山梨假丝酵母及其应用的制作方法

本发明属于微生物领域。更具体地说，本发明涉及一种山梨假丝酵母及其应用。
背景技术：
：糖蜜酒精废液是利用糖蜜发酵生产酒精过程中产生的一种浓度较高的有机发酵液。经检测分析，糖蜜酒精废液是一种无毒和可生物降解性液体，纯粹来源于植物，并含有大量可溶性有机质，同时含有n、p、k、ca、mg、s、fe、zn、mn等多种植物所需的营养元素和氨基酸、生长素、维生素等多种生长活性物质，重金属痕量，无毒、无害，主要指标检测结果为生化黄腐酸含量:25％，全氮(n)含量:2％，全磷(p2o5)含量:0.5％，全钾(k2o)含量:6％，氨基酸含量:2％，粗蛋白含量:12％，有机质含量:40％，水份:45％，ph:4.5，水不溶物:1％。糖蜜酒精废液营养成分虽好，但是直接施用于农田，会因废液未完全腐熟而产生恶臭气味，污染环境，此外还会对作物造成烧苗、烂根问题。糖蜜酒精废液的锤度高，一般的微生物在其中无法生长，因此在对其进行发酵制肥时，往往需要对其进行稀释后发酵，使得制备的肥料浓度较低，不利于贮存、运输与使用。技术实现要素：本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本发明还有一个目的是提供一株山梨假丝酵母，其能够在高锤度的糖蜜酒精浓缩液中生长繁殖，并且能发酵糖蜜酒精浓缩液变成优良的肥料。为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一株山梨假丝酵母，所述山梨假丝酵母于2019年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称山梨假丝酵母(candidasorbosivorans)，保藏号cgmccno.18954。优选的是，所述山梨假丝酵母用于发酵高锤度糖蜜酒精浓缩液。优选的是，所述糖蜜酒精浓缩液的锤度为60°bx以上。优选的是，所述山梨假丝酵母用于发酵糖蜜酒精浓缩液制备氨基酸水溶肥。优选的是，利用所述山梨假丝酵母发酵糖蜜酒精浓缩液制备氨基酸水溶肥包括以下操作步骤：步骤一：将所述山梨假丝酵母菌液接种至糖蜜酒精浓缩液中，25-40℃范围内曝气培养24-48小时，获得菌体蛋白；步骤二：静置厌氧发酵48-120小时，使糖蜜酒精浓缩液充分发酵腐熟，得到糖蜜酒精发酵液；步骤三：将糖蜜酒精发酵液ph调节至6.0-8.0之间，温度调节到50-60℃，然后添加1-5‰的中性蛋白酶进行酶解，酶解反应时间8-24小时，酶解反应后，获得所述氨基酸水溶肥。优选的是，使用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或者氨水调节糖蜜酒精发酵液的ph。优选的是，酶解反应结束后添加改性牡蛎壳粉，所述改性牡蛎壳粉的制备包括以下步骤：1)将牡蛎壳用自来水清洗干净，晾干，粉碎成60-80目，获得牡蛎壳粉；2)使用醋酸浸泡步骤1)中的牡蛎壳粉，并在浸泡过程中不断搅动；3)将步骤2)处理后的牡蛎壳粉浸泡在硝酸银溶液中5-10h，期间不断搅动，然后用5-10倍体积的自来水反复浸泡2-3次，晾干后使用短波紫外线进行照射，在照射过程中不断翻动，获得所述改性牡蛎壳粉。本发明至少包括以下有益效果：1、本发明的山梨假丝酵母菌株可在高锤度的糖蜜酒精浓缩液中生长繁殖，经过假丝酵母发酵后，糖蜜酒精浓缩液转变成安全、高效的液体肥料，应用于农业生产，提高农产品品质，增加产量。2、糖蜜酒精浓缩液中含有大量的残糖，残糖对作物生长产生抑制作用，因此，糖蜜浓缩液中的残糖必须消除或者降低含量方可用作为安全的肥料使用，本发明利用可以在高锤度的糖蜜酒精浓缩液中生长繁殖的山梨假丝酵母对浓缩液进行发酵，消除了绝大部分的残糖，同时产生大量的菌体蛋白。