本发明属于生物大分子药物
技术领域：
：，更具体地，涉及一种mt1-mmp特异性靶向并激活的细胞穿膜肽及应用。
背景技术：
：：生物大分子药物以其作用的高度专属性，在治疗肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病、免疫性疾病等重大疾病中，显示出小分子药物难以企及的明显优势，成为药物研究领域最具发展前景的研究对象。然而，由于多数大分子药物的作用靶标均位于细胞内，细胞膜成为大分子药物胞内递送无法避免的一道重要屏障，如何使大分子药物有效地跨膜成为发挥其药效必须要解决的问题之一。细胞穿膜肽(cellpenetratingpeptide，cpp)或称蛋白转导结构域(proteintransductiondomain，ptd)的发现为解决大分子药物跨膜难的问题提供了一个有效的对策。自1988年被发现以来，cpp由于其强大的携载和跨膜能力(可携带小至几百道尔顿的化合物到大至几百纳米的脂质体和纳米粒子进入细胞)，同时还具有低细胞毒性、无细胞类型限制的优点，受到广泛关注，被应用于解决药物、特别是大分子药物的跨膜递送问题中。诸多研究表明，cpp与药物分子的偶联，大幅度提高了细胞对药物的摄取率，从而提高了药效。然而由于cpp缺乏细胞选择性，导致其在应用过程中无法避免所携载细胞毒性药物对正常细胞的损伤，此问题直接限制了其临床应用，如何解决cpp对病变细胞特别是肿瘤细胞的选择性靶向是一个值得关注的问题。近年来，研究者开发了多种策略来解决这一问题，其中主要以合成cpp与具有靶向功能的分子/材料的偶联物来实现。根据靶向方法的不同，这些cpp偶联物的靶向，主要分为主动靶向和被动靶向两大类：主动靶向主要通过将cpp与具有靶向功能的配体、抗体、多肽等偶联，基于配体与受体、抗体与抗原特异性相互作用，利用肿瘤细胞与正常细胞之间受体/抗原的表达量差异，而实现靶向；被动靶向则主要是通过将ccp与纳米材料偶联，借助纳米粒子的epr(enhancedpermeabilityandretention)效应来实现靶向。这些策略为解决cpp对肿瘤细胞的选择性靶向问题提供了新思路。然而，受肿瘤的异质性等复杂混乱的生物学特性影响，主动靶向策略的实施较难获得理想的靶向效果。因此，开发新的靶向策略，进一步提高cpp偶联物(包括cpp与具有靶向功能的分子/材料的偶联物及其衍生物)的靶向性，以充分发挥其在介导生物大分子药物有效跨膜中的作用，促使更多的生物大分子药物走向临床或拓展其的临床应用范围，具有非常高的应用价值和现实意义。提高cpp偶联物的靶向性即是提高cpp偶联物对肿瘤组织/细胞的选择性，可以从以下两个层面入手：1、cpp偶联物的分布层面：提高cpp偶联物在靶部位的选择性分布。加大cpp偶联物在肿瘤组织和正常组织之间积累的浓度差，这可以通过主动或被动靶向方法实现。2、cpp的功能层面：提高cpp跨膜功能的选择性控制。对cpp的跨膜功能进行选择性控制，使cpp的跨膜功能在到达靶部位时才选择性开启，确保cpp与药物偶联物即使分布在非靶部位，也无法发挥cpp跨膜功能而使药物产生药效，这样会进一步提高cpp偶联物的靶向性。近年来，有关cpp功能的可控性研究逐渐兴起。其中，将cpp设计成功能可激活型分子(acpp，activatablecellpenetratingpeptide)，实现cpp功能可控开启的报道逐渐涌现。酶激活型acpp则是其中比较有代表性的一类。由于基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteases，mmps)与肿瘤发生发展息息相关，因此mmp激活型acpp已被成功应用于药物的递送与肿瘤成像中。基质金属蛋白酶mmps(matrixmetalloproteinases)是一类肿瘤相关蛋白酶，其在肿瘤侵袭转移过程中起着非常重要的作用，mmps不仅介导肿瘤细胞对宿主的包括基底膜在内的细胞外基质的降解，还控制肿瘤新生血管生成、影响细胞黏附分子的功能以及调控肿瘤细胞(原位及异位)的生长等，是肿瘤侵袭转移过程中最重要的调控分子之一。人体内表达的23个mmp可以简单地分为两类：分泌可溶型mmp(extracellularmmps,ec-mmps)(mmp-1,-2,-3,-7,-8,-9,-10,-11,-12,-13,-19,-20,-21,-22,-27,-28)和膜型mmp(membrane-typemmps,mt-mmps)(mmp-14,-15,-16,-17,-23,-24,-25)。其中，mt1-mmp(mmp-14)作为mmps家族中的重要一员膜蛋白，发挥着降解基底膜与细胞外基质以及调节细胞运动、生长、分化、凋亡等多种生命功能。研究表明，其在结肠癌、胃癌、乳腺癌和宫颈癌的转移与侵袭中都扮演着重要的角色。由于mmp是一个大家族，各成员间同源性较高，存在较强的底物交叉活性，同一底物可被不同的mmp所酶切，这一现象影响了mmp激活型acpp的特异性，导致其在非靶区的响应。如能同时从分布的选择性和功能的选择性两个层面同时入手进行cpp偶联物的分子设计，使两种策略优势互补，即设计一个能与肿瘤相关蛋白酶mmp结合又由其激活的acpp，则有望提高cpp的靶向特异性，进而提高其携载药物作用的靶向性。