转基因玉米BBHTL8-1外源插入片段旁侧序列及其应用的制作方法

本发明属于植物生物
技术领域：
，具体涉及一种转基因抗虫耐除草剂玉米bbhtl8-1外源插入片段旁侧序列及其应用。
背景技术：
：玉米在我国重要的粮食作物，也是重要的饲料及工业原料，在保障国家粮食安全和国民经济发展中发挥重要作用。玉米螟和双斑萤叶甲每年都对我国的玉米生产造成重大损失。杂草也对我国玉米生产造成严重危害，一般年份造成10-30%的减产，严重可达50%以上，随着人工成本的增加，依靠人工除草大大增加生产成本。为防治害虫和降低杂草发生，农民常大量使用高毒化学农药进行防治，导致玉米农药残留严重，且喷药过程容易引起中毒事件发生，严重危害人民健康。抗虫和抗除草剂玉米的研制对于我国玉米产业的发展具有重要意义。转基因技术为玉米的遗传改良提供了一条新的分子育种途径。利用转基因技术培育的抗虫、抗除草剂转基因作物是农业害虫控制和杂草防除的有效手段，可有效减少农民对化学杀虫剂的依赖，降低人工成本，提高玉米产量和品质，对于保护生态环境和生物多样性具有重要意义。bt基因cry1ab主要应用于针对鳞翅目害虫玉米螟和棉铃虫的抗虫基因。孟山都公司的mon810、杜邦公司的tc1507、先正达公司的bt11、bt176、先锋公司的dp4114等转基因品种含有cry1ab，均已实现了商业化种植推广。cry3bb主要针对玉米双斑萤叶甲等鞘翅目类昆虫，孟山都公司的mon863、mon88017中的cry3bb1可以抗玉米根虫鞘翅目害虫。草甘膦（glyphosate）是一种内吸性、广谱性、施用于叶面的有机膦类除草剂，1971年由孟山都公司成功开发，是全球销售最好的除草剂，具有高效、低毒、易降解等特点。其可以竞争性抑制植物和细菌的莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)的活性。孟山都公司的nk603、mon87427将具有抗草甘膦除草剂能力的cp4epsps基因转入农作物中，使这些作物具有抗草甘膦能力，并得到了大规模的商业化应用。维生素e（生育酚）具有重要的抗氧化功能，是动物和人体必须的一种脂溶性维生素，包括8种生育酚，即α、β、γ、δ-生育酚和α、β、γ、δ-三烯生育酚，玉米中以α、β、γ、δ-生育酚为主，其中α-生育酚活性最高，γ-生育酚在玉米中含量最高，但其活性只有α-生育酚的1/10。zmhpt可以提高植物体内的维生素e总含量。zmtmt可以把低活性的γ-生育酚转化为高活性的α-生育酚，两个基因的结合可以显著提高玉米的α-生育酚含量。国际农业生物技术应用服务组织发布的2018年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势表明，2018年转基因作物继续保持高应用率，全球种植面积达到1.917亿公顷。具有复合抗虫性状的转基因作物种植面积占全球种植面积的42%。在美国，复合性状的转基因玉米的种植面积占玉米总种植面积的76%。复合性状转基因作物具有成本低、效率高、管理方便、投入较少等优点，将会得到农民的更多的应用和青睐。转基因作物抗虫的关键是获得具有抗虫性能的优良杀虫蛋白，目前比较常用的是bt杀虫蛋白，比如cry1ab、cry1f、cry2bb等。单独使用一种杀虫蛋白容易引起害虫的抗性产生和发展。培育含多个抗虫蛋白的转基因作物可以更有效地延缓害虫抗性的发生，种植具有复合性状的转基因作物已成为趋势。除了抗虫耐除草剂性状外，转基因植物也引入其它优良性状，比如防褐变、低丙烯酰胺含量、抗晚疫病等性状的马铃薯、防褐变的苹果、耐旱甘蔗、含有维生素a原转化体gr2e的转基因黄金大米等。我国还没有商业化种植的转基因玉米，转基因玉米研发处于环境安全评价的不同阶段，我们培育的转基因玉米具有抗虫耐除草剂和富含维生素e复合性状特性，籽粒中的维生素e的含量提高，能够满足饲料需求，可降低饲料生产成本，同时降低化学合成造成的污染。未来通过转基因安全评价获得安全生产证书后，可应用于商业种植，有效的减少玉米螟发生、降低杂草发生，降低人工成本和农药使用，提高玉米生产效益。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种转基因抗虫耐除草剂玉米bbhtl8-1外源插入片段旁侧序列及其应用。