3、糖蜜酒精浓缩液中具有少量的氨基酸，作用肥料，可直接被作物吸收利用，但是含量太少，肥效不足，本发明通过接种山梨假丝酵母提高浓缩液的蛋白质含量，再添加蛋白酶将蛋白质水解成氨基酸，提高了浓缩液中氨基酸的含量，提高了肥效。4、牡蛎壳中大部分为碳酸钙和甲壳素，并含有微量的铜等，本申请通过使用醋酸对牡蛎壳粉进行处理，以在牡蛎壳粉中形成多孔结构，添加硝酸银时，银离子与醋酸根在多孔结构中形成微溶于水的醋酸银，使改性后的牡蛎壳粉在后期的使用过程中，能够不断的释放出铜离子和银离子，利用铜离子和银离子的协同作用起到了良好的杀菌效果。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本发明的假丝酵母的平板图。具体实施方式下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。从广西海盈酒精有限责任公司储存罐采集糖蜜酒精浓缩液样品，采用梯度稀释涂布方法，筛选糖蜜酒精浓缩液中的优势菌种，具体方法为：取1毫升浓缩液样品，进行10-1-10-5系列浓度梯度稀释，然后取10-4，10-5梯度的稀释液100ul，涂布于pda平板，于28℃倒置培养2天，然后挑选菌量最多的菌落，在pda平板上划线分离纯化，保藏备用。如图1所示，本发明的山梨假丝酵母(candidasorbosivorans)yn-1的基本生物学特征为：yn-1形态特征：在pda培养基上培养48小时，菌落乳白色，圆形，边缘整齐，中央凸起，表明湿润光滑，无皱褶。显微镜下观察，菌体大多呈近圆形，少数为椭圆形，有假菌丝，1-3个芽殖。yn-1环境适应能力：生长温度范围：4-45℃间可以生长，生长ph范围：ph3.0-8.0范围内可以生长。锤度为65°bx的糖蜜酒精浓缩液中可以生长。生理生化特征：糖发酵试验：可发酵葡萄糖、蔗糖和果糖，不可发酵麦芽糖、乳糖、半乳糖和淀粉。碳源同化试验：可同化葡萄糖、蔗糖、果糖和半乳糖，不可同化乳糖、麦芽糖和淀粉。氮源同化试验：可同化蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵和尿素。菌株分子鉴定：制作假丝酵母yn-1试管斜面，交由广州擎科生物技术有限公司完成测序，所得its序列如序列表seqno.1所示。将序列seqno.1在genebank数据库进行blast比对，结果显示：与已知的山梨假丝酵母its序列的同源性＞99％，可认为是同种内不同菌株的山梨假丝酵母。本发明的假丝酵母经形态特征、生理生化反应和its序列分析，鉴定该菌株为假丝酵母的一个新菌株，命名为山梨假丝酵母yn-1。本发明的山梨假丝酵母已于2019年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏名称山梨假丝酵母(candidasorbosivorans)，保藏号cgmccno.18954。实施例1一种利用山梨假丝酵母制备氨基酸水溶肥的方法，包括以下步骤：1)取出冷冻保藏的假丝酵母原种，在pda培养基上划线分离出单菌落，挑取单菌落接种于液体培养基中进行活化培养，取活化后的种子液转接至新的液体培养基中，进行扩大培养，得到假丝酵母菌液；2)将假丝酵母菌菌液接种至糖蜜酒精浓缩液，曝气培养，再静置发酵，获得所述肥料。通过山梨假丝酵母在发酵过程中，去除糖蜜酒精浓缩液中的残糖，使所制备的肥料对作物具有更好的促生长作用。