子检测方法，所述的抗性基因为草地贪夜蛾腺苷三磷酸(atp)结合盒转运蛋白c2基因(genbank数据库登录号ky489760.1)，其特征在于利用seqidno.1所示的特异性正向引物f和seqidno.2所示的特异性反向引物r对草地贪夜蛾基因组dna模板进行pcr扩增，对pcr纯化产物直接测序，根据测序色谱图鉴定草地贪夜蛾样本abcc2基因第15号外显子的核苷酸是否发生12-bp插入，一次性区分出所述abcc2基因的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子。

本发明涉及的草地贪夜蛾abcc2基因野生型序列来源于genbank数据库(登录号ky489760.1)。我们研究发现该基因第15号外显子插入“tattcgatagta”碱基后(附图1)，其编码的蛋白质在插入位点后翻译2个氨基酸即发生提前终止，遭受破坏的abcc2蛋白结构将导致草地贪夜蛾对cry1f毒素产生抗性。

所述的根据直接测序色谱图准确鉴定草地贪夜蛾个体的abcc2基因第15号外显子是否发生12-bp插入突变，一次性区分出敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子的方法为：色谱图中识别序列后为“caatccatcggg”碱基峰图，则表明该草地贪夜蛾个体为不携带本专利所述12-bp插入突变的敏感纯合子；色谱图中识别序列后为“tattcgatagta”碱基峰图，则表明该草地贪夜蛾个体为本专利所述12-bp插入突变的抗性纯合子；色谱图中识别序列后为上述两个序列的叠加峰图(套峰)，则表明该草地贪夜蛾个体为携带本专利所述12-bp插入突变的抗性杂合子。其中，所述的识别序列为5′-ttcgatac-3′。

说明书中所述的第15号外显子12-bp的插入突变序列为“tattcgatagta”。

所述的分子检测方法，优选包含以下步骤：

(1)提取单头草地贪夜蛾幼虫或成虫的基因组dna；

(2)利用seqidno.1所示的特异性正向引物f和seqidno.2所示的特异性反向引物r，对上一步提取的草地贪夜蛾基因组dna进行pcr扩增；

(3)将上一步获得的pcr产物进行1.2％的琼脂糖凝胶电泳，对目的片段纯化回收后进行直接测序，测序引物为seqidno.1所示的引物f，通过检测草地贪夜蛾abcc2基因第15号外显子的部分核苷酸测序色谱图，鉴定携带抗性基因的个体。

其中pcr反应体系25μl：12.5μlof2×taqpcrmastermix，1μl单头草地贪夜蛾样本的基因组dna，10mm的f和r引物各1μl，加双蒸水9.5μl至反应总体积为25μl。pcr反应程序：95℃预变性3min，然后循环数为35：95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min。

用于分子检测草地贪夜蛾abcc2基因第15号外显子抗性突变的引物对，由seqidno.1所示的特异性正向引物f和seqidno.2所示的特异性反向引物r组成。

一种用于检测草地贪夜蛾对苏云金芽孢杆菌btcry1f毒素抗性基因突变的试剂盒，包含本发明所述的引物对。

本发明所述的引物对在分子检测草地贪夜蛾对cry1f毒素抗性中的应用。

本发明所述的试剂盒在分子检测草地贪夜蛾对cry1f毒素抗性中的应用。

一种突变的草地贪夜蛾abcc2基因，野生型abcc2基因序列的genbank数据库登录号ky489760.1,所述的突变的草地贪夜蛾abcc2基因第15号外显子的核苷酸发生12-bp插入突变，插入突变序列为“tattcgatagta”。

本发明所述的突变的草地贪夜蛾abcc2基因作为检测靶点在鉴定草地贪夜蛾对苏云金芽孢杆菌btcry1f毒素抗性中的应用。

有益效果

本研究首次发现草地贪夜蛾abcc2基因15号外显子12-bp的插入突变可导致草地贪夜蛾abcc2基因提前出现终止密码子，进而导致翻译蛋白的截短，从而不能形成完整的蛋白结构导致草地贪夜蛾对cry1f抗性产生，且在采集自巴西的地理种群中检测到突变情况。本发明基于上述发现建立了草地贪夜蛾对cry1f毒素抗性的分子检测方法。