一种转基因玉米bbhtl8-1外源插入旁侧序列，所述旁侧序列的核苷酸序列分别如序列表seqidno：1和seqidno：2所示。所述外源插入片段包括抗虫基因cry1ab、cry3bb、抗草甘膦基因cp4epsps基因、玉米zmhpt和zmtmt基因。所述转基因玉米bbhtl8-1外源插入序列及其旁侧序列在检测转基因玉米bbhtl8-1中的应用。用于检测转基因玉米bbhtl8-1的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表seqidno：3-4所示。用于检测转基因玉米bbhtl8-1的试剂盒，含有所述的特异性引物对。所述的特异性引物对在检测转基因玉米bbhtl8-1亲本、后代、杂种f1，及其植株、组织、种子或其制品中的应用。一种检测转基因玉米bbhtl8-1的方法，以样品总dna为模板，利用所述的特异性引物对进行pcr反应，若扩增产物条带大小为240bp，则待测样品含有bbhtl8-1来源的成分。本发明的有益效果：本发明根据玉米的密码子使用频率对抗虫基因cry1ab、cry3bb和抗草甘膦基因cp4epsps基因密码子进行优化，使其在玉米中能够高效表达和翻译，将优化的cry1ab、cry3bb和cp4epsps以及来自玉米的zmhpt和zmtmt基因构建到植物表达载体，采用农杆菌侵染法，转化幼胚，以草甘膦为选择压力，获得了具有抗虫、耐除草剂复合抗性的转基因玉米。利用全基因组测序和旁侧序列测序对外源片段插入位置进行了分析，对cry1ab、cry3bb、cp4epsps、zmhpt和zmtmt基因表达量和蛋白表达量进行了分析，同时对转基因玉米的抗虫和除草剂性能、籽粒维生素e含量进行了评价。bbhtl8-1转基因玉米今后有可能进入商业化种植。本发明提供了抗虫耐除草剂转基因玉米bbhtl8-1插入位点的外源插入片段的旁侧序列，其为外源插入片段的3’端旁侧序列。特定的转基因事件其旁侧序列是特定的，旁侧序列与外源基因组的整合片段，可以通过设计引物，包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段，进行pcr扩增，检测特异性pcr条带。在外源插入片段设计上游特异性引物，在3’旁侧序列设计下游特异引物，扩增特异性片段。也可以根据在5’端旁侧序列设计上游特异性引物，根据外源插入片段设计下游特异性引物，扩增特异性片段。附图说明图1为pl8质粒的图谱。图2为cry1ab、cry3bb、zmtmt、zmhpt、cp4epsps基因在bbhtl8-1材料特异性pcr检测；图中，阴性对照为郑58，阳性对照为转基因t1代植株，marker为100bp分子量标准。图3bbhtl8-1材料特异性pcr检测；图中，1：bbhtl8-1玉米株系；2：阳性对照（转基因t1代植株）；3：阴性对照（非转基因郑58对照）；m：100bp分子量标准。图4为cry1ab、cry3bb1、cp4epsps、zmhpt、zmtmt基因在bbhtl8-1材料5叶期和成熟期表达量；图中（a）为cry1ab、cry3bb1、cp4epsps、zmhpt、zmtmt基因在bbhtl8-1材料5叶期表达量；（b）为cry1ab、cry3bb1、cp4epsps、zmhpt、zmtmt基因在bbhtl8-1材料成熟期表达量。图5为bbhtl8-1材料抗除草剂能评价，喷施草甘膦1周后转基因bbhtl8-1材料与非转基因对照材料生长情况。图6bbhtl8-1材料田间抗虫能评价；田间接虫后非转基因植株和bbhtl8-1在叶片（a-b）和果穗（c-d）上的表型，白色箭头所指为虫孔位置，阴性对照为非转基因玉米材料郑58。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。实施例1转基因材料的获得根据玉米的密码子使用频率对cry1ab、cry3bb和cp4epsps基因进行密码子优化，将优化的cp4epsps、cry1ab和cry3bb基因以及来自玉米的zmhpt和zmtmt基因构建到植物表达载体，载体骨架来自pcambia1300载体序列，载体大小25221bp，载体图谱见图1，其中rb到lb之间的包含cry1ab、zmtmt、zmhpt、cry3bb和cp4epsps五个表达框（表1-表5）。