实施例2一种利用山梨假丝酵母制备氨基酸水溶肥的方法，包括以下步骤：1)取出冷冻保藏的假丝酵母原种，在pda培养基上划线分离出单菌落，挑取单菌落接种于液体培养基中进行活化培养，取活化后的种子液转接至新的液体培养基中，进行扩大培养，得到假丝酵母菌液，其中，pda培养基配方为：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂18g/l；液体培养基配方为：糖蜜80g/l，玉米浆20g/l；2)将假丝酵母菌菌液接种至糖蜜酒精浓缩液，曝气培养，再静置发酵，获得所述肥料。实施例3一种利用山梨假丝酵母制备氨基酸水溶肥的方法，包括以下步骤：1)取出冷冻保藏的假丝酵母原种，在pda培养基上划线分离出单菌落，挑取单菌落接种于液体培养基中进行活化培养，取活化后的种子液转接至新的液体培养基中，进行扩大培养，得到假丝酵母菌液；2)将假丝酵母菌菌液接种至糖蜜酒精浓缩液，先曝气培养，再静置发酵，然后进行酶解反应，获得糖蜜酒精浓缩液发酵肥料，其中，所述山梨假丝酵母在发酵过程中提升氨基酸含量的方法包括以下步骤：步骤一：将假丝酵母菌液接种至糖蜜酒精浓缩液中，30℃曝气培养48小时，山梨假丝酵母利用糖蜜酒精浓缩液中的残糖等营养成分进行生长繁殖，合成菌体蛋白；步骤二：曝气培养后，静置厌氧发酵120小时，使糖蜜酒精浓缩液充分发酵腐熟，得到糖蜜酒精发酵液；步骤三：添加碱性材料—氢氧化钠，将糖蜜酒精发酵液ph调节至7.0，温度调节到60℃，然后添加5‰的中性蛋白酶进行酶解，酶解反应时间8小时。酶解反应后，菌体蛋白被水解成氨基酸，即得到所述富含氨基酸的液体肥。实施例4一种利用所述山梨假丝酵母制备氨基酸水溶肥，包括以下操作步骤：步骤一：将所述山梨假丝酵母菌液接种至糖蜜酒精浓缩液中，35℃曝气培养24小时，获得菌体蛋白；步骤二：静置厌氧发酵120小时，使糖蜜酒精浓缩液充分发酵腐熟，得到糖蜜酒精发酵液；步骤三：将糖蜜酒精发酵液ph调节至7.0，温度调节到55℃，然后添加3‰的中性蛋白酶进行酶解，酶解反应时间20小时，获得所述氨基酸水溶肥。实施例5一种利用所述山梨假丝酵母制备氨基酸水溶肥，包括以下操作步骤：步骤一：将所述山梨假丝酵母菌液接种至糖蜜酒精浓缩液中，25℃曝气培养48小时，获得菌体蛋白；步骤二：静置厌氧发酵80小时，使糖蜜酒精浓缩液充分发酵腐熟，得到糖蜜酒精发酵液；步骤三：使用氢氧化钙将糖蜜酒精发酵液ph调节至6.0，温度调节到50℃，然后添加1‰的中性蛋白酶进行酶解，酶解反应时间14小时，酶解反应后，菌体蛋白被水解成氨基酸，获得所述氨基酸水溶肥。实施例6一种利用所述山梨假丝酵母制备氨基酸水溶肥，包括以下操作步骤：步骤一：将所述山梨假丝酵母菌液接种至糖蜜酒精浓缩液中，25℃曝气培养48小时，获得菌体蛋白；步骤二：静置厌氧发酵80小时，使糖蜜酒精浓缩液充分发酵腐熟，得到糖蜜酒精发酵液；步骤三：使用氢氧化钙将糖蜜酒精发酵液ph调节至6.0之间，温度调节到50℃，然后添加1‰的中性蛋白酶进行酶解，酶解反应时间14小时，酶解反应后，菌体蛋白被水解成氨基酸，获得所述氨基酸水溶肥；其中，酶解反应结束后添加改性牡蛎壳粉，所述改性牡蛎壳粉的制备包括以下步骤：1)将牡蛎壳用自来水清洗干净，晾干，粉碎成60目，获得牡蛎壳粉；2)使用醋酸浸泡步骤1)中的牡蛎壳粉，并在浸泡过程中不断搅动；3)将步骤2)处理后的牡蛎壳粉浸泡在硝酸银溶液中5h，期间不断搅动，然后用5倍体积的自来水反复浸泡2次，晾干后使用短波紫外线进行照射，在照射过程中不断翻动，获得所述改性牡蛎壳粉。试验一、糖蜜酒精浓缩液发酵液成分对比试验将锤度为65°bx的糖蜜酒精浓缩液500毫升均分为a、b两等分，a组添加浓缩液体积比为1％的yn-1酵母灭活菌液，b组添加浓缩液体积比为1％的yn-1酵母菌液。