技术实现要素：本发明提供了一条mt1-mmp特异性靶向并激活的细胞穿膜肽(mt-cpp)。为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种mt1-mmp特异性靶向并激活的细胞穿膜肽，该细胞穿膜肽包括由n端至c端的：细胞穿膜肽cpp、mt1-mmp酶切位点、氨基酸连接体、mt1-mmp靶向肽。根据本发明一种优选实施方式，所述细胞穿膜肽的氨基酸序列如seqidno：1所示；n-vsrrrrrrggrrrrggslaplglqrrggggsggggsggggshwkrlhntktfl-c(seqidno：1)。本发明的所述细胞穿膜肽可通过本领域常规的各种方法制得，例如，通过质粒构建-融合蛋白表达得到，也可以多肽合成得到。本发明的第二方面提供所述mt1-mmp特异性靶向并激活的细胞穿膜肽在制备药物载体中的应用。特别地，所述药物为生物大分子药物。进一步地，所述生物大分子药物为具有跨膜障碍的生物大分子药物。本发明提供一条mt1-mmp特异性靶向并激活的细胞穿膜肽。该细胞穿膜肽的结构示意图及作用机理示意图如图1所示。该融合多肽由mt1-mmp靶向肽、多肽linker、mt1-mmp酶切位点、cpp所组成。该体系的mt1-mmp酶切位点通过多肽linker与mt1-mmp靶向肽连接，借助mt1-mmp靶向肽的锚定性提高了mt1-mmp对酶切位点的结合和酶切的特异性，进而使该cpp的酶响应特异性得以提高，可应用于实现了cpp介导下具有跨膜障碍的生物大分子药物对肿瘤细胞的特异跨膜，进而有效杀灭肿瘤细胞。该融合多肽中所用的cpp为小分子鱼精蛋白(lowmolecularweightprotamine，lmwp)，具有低毒、无免疫原性的特点。此外，该融合多肽在使用时可通过融合表达手段与所携载蛋白质药物进行融合表达，一步得到。该融合多肽将有望拓展透膜性差临床大分子药物的应用范围，同时使更多具有跨膜障碍的生物大分子药物走向临床。本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。附图说明通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。图1示出了mt1-mmp特异性靶向并激活的细胞穿膜肽的结构示意图及作用机理示意图。图2为mt-cpp与红色荧光蛋白(mcherry)融合表达产物与mcherry、mt-cppmut-mcherry细胞摄取比较的激光扫描共聚焦显微镜图。具体实施方式下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例11、mt-cpp多肽的质粒构建通过基因合成编码mt-cpp和所携载蛋白(mcherry)的dna序列(seqidno：2，其中第1-708位为编码mcherry的dna序列，第709-867位为编码mt-cpp的dna序列)，然后连入pet30a载体的ndei-hindiii多克隆位点，得到重组蛋白表达质粒，之后将构建好的质粒进行测序确认。2、融合蛋白的表达与纯化(一)融合蛋白的表达1、质粒转化在超净台中移取1μl步骤1构建好的重组蛋白表达质粒加入50μlbl21(de3)plyss感受态细胞中，冰上放置30min后，42℃金属浴加热90s，再于冰上放置2min，然后加800μl37℃预热的2×yt培养基，180rpm37℃培养1h使感受态细胞复苏。在3000rpm条件下离心3min后去除600μl上清，重悬剩余的菌液，用涂布棒均匀涂于含卡那霉素(kana)的琼脂板上，琼脂板放于37℃条件下，过夜培养使其长出单菌落。2、诱导与表达挑取单菌落于含0.1mg/mlkana的2×yt培养基(25ml)中，220rpm37℃过夜培养。第二天按3-5％的比例将培养液转移至500ml2×yt培养基中，继续培养至od600值在0.6-0.7之间，加入终浓度为0.5mm的iptg，220rpm15℃诱导16h。菌液在10000rpm，4℃条件下离心5min，去除上清，收菌沉淀，最后用20mmtris-hcl(ph8)洗涤两次，-20℃冻存。(二)融合蛋白的纯化1、菌体裂解将冻存菌体置冰上30min使其融化，并加适量lysisbuffer重悬，用细胞破碎仪超声将细胞破碎，主要参数为pluson3s，plusoff7s，频率30％，温度4℃，总时间10min。将菌液在12000rpm、4℃离心45min后获上清蛋白溶液。2、快速蛋白纯化系统(fplc)纯化冲乙醇：将a、b泵头从20％乙醇中移到已过膜的超纯水中，清洗系统中的乙醇，参数为pumbwashbasica/bon清洗。完毕后，设置参数，alarmpressure0.3mpa，流速1ml/min，50％b，将histrapexcel亲和柱装于仪器上继续运行20min。平衡系统：将a、b泵头分别放入已过膜的低盐和高盐中，0％b至基线平稳。