表1cry1ab表达框名称大小功能e35s619bp花椰菜花叶病毒35s启动子（双camv35s）,含有重复增强子区域。act2intron591bp水稻肌动蛋白基因act2第一内含子，稳定cry1ab表达。cry1ab2451bp来源于苏云金芽孢杆菌cry1ab基因，表达cry1ab蛋白质，抗鳞翅目昆虫。tnos224bp来源于农杆菌胭脂氨酸合成酶的3’端非转录区，终止转录，引导信息rna聚腺苷酸化。表2zmtmt表达框名称大小功能glb11439bp玉米胚特异性启动子glb1，使目的基因在玉米的胚中特异性高表达。zmtmt1059bp来源于玉米，是维生素e合成途径上的关键酶，可以提高种子中α维生素e的含量。tglb1986bp来源于玉米胚特异性基因glb1的3’端非转录区，终止转录,引导信息rna聚腺苷酸化。表3zmhpt表达框名称大小功能glb11620bp玉米胚特异性启动子glb1，使目的基因在玉米的胚中特异性高表达。zmhpt1200bp来源于玉米，是维生素e合成途径上的关键酶，可以提高种子中维生素e的总含量。tglb1986bp来源于玉米胚特异性基因glb1的3’端非转录区，终止转录,引导信息rna聚腺苷酸化。表4cry3bb表达框名称大小功能osact21405bp水稻肌动蛋白基因5’端区域，含有启动子、转录起始点及第一内含子。cry3bb1965bp来源于苏云金芽孢杆菌cry3bb基因，表达cry3bb蛋白质，抗鞘翅目昆虫。thsp17211bp来源于小麦的热激蛋白hsp17的3’端非转录区，终止转录，引导信息rna聚腺苷酸化。表5cp4epsps表达框名称大小功能ubi1994bp玉米泛素蛋白基因5’端区域，含有启动子、转录起始点及第一内含子。zmepsp189bp来源于玉米epsps叶绿体转移肽dna序列，引导cp4epsps蛋白质进入芳香族氨基酸合成场所叶绿体中。cp4epsps1368bp来源于农杆菌cp4菌株，编码合成cp4epsps的dna序列，抗草甘膦。t35s185bp来源于花椰菜花叶病毒35s的3’端非转录区，终止转录，引导信息rna聚腺苷酸化。采用农杆菌介导的转化方法。参照agrobacterium-mediatedtransformationofmaizeembryosusingastandardbinaryvectorsystem.plantphysiology,2002,129:13-22的方法进行。转化起始材料的获得:取授粉9-12天的玉米幼穗，剥离幼胚，置于侵染用液体培养基，用于农杆菌侵染。转化：将含有目的基因的质粒pl8转化入农杆菌eha105菌株，待od600=0.3-0.4时，用侵染液重悬农杆菌，将玉米材料放入侵染液，进行农杆菌侵染。培养基中加入草甘膦作为选择压力，对被转化的材料进行筛选培养，每两周继代一次。经过2-3月的选择培养后，抗性愈伤组织在选择性培养基上生长迅速，颜色新鲜。将抗性愈伤组织转到再生培养基上，得到成熟的胚状体。将胚状体放到ms培养基上生根，得到再生玉米苗。将转化获得的阳性植株经过多代与对照郑58进行回交选育，获得筛选获得bbhtl8-1转基因植株。实施例2bbhtl8-1转化材料中外源基因检测采用全式金公司的“植物基因组dna提取试剂盒”提取bbhtl8-1基因组dna，分别对cry1ab、cry3bb和cp4epsps基因进行特异扩增。引物序列如表6。表6bbhtl8-1转化材料中外源基因检测引物信息pcr（聚合酶链式反应）反应体系如下：2xtsingkemastermix10µlforwardprimer(10µm)0.4µlreverseprimer(10µm)0.4µlddh2o8.2µldna模板1.0µlpcr反应程序如下：94℃3min94℃30s58℃30s35cycles72℃30s72℃10min反应结束后，pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，pcr电泳结果见图2。实施例3bbhtl8-1的旁侧序列分析及特异性pcr检测发明人在前期的实验中对bbhtl8-1回交转育后代进行了连续3代（bc4f1、bc5f1和bc6f1）进行了外源基因pcr检测，pcr结果表明外源基因在转基因植株的后代得到稳定遗传，转基因植株与非转基因植株分离比符合单拷贝基因的孟德尔遗传规律采，为单拷贝插入。