28℃，180转/分，摇床培养1天，静置2天后，检测各指标，试验重复三次，结果如表1所示。表1发酵液成分分析表a组b组水分，％49.1353.23ph4.104.65锤度，°bx58.854.3有机质，％40.5837.69腐殖酸，％23.9426.34氨基酸，％2.062.85粗蛋白，％12.3412.25总糖，％9.956.66碱解氮，％1.601.68有效磷，％0.150.16速效钾5.565.69酵母菌量，亿/ml00.62从表1可以看出。经过假丝酵母yn-1发酵处理的浓缩液，水分、ph腐殖酸、氨基酸、粗蛋白等指标有所提升，而锤度、有机质、总糖等指标均有所降低。这是因为假丝酵母yn-1在浓缩液中生长繁殖，消耗了浓缩液中的糖分，同时产生菌体蛋白，部分蛋白质降解，转变成氨基酸，另外，酵母利用含碳物质进行代谢，产生水分，导致有机质被消耗降低，而水分增加，锤度随之降低。试验二、浓缩液发芽率测试将锤度为65°bx的糖蜜酒精浓缩液500毫升均分为a、b两等分，a组添加浓缩液体积比为1％的yn-1酵母灭活菌液，b组添加浓缩液体积比为1％的yn-1酵母菌液。28℃，180转/分，摇床培养1天，静置2天后，获得发酵液，分别将发酵液进行稀释后以萝卜种子作为供试对象，进行发芽率测试。试验重复3次，结果如表2所示。表2浓缩液发芽率测试结果从表2结果可知，用未经发酵处理的浓缩液稀释50倍进行发芽率测试，萝卜种子发芽率为0，而经假丝酵母yn-1处理的浓缩液，稀释50倍，发芽率接近100％。稀释100倍使用，可以促进萝卜根系的生长。由此可以得出，经假丝酵母yn-1处理的浓缩液，可以安全作为肥料施用，促进根系生长。试验三、制备氨基酸水溶肥试验将锤度为65％的糖蜜酒精浓缩液均分为c、d、e、f四等分，c组添加浓缩液体积比为1％的yn-1酵母灭活菌液，d组添加浓缩液体积比为1％的酿酒酵母(酒精厂用菌株)菌液，e组添加浓缩液体积比为1％的热带假丝酵母(bncc119734)菌液，f组添加浓缩液体积比为1％的山梨假丝酵母yn-1菌液，28℃，180转/分，摇床培养1天，静置2天得到发酵液，c、d、e、f组发酵液再均分为二等分，分别记为g、h、i、j组，添加氢氧化钠，将发酵液ph调节至7.0，温度调节到50℃，然后添加1‰的中性蛋白酶进行酶解，酶解反应时间12小时后，检测各组分粗蛋白及氨基酸的含量，结果如表3所示。表3浓缩液氨基酸含量分析表编号处理游离氨基酸，％粗蛋白，％c灭活yn-12.1012.61d酿酒酵母2.1512.58e热带假丝酵母2.1912.75fyn-12.8812.66g灭活yn-1+酶解2.1612.69h酿酒酵母+酶解2.2012.76i热带假丝酵母+酶解2.1912.60jyn-1+酶解10.1212.72粗蛋白用凯氏定氮法测出总氮量，再乘以6.25得出。实际上，这个值既包括真蛋白又包含非蛋白含氮化合物，后者包括游离氨基酸、嘌呤、嘧啶、尿素、硝酸盐和氨等。本试验各个处理粗蛋白含量检测分析结果差异不大，但用本发明的山梨假丝酵母发酵处理的糖蜜酒精浓缩液，经中性蛋白酶水解之后氨基酸含量有大幅提升，说明本发明的热带假丝酵母能够利用浓缩液中的营养成分合成蛋白质，添加中性蛋白酶可将蛋白质水解成氨基酸，从而提高浓缩液中氨基酸的含量，可以用于制备氨基酸水溶肥。试验四、不同酵母对发酵液对萝卜萌发率的影响将锤度为65°bx的糖蜜酒精浓缩液600毫升均分为k、l、m三等分，k组添加浓缩液体积比为1％的yn-1酵母灭活菌液，l组添加浓缩液体积比为1％的yn-1酵母菌液，m组添加浓缩液体积比为1％的热带假丝酵母(bncc119734)菌液。