本发明属于水产品加工技术领域，具体涉及一种三文鱼内脏鱼油的制备方法。
背景技术：
三文鱼作为水中珍品，营养价值很高，含有丰富的优质蛋白质、维生素d和n－3不饱和脂肪酸，其中，鱼油中不饱和脂肪酸含量达到60%以上，临床研究证实，n－3型多不饱和脂肪酸具有促进大脑发育、降低患心血管疾病的风险、抗炎抗肿瘤等生理作用。
三文鱼在我国消费量日益剧增，国内已形成规模养殖，因三文鱼宰杀过程中产生的大量内脏下脚料中含有丰富的油脂，可作为优质鱼油的生产原料，但是鉴于三文鱼个体较大，其鱼肝、鱼肠等内脏自然较其他常见鱼类大许多，宰杀之后，肝脏中会残留大量污血，尤其鱼肝中虽然含有大量油脂但是色泽深，会严重影响鱼油的外观及色泽，较粗的肠道中也会存留大量粪便、微生物等，如果油脂提取过程得不到有效控制，将导致提取的内脏粗鱼油油体浑浊，腥味明显，色泽土黄、不清透，严重影响鱼油品质，限制了其应用广度，并且也增大了后续鱼油精制的难度。又三文鱼内脏具有较强的自溶现象，其鱼肝中含有丰富的内源酶（主要为内源蛋白酶）若处理不及时或者处理不当，不但影响鱼油的提取效果，而且会造成资源浪费，同时引起环境污染问题。因此，如何针对三文鱼内脏独特的特性，提取感官性状优良且风味较好的内脏鱼油是一个急需解决的技术问题。
目前内脏粗鱼油提取主要采用酶解技术，虽然提取条件温和，对鱼油的活性成分破坏较小，但如果控制不好油脂的析出与油脂发生乳化作用的相对速度，不仅会降低油脂的提取率，还会因为油脂的乳化作用，导致内脏组织中的色素、腥味、不良风味的小分子物质被油脂包埋，影响鱼油品质。
技术实现要素：
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种三文鱼内脏鱼油的制备方法，通过该方法可显著缩短鱼油提取时间，明显提高鱼油提取率，同时制备的内脏粗鱼油色泽橙黄明亮清透、基本无腥味无异味，品质得到显著改善，提高了内脏鱼油的可接受度同时扩大了其应用途径，改善了其加工适用性。并且，本方法可有效降低鱼油提取过程中的酸败程度，具有意想不到的技术效果。
具体技术方案如下：
一种三文鱼内脏鱼油的制备方法，包括原料预处理、一段酶解、二段酶解；
所述的一段酶解主要为脂肪酶酶解，同时辅助增强自溶酶酶解进程，该过程中添加氯化钙。
所述的二段酶解为蛋白酶酶解。
本发明采用分段酶解的技术手段进行三文鱼内脏粗鱼油的提取，突破了常规酶法提取鱼油的固有模式，一段酶解中使用脂肪酶与三文鱼内脏中的自溶酶联合作用，酶解一段时间后灭酶，将上层鱼油分离后，使用蛋白酶单独对组织体系进行酶解，再次分离上层鱼油。整个过程采用联动、快速、彻底的提取方式，有效克服富含油脂的内脏鱼油提取不彻底、品质差的技术问题。
本领域对鱼油的酶法提取通常仅使用蛋白酶，使蛋白组织崩解释放鱼油。然而，将其应用到三文鱼内脏提取时，反应条件较难控制，并且在酶解一定时间后产生严重的乳化，使本来已析出的鱼油在短时间内大量与蛋白糜、蛋白液结合，使鱼油难以达到理想的产率。如果乳化后加大酶使用量，继续进行长时间酶解，使蛋白组织大部分酶解成小肽，乳化体系被破坏，被乳化的鱼油可部分析出，但是鱼油整体颜色深暗，呈深褐色，为后续加工带来很大困难，也难以作为药用、高端食品用多不饱和脂肪酸来源。如在乳化发生前停止酶解，则鱼油得率很低。
在本领域通常认为脂肪酶有利于乳化的进行，因此常使用脂肪酶作为乳化剂；然而在三文鱼内脏油的制备实验中发现，在三文鱼内脏油制备的前期使用脂肪酶，能与内脏中含有的自溶酶配合，加速内脏组织的崩解，快速释放相当一部分油脂，此部分油脂色泽较浅而明亮，呈亮橙色，与以三文鱼肉为原料提取的鱼油颜色类似。需要注意的是，在乳化速度超过油脂析出速度前及时灭酶中止反应是必要的，可保证较高的提取率和优良的感官性状。脂肪酶反应终止后将鱼油分离，添加蛋白酶对剩余组织液进行酶解，促进组织中油脂的充分释放，可获得二段酶解析出鱼油。
经本发明实验证实，本方法可以在相对较短提取时间内明显提高三文鱼内脏鱼油产率，明显优于传统蛋白酶法。同时，由于缩短鱼油提取时间，可有效降低鱼油在提取过程中的氧化酸败程度，降低了油脂对体系中色素、杂质等的包埋和溶解作用，显著改善了鱼油的感官性状和品质。
优选的，所述的一段酶解的工作条件为：
将经过预处理的内脏组织与水按照质量比1:0.5～1:2混合，加入以水添加质量计的1.0wt%～1.3wt%的氯化钙，脂肪酶添加量为以反应体系质量计100～160u/g，酶解温度为40～55℃，ph7.0～8.5，酶解1～2h后灭酶，冷却至25℃之下后离心分离，获取上层粗鱼油。
灭酶方法可采用90～95℃水浴加热5～10min。