发明人利用全基因重测序方法和pcr技术检测了外源目的基因在bbhtl8-1基因组中的整合情况。获得的测序结果结合生物信息学分析，发现外源插入序列整合在玉米染色体上。bbhtl8-1的外源基因插入在玉米基因组chr4:180575645—180577000之间。发明人通过高通量重测序方法和pcr测序方法确定了外源基因在基因组中的整合位置，经pcr测序bbhtl8-1事件的旁侧序列如下，其左旁侧序列如seqidno：1所示，其右旁侧序列如seqidno：2所示。3’端特异性pcr检测的引物对由seqidno：3所示的单链dna分子和seqidno：4所示的单链dna分子组成，扩增的序列如seqidno：5所示。采用全式金公司的“植物基因组dna提取试剂盒”提取bbhtl8-1基因组dna，对插入片段3’端序列进行特异性pcr扩增。扩增引物序列为：bbhtl8-1n:5’-gattagttgagcggtggcaac-3’；（seqidno：3）nosrbfw3:5’-tgattagagtcccgcaattat-3’。（seqidno：4）理论扩增大小为240bp（seqidno：5）。pcr（聚合酶链式反应）反应体系如下：2xtsingkemastermix10µlforwardprimer(10µm)0.4µlreverseprimer(10µm)0.4µlddh2o8.2µldna模板1.0µlpcr反应程序如下：94℃3min94℃30s58℃30s35cycles72℃30s72℃10min反应结束后，pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，pcr电泳结果见图3。实施例4bbhtl8-1外源基因qrt-pcr检测提取玉米bbhtl8-1植株5片叶的幼苗的根、茎、叶，以及成熟期的成熟植株的根、茎、叶以及种子中的rna。rna的提取参照试剂盒svtotalrnaisolationsystem(promega,usa)方法进行、反转录参照试剂盒a3500-reversetranscriptionsystem(promega,usa)方法进行。外源基因qrt-pcr检测用引物见表7。采用sybrpremixextaqtm(codedrr041a,takara)荧光定量试剂盒，pcr仪为appliedbiosystems(http://www.appliedbiosystems.com)prism7500analyzer。bbhtl8-1植株cry1ab、cry3bb、cp4epsps、zmhpt和zmtmt在5叶期和成熟期的表达量见图4。表7bbhtl8-1转化材料中外源基因qrt-pcr引物信息实施例5bbhtl8-1目标蛋白测定方法及其在不同组织的表达量检测采用酶联免疫分析（elisa）方法对bbhtl8-1玉米和非转基因对照玉米地上部整株和籽粒样本中的cry1ab、cry3bb、cp4epsps、zmhpt、zmtmt蛋白的表达水平进行分析检测。分析方法按照envirologix公司试剂盒说明书进行。分别在玉米生长的五叶期、开花期、成熟期取材，包括根、茎、叶、花穗、种子等组织。取植物材料50mg，用液氮研磨成粉末，加300µl蛋白提取buffer，溶解蛋白，12,000rpm离心，取上清200µl，-80℃保存；进一步稀释100倍备用。阳性对照：玉米籽粒干粉分别含有cry1ab30µg/g，cry3bb30µg/g，cp4epsps40µg/g，zmhpt5µg/g，zmtmt5µg/g，。阴性对照为非转基因自交系郑58。elisa操作步骤如下：分别取稀释好的样品50µl加入酶标板进行反应，三次重复；室温下孵育30分钟；移去上清，用washbuffer洗3-4次；分别加50µlcry1ab、cry3bb、cp4epsps、zmhpt、zmtmt等不同蛋白抗体；室温下孵育1小时；移去上清，用washbuffer洗3-4次；加100µl底物，室温下孵育30分钟；加100µl反应终止液；利用酶标仪进行od450光吸收测定；根据测定获得的od450值和标准曲线分别计算cry1ab、cry3bb、cp4epsps、zmhpt和zmtmt蛋白浓度和含量。