我国自主研发的bt玉米技术已经成熟，种植bt玉米防控草地贪夜蛾是可行的，也是必要的。但是，在bt玉米商业化种植之前需要依据我国的实际情况制订预防性抗性治理策略，并在bt玉米商业化种植时同步实施，以实现bt玉米的长期种植和草地贪夜蛾等靶标害虫的可持续控制。本发明所述的分子检测技术及试剂盒可有效运用于草地贪夜蛾的cry1f抗性早期检测和预警，具备良好的社会和经济效益。

附图说明

图1草地贪夜蛾abcc2基因第15号外显子12-bp插入突变的核苷酸和氨基酸序列

图示草地贪夜蛾abcc2基因15号外显子部分序列，其中野生型序列来自genbank数据库(登录号ky489760.1)；抗性序列来自巴西种群的测序结果，即发生了5’-tattcgatagta-3’的12-bp碱基插入，该突变使正常蛋白在插入点后仅翻译2个氨基酸即出现提前终止，无法形成具备正常生理功能的蛋白结构。

图2草地贪夜蛾abcc2基因第15号外显子12-bp插入突变区域的直接测序色谱图

敏感纯合子色谱图：识别序列(5′-ttcgatac-3′)后为“caatccatcggg”碱基峰图；抗性杂合子色谱图：识别序列(5′-ttcgatac-3′)后为“caatccatcggg”和“tattcgatagta”两条序列的叠加峰图(套峰)。注释：基于目前研究进展，抗性纯合子尚未检测到。

具体实施实例：

实施例1

本实施例选取了采集自巴西对cry1f杀虫蛋白具有高水平抗性材料的14个草地贪夜蛾个体进行了分子检测，并运用本发明优选的技术检测了其携带abcc2基因15号外显子12-bp插入突变的等位基因频率。其中，ss表示该位点为野生纯合性、rs表示该位点为突变杂合型、rr表示该点位为突变纯合型。具体检测信息如下：

表1巴西采集的草地贪夜蛾样本abcc2基因15号外显子突变检测结果

根据本发明优选的分子检测技术，其具体实施步骤包括：

1.使用axyprep^tmmultisourcegenomicdnaminiprepkit基因组试剂盒提取草地贪夜蛾样本的全基因组dna。

2.以各草地贪夜蛾样本的基因dna模板进行abcc2基因目的片段的pcr扩增。

(1)设计草地贪夜蛾abcc2基因的特异性引物，上游引物f序列为:5'-agatcctgarttgracactcaagt-3'(seqidno.1)、下游引物r序列为:5'-cactattgatttgcacttacccgatg-3'(seqidno.2)。

(2)在0.2ml的pcr管中完成总反应体积为25μl的目的片段扩增：

(3)pcr反应程序为：首先95℃预变性3min，进行循环数为35：95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。

3.对14个样本获得的pcr产物纯化后进行直接测序。

(1)制备1.2％(g/ml)的琼脂糖凝胶，取25μlpcr扩增产物进行电泳，稳流120ma，20分钟后在紫外光下观察。

(2)对目的片段进行切胶回收，在制备管的滤膜中央加入30ul去离子水溶解dna，产物送南京擎科生物科技有限公司由引物f(seqidno.1)完成直接测序。

(3)分析直接测序色谱图，根据对应于abcc2基因第15外显子是否发生12-bp的插入突变判定样本是否携带抗性基因。

4.计算草地贪夜蛾样本携带抗性基因的突变频率。

草地贪夜蛾样本abcc2基因第15外显子12-bp插入突变的抗性等位基因频率的计算方法如下：

抗性等位基因频率(rf)＝(抗性纯合子个体数×2+抗性杂合子个体数)/(总检测样本数×2)

根据上述计算方法，测得本例检测的巴西草地贪夜蛾样本的抗性等位基因突变频率如下：

rf＝2/(14×2)＝7.14％

通过本实施案例，本发明优选的分子检测技术可以快速测定草地贪夜蛾abcc2目的区域的基因型，同时利用介绍的计算方法可以获得种群携带abcc2抗性等位基因的突变频率。

序列表

<110>南京农业大学

<120>草地贪夜蛾对苏云金芽孢杆菌btcry1f毒素抗性基因的分子检测方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agatcctgarttgracactcaagt24

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cactattgatttgcacttacccgatg26