上样：在50ml上样环中加入离心且过膜的蛋白样品并连接仪器，设参数，uvabsorbancezero，inject，流速0.3ml/min，fraction900，1.2ml。上样结束后设参数0％b，流速1ml/min，将紫外吸收值降至平稳。梯度洗脱：设参数0-60％b，1ml/min，alarmpressure0.3mpa，fraction900，time60min，volume1.2ml。收集：根据uv280nm和uv254nm两个波长的出峰情况收集蛋白。洗杂蛋白：设参数fractionstop900，100％b，1ml/min运行20min。后处理：将a、b泵头放入过膜的超纯水中，50％b将cond％降到0.4％以下，最后用20％乙醇洗系统，50％b流速1ml/min，时间30min。(三)融合蛋白的sds-page检测将蛋白质样品与1×sdsloadingbuffer等量混合，95℃加热10min。配制12％sds-page胶，装电泳系统，加电泳缓冲液，上样10μl。工作初始电压80v，待考马斯亮蓝条带至分离胶与基层胶的分界线后，调电压为120v。电泳结束后，将sds-page胶取出加适量染色液室温染色30min，去除染色液，脱色液脱色至条带清晰，成像。(四)细胞成像步骤：1、将直径15mm的盖玻片置于24孔细胞板中，紫外灯下灭菌30min；2、用rpmimedium1640basic培养基(含有10％fbs和1％青霉素-链霉素)培养人纤维肉瘤细胞ht-1080，待其达对数生长期时，以8×104个/ml的密度接种于24孔板中，在37℃、5％co2饱和湿度条件下的孵箱中过夜培养；3、待细胞板中细胞密度达90％以上，吸去培养基，细胞用pbs洗涤后，将各实验组(pbs，dds，cs，bp，cpp和ctrl)与ht-1080细胞共孵育2h，吸去培养基，并用pbs洗3次；4、用4％多聚甲醛固定15min，吸去固定液，用pbs洗涤3次；5、加入5μg/ml的dapi溶液与细胞共孵育15min，吸去dapi溶液，用pbs洗涤3次。6、将盖玻片从细胞板中取出，置于载玻片上；7、在594nm激发波长下观察各组荧光强度，从而观测细胞摄取情况。使用奥林巴斯fv-1000激光扫描显微镜采集图像，并使用fluoview软件(olympus，tokyo，japan)分析和操作数据。结果如图2所示。本实施例将mt-cpp-mcherry(mt-cpp与mcherry的融合蛋白，其氨基酸序列如seqidno：3所示，其中，第1-236位为mcherry氨基酸序列，第237-289位为mt-cpp氨基酸序列)、(mt-cpp)mut-mcherry和mcherry三个融合蛋白分别与ht-1080细胞进行孵育，随后进行细胞成像以考察细胞对各融合蛋白的摄取。其中(mt-cpp)mut-mcherry融合蛋白中的(mt-cpp)mut为突变的mt-cpp，将mt1-mmp靶向肽部分突变为不被mt1-mmp所识别的序列，再将其与mcherry融合，得到(mt-cpp)mut-mcherry，作为实验对照组。(mt-cpp)mut氨基酸序列为n-vsrrrrrrggrrrrggslaplglqrrggggsggggsggggsggggggsggggs-c(seqidno：4)。如图2所示，成像结果显示，相比两个对照组((mt-cpp)mut-mcherry和mcherry组)，mt-cpp-mcherry组细胞显示出更强的红色荧光，即更多的细胞摄取，此结果表明，mt-cpp的连接增强了mcherry的入胞能力。由于(mt-cpp)mut-mcherry经突变，失去了对mt1-mmp的特异性靶向性，因此入胞效率降低。由此表明，本发明的细胞穿膜肽mt-cpp具有优异的mt1-mmp靶向特异性。以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本
技术领域：
：的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。序列表<110>天津医科大学<120>一种mt1-mmp特异性靶向并激活的细胞穿膜肽及应用<130>bji1901916tjmu<141>2020-02-19<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>53<212>prt<213>artificialsequence<400>1valserargargargargargargglyglyargargargargglygly151015serleualaproleuglyleuglnargargglyglyglyglysergly202530glyglyglyserglyglyglyglyserhistrplysargleuhisasn354045thrlysthrpheleu50<210>2<211>867<212>dna<213>artificialsequence<400>2atggttagcaaaggcgaagaggataacatggcgatcatcaaagagttcatgcgcttcaaa60gtccacatggaaggcagcgttaacggtcacgaattcgaaattgaaggcgaaggcgaaggt120cgtccgtacgaaggtacccaaaccgcaaaactgaaagtcaccaaagggggtccgctgccg180tttgcttgggatattctgtctccgcagttcatgtacggcagcaaagcatacgtcaaacat240ccggcggatattccggattacctgaaactgtcctttccggaaggcttcaaatgggaacgc300gtcatgaactttgaagacggcggcgttgttaccgttacccaagatagttctctgcaggac360ggtgagttcatctacaaagtcaaactgcgcggcaccaattttccgtctgacggtccggtc420atgcagaaaaagaccatgggctgggaggcgtcttctgaacgtatgtatccggaagacggc480gcactgaaaggcgaaatcaaacagcgcctgaaactgaaagacggcggtcattacgacgca540gaagtcaaaaccacctacaaagcgaaaaaaccggttcaactgccgggcgcatataacgtt600aacatcaaactggacatcaccagccacaacgaggattacaccatcgtcgaacagtacgaa660cgcgcagaaggtcgtcattctaccggcggtatggacgaactgtataaagttagccgccgt720cgtcgtcgtcgcgggggtcgtcgtcgtcgcggtggtagtctggctccgctgggtctgcaa780cgtcgtggtggtggtggttccggcggcggtggtagtggtggtggtggttcccattggaaa840cgtctgcacaacaccaaaaccttcctg867<210>3<211>289<212>prt<213>artificialsequence<400>3metvalserlysglyglugluaspasnmetalaileilelysgluphe151015metargphelysvalhismetgluglyservalasnglyhisgluphe202530gluilegluglygluglygluglyargprotyrgluglythrglnthr354045alalysleulysvalthrlysglyglyproleuprophealatrpasp505560ileleuserproglnphemettyrglyserlysalatyrvallyshis65707580proalaaspileproasptyrleulysleuserpheprogluglyphe859095lystrpgluargvalmetasnphegluaspglyglyvalvalthrval100105110thrglnaspserserleuglnaspglyglupheiletyrlysvallys115120125leuargglythrasnpheproseraspglyprovalmetglnlyslys130135140thrmetglytrpglualasersergluargmettyrprogluaspgly145150155160alaleulysglygluilelysglnargleulysleulysaspglygly165170175histyraspalagluvallysthrthrtyrlysalalyslysproval180185190glnleuproglyalatyrasnvalasnilelysleuaspilethrser195200205hisasngluasptyrthrilevalgluglntyrgluargalaglugly210215220arghisserthrglyglymetaspgluleutyrlysvalserargarg225230235240argargargargglyglyargargargargglyglyserleualapro245250255leuglyleuglnargargglyglyglyglyserglyglyglyglyser260265270glyglyglyglyserhistrplysargleuhisasnthrlysthrphe275280285leu<210>4<211>53<212>prt<213>artificialsequence<400>4valserargargargargargargglyglyargargargargglygly151015serleualaproleuglyleuglnargargglyglyglyglysergly202530glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyglyglyser354045glyglyglyglyser50当前第1页12当前第1页12