bbhtl8-1在5叶期、开花期和成熟期转基因材料中cry1ab、cry3bb、cp4epsps、zmhpt和zmtmt蛋白含量见表8-表10。表8bbhtl8-1转基因材料5叶期cry1ab、cry3bb、cp4epsps、zmhpt和zmtmt蛋白含量注：数值为平均值±表示标准差。阴性对照减去背景值后未检出，以“－”表示。表9bbhtl8-1转基因材料开花期cry1ab、cry3bb、cp4epsps、zmhpt和zmtmt蛋白含量注：数值为平均值±表示标准差。阴性对照减去背景值后未检出，以“－”表示。表10bbhtl8-1转基因材料成熟期cry1ab、cry3bb、cp4epsps、zmhpt和zmtmt蛋白含量注：数值为平均值±表示标准差。阴性对照减去背景值后未检出，以“－”表示。实施例6bbhtl8-1田间抗草甘膦试验试验材料：将转基因材料及未转基因的野生型对照材料按照每个材料种6行（3次重复），行长4米，行距为60cm，株距30cm。试验方法：在幼苗3-4叶期和大喇叭口期对pcr阳性的转基因植株，采用不同浓度的草甘膦(41%乳液)进行喷施，使用浓度分别为一般的正常使用浓度（3ml/l）的5倍，对照喷施清水，分别在一周和两周后调查植株死亡率。试验结果：结果表明喷施15ml/l的草甘膦，bbhtl8-1生长不受影响，而对照全部死亡（见附图5）。bbhtl8-1对草甘膦抗性达到正常大田使用浓度的5倍以上，为高抗草甘膦转基因玉米。实施例7bbhtl8-1田间玉米螟抗性试验试验材料：bbhtl8-1及非转基因对照郑58。转基因材料及未转基因的野生型对照材料按照每个材料种6行，行长4米，行间距为60cm，株间距30cm，小区间隔2米。试验方法：幼苗大喇叭口期在每个小区中每株接种刚刚孵化出的玉米螟20-30头，每个小区接种50~60株，生长3周后统计虫害，包括受害叶片上的虫孔大小、数量及分布等。国际玉米螟协作组制定的9级抗虫分级标准为：1~3级：虫孔针刺状（1级：稀少、分散；2级：中等数量；3级：大量）。4~6级：虫孔火柴头大小（4级：稀少、分散；5级：中等数量；6级：大量）。7~9级：虫孔大于火柴头（7级：稀少分散；8级：中等数量；9级：大量）。抗性级别分类：1~2.9级（高抗），3~4.9级（抗虫），5~6.9级（感虫），7~9级（高感）。试验结果：结果表明所有的转基因植株叶片仅有针孔大小的危害，数量少，而绝大部分（>98%）的非转基因对照植株叶片出现大于火柴头的虫孔，数量多，受害严重（见附图6），抗性鉴定结果说明bbhtl8-1对玉米螟的抗性为高抗。实施例8bbhtl8-1籽粒维生素e含量测定zmhpt可以提高植物体内的维生素e总含量，zmtmt可以把低活性的γ-生育酚转化为高活性的α-生育酚。我们采用甲醇/氯仿提取的方法提取维生素e，并用hplc检测bbhtl8-1和非转基因对照中维生素e的含量，方法如下：分别将转基因玉米种子和非转基因对照研磨成粉末，称取100mg，加入600μl甲醇/氯仿（2:1），混匀；加入氯仿200μl，混匀；加入ddh2o，250μl，混匀；10,000rpm，室温，20min；吸取下层氯仿（各样品应等体积）至新的ep管，氮气吹干氯仿；混于100μl无水乙醇，hplc测定维生素e含量。结果表明非转基因对照植株中ve的组分以γ-生育酚的含量为最高，约为4.27mg/100g。而转基因植株中以α-生育酚的含量最高，由对照的平均0.91mg/100g提高到了最高8.21mg/100g，提高了6倍左右；总生育酚也有原来的6.98mg/100g提高到9.09mg/100g，提高了约30%。表11bbhtl8-1转基因植株籽粒维生素e含量测定序列表<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>转基因玉米bbhtl8-1外源插入片段旁侧序列及其应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>680<212>dna<213>玉米(zeamaysl.)