28℃，180转/分，摇床培养1天，静置2天后，添加中性蛋白酶进行酶解，分别获得发酵液k、l、m。分别将发酵液进行梯度稀释后以萝卜种子作为供试对象，进行发芽率测试。试验重复3次，结果如表4所示。表4不同发酵液对萝卜发芽率的影响从表4结果可知，用热带假丝酵母发酵处理的浓缩液稀释50倍进行发芽率测试，萝卜种子发芽率为5％，而经假丝酵母yn-1处理的浓缩液，稀释50倍，发芽率接近100％。试验五、生菜盆栽试验将锤度为65°bx的糖蜜酒精浓缩液600毫升均分为k、l、m三等分，k组添加浓缩液体积比为1％的yn-1酵母灭活菌液，l组添加浓缩液体积比为1％的yn-1酵母菌液，m组添加浓缩液体积比为1％的热带假丝酵母(bncc119734)菌液。28℃，180转/分，摇床培养1天，静置2天后，添加中性蛋白酶进行酶解，分别获得发酵液k、l、m。试验设置3个处理3次重复，每个试验小区面积为0.8平方米n组：使用发酵液k处理。o组：使用发酵液l处理。p组：使用发酵液m处理。试验方法选择菜园土，过筛，除去杂质及大颗粒，备用；添加泥土重量1.5％的有机肥，搅拌混匀；将泥土分为n、o、p三等分，用作种植土；将泥土在室内平铺。厚度约为10cm，移栽生菜苗，淋足定根水。生菜移栽后每隔10天分别使用发酵液k、l、m样品稀释100倍后进行叶面喷施，总共施用三次。结束，按照每个小区单收、单打、单计产的原则进行采收计产，结果如表5所示。表5生菜室内盆栽产量统计表单位：千克由表5结果可知，施用热带假丝酵母处理的发酵液m，生菜产量与对照组发酵液l差别不大，而施用发酵液l比发酵液k增产1.03千克，增产率28.1％。山梨假丝酵母yn-1发酵的浓缩液对生菜增产效果极为显著。试验六、抗病菌试验肥料一：将实施例6制备的氨基酸水溶肥。肥料二：实施例6制备的氨基酸水溶肥，但不添加改性牡蛎壳粉。试验方法选择一块菜园，均分为两块，并种上萝卜，分别叶片喷施稀释100倍后的肥料一和肥料二，统计萝卜产量以及病害发生率，结果如表6所示。表6产量(kg)病害发生率(％)肥料一48964.6肥料二396612.1从表6结果可知，在复合酶解液中添加改性牡蛎壳粉，具有减少病害发生率的作用。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。<110>广西金穗生态科技股份有限公司<120>山梨假丝酵母及其应用<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>426<212>dna<213>candidasorbosivorans<400>1gggtgctgacggtagtccgcgaggcagtatgcacgcaggcaatgccgaggcggcctgcgcttttgtcctgcccgcaaacgtccggttcaatcgcacctcattgccttccatttcaacaatttcacgtactttttcactctcttttcaaagttcttttcatctttccttcacagtacttgttcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagatggagcataccacccacttagagctgcattcccaaacaactcgactcgtcgacccggatttacggtggctgctgctacggggctgtcaccctccatggcgctccgttccagaagacttggccagcgtgccaaatccaggtctccagattacaatcccgagggtttcaaatctgagcttttgcctgttcattcgccattactagggcaatcc426当前第1页12