<400>1gtcgagtgagacagaatctacttctagttgcataactgagtgaggctcaaaggaacactt60agtcatgaaaatctatatcatatagcaaagatgcttttgaagatcccgacaatattttcg120tctacattattcgccaccgcgtgtaactctttattaactataaaggactttatgcttatt180atattttaattccagacactaatagcaggtaacacgtatgtgattaatactttagataat240ctattaattcggctaaaataccttataatttaggataaattttggatgcttctgtacgga300atatctaagacgcccttcttcatccgcatttgcagttctgtactcatgcacttgtcagtg360tcaaggcttgccaatgttcagccgaaaagaaaaacagctcacggtccacggaaaaaataa420atctgtcgctgggtagcccacgatcgcataaatgaagatggttggcgatcgacatgcagc480ccgccagcggtccgacggaatggatgattggggcatccccacattggttctgtaaaagtg540gctgatcacttatcctttagaggccgttgcctagtttgttaggggaccgagtccgccgca600tttaccagcgcgctgtgcccgcgtagtggccgcgacgcccgcccaaagcagcatgcgtgg660agccatctcctgtatttata680<210>2<211>645<212>dna<213>玉米(zeamaysl.)<400>2atctctcatactctttcatggtatcattcgtctactgatccttccgtctctttcgctgcc60tatcccttcctctcctcgtctatcgtcatgtcagccagctcgagctcgtcgggcaccaat120ccgttcgccgctgctaccgcagtagcgatctcggttgccaccgctcaactaatcaacatc180aagtcccacgttcccgtgatgcttgatctcggcgactccaacttcggcacatggcgcacc240ttcttcctcatcgcgttccgcaagttcagtgtcctcgaccacatcgacctgatgcttgac300gacgccgagtggacgcagatcgatacttgcatcgtctcctggctctacaccacgctctcc360tccgacctcctctccgtcgtcatccagccgaccgacgatgcctacaccacctggaccgcc420atcaccgaccagttcctcgacaacgtcgtgtatcggactgtccaggctcgtcagcagttc480cacgggcttcaccagggggacatgacgatcacgacgtactgcggccagctcaaggtcctg540actgacacgctccgcgacatcggtgctcccgtctctgaccccgacctcgtcgtcagcctc600ctcagcggcctcaacgacaagttcgccaactgcgtcacaaccatc645<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gattagttgagcggtggcaac21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tgattagagtcccgcaattat21<210>5<211>240<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagtggctga60tcacttatctctcatactctttcatggtatcattcgtctactgatccttccgtctctttc120gctgcctatcccttcctctcctcgtctatcgtcatgtcagccagctcgagctcgtcgggc180accaatccgttcgccgctgctaccgcagtagcgatctcggttgccaccgctcaactaatc240当前第1页1 2 3