一段酶解为脂肪酶与内脏自身的自溶酶共同作用。酶解时间的限定是重要的，防止乳化作用超过油脂析出速度，出现明显的乳化现象。酶解后的灭酶是必要的，同样为了防止过度乳化的出现。
一段酶解过程中可进行搅拌，一定转速范围内的搅拌对反应有利，但过快的转速造成乳化加快。优选转速60～100r/min搅拌。
优选的，所述的二段酶解的工作条件为：
将一段酶解粗鱼油分离后剩余的体系中添加蛋白酶，蛋白酶添加量为以剩余的体系的质量计1500～2500u/g，酶解温度为45～55℃，ph7.0～8.0，酶解1～2h后冷却至25℃以下，离心分离，获取上层粗鱼油。
进一步优选，所述蛋白酶为动物蛋白酶。
二段酶解过程中可进行搅拌，搅拌转速优选在100r/min之下。可在二段酶解过程中搅拌20～30min后停止搅拌。
优选的，所述原料预处理的工作条件为：去除胆囊、鱼鳔和粪便。
具体为将新鲜内脏或解冻后的内脏去除胆囊及鱼鳔，将肠道中的粪便挤出。
可将组织破碎成1～3cm的小块，但不宜绞成糜烂状。
需要注意的的，不宜对内脏进行清洗，清洗会导致产率的降低。
本发明具备如下有益效果：
本发明采用分段酶解的技术手段进行三文鱼内脏粗鱼油的提取，突破了常规酶法提取鱼油的固有模式，一段酶解中使用脂肪酶与三文鱼内脏中的自溶酶联合作用，加速内脏组织的崩解，同时快速释放大部分油脂，然后再利用蛋白酶对内脏组织进行进一步的破坏。促进组织中油脂的充分释放。通过上述技术方案的实施，可明显提高三文鱼内脏鱼油的提取率，同时由于缩短鱼油提取时间，可有效降低鱼油在提取过程中的氧化酸败程度，降低了油脂对体系中色素、杂质等的包埋作用，显著改善了鱼油的感官性状和品质。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
下述实施例中使用的脂肪酶购买自南宁庞博生物工程有限公司，活力单位为1×105u/g，动物蛋白酶购买自南宁庞博生物工程有限公司，活力单位为1×105u/g。
实施例1
一种三文鱼内脏鱼油的制备方法，步骤如下：
（1）原料预处理：取二副新鲜三文鱼内脏约2kg去除胆囊及鱼鳔，挤出鱼肠中粪便，将其剪1～3cm小块，称重为1.82kg，待用。
（2）一段酶解：将步骤（1）获得的内脏组织与水按照质量比1:0.5混合，加入以水添加质量计的1.0wt%的氯化钙，脂肪酶添加量为以反应体系质量计100u/g，酶解温度为40℃，ph7.0条件下静置酶解2h后90℃加热10min灭酶，冷却至25℃之下后，6000r/min离心15min，收集上层粗鱼油。
（3）二段酶解：将步骤（2）收集鱼油后剩余的反应体系进行蛋白酶解。向反应体系中添加动物蛋白酶，添加量为以剩余的反应体系计1500u/g，酶解温度为45℃，ph7.0条件下静置酶解1h后，冰浴，20min内冷却至25℃以下，6000r/min离心15min，收集上层粗鱼油。
（4）将步骤（2）与步骤（3）获得的粗鱼油合并。
实施例2
一种三文鱼内脏鱼油的制备方法，步骤如下：
（1）原料预处理：取冷冻三文鱼内脏1.5kg，解冻，去除胆囊及鱼鳔，挤出鱼肠中粪便，称重为1.3kg，待用。
（2）一段酶解：将步骤（1）获得的内脏组织与水按照质量比1:2混合，加入以水添加质量计的1.3wt%的氯化钙，脂肪酶添加量为以反应体系质量计160u/g，酶解温度为55℃，ph8.5条件下酶解1h,酶解过程中持续搅拌，搅拌的转速为80r/min；酶解结束后95℃加热5min灭酶，冷却至25℃之下后，6000r/min离心15min，收集上层粗鱼油。
（3）二段酶解：将步骤（2）收集鱼油后剩余的反应体系进行蛋白酶解。向反应体系中添加动物蛋白酶，添加量为以剩余的反应体系计2500u/g，酶解温度为55℃，ph8.0条件下静置酶解1.5h，冰浴，20min内冷却至25℃以下，6000r/min离心15min，收集上层粗鱼油。
（4）将步骤（2）与步骤（3）获得的粗鱼油合并。
实施例3
一种三文鱼内脏鱼油的制备方法，步骤如下：
（1）原料预处理：取冷冻三文鱼内脏1.5kg，解冻，去除胆囊及鱼鳔，挤出鱼肠中粪便，称重为1.25kg，待用。
（2）一段酶解：将步骤（1）获得的内脏组织与水按照质量比1:2混合，加入以水添加质量计的1.2wt%的氯化钙，脂肪酶添加量为以反应体系质量计160u/g，酶解温度为55℃，ph8.5条件下酶解1h,酶解过程中持续搅拌，搅拌的转速为100r/min；酶解结束后95℃加热5min灭酶，20min内冷却至25℃之下后，6000r/min离心15min，收集上层粗鱼油。
（3）二段酶解：将步骤（2）收集鱼油后剩余的反应体系进行蛋白酶解。向反应体系中添加动物蛋白酶，添加量为以以剩余的反应体系计2000u/g，酶解温度为50℃，ph7.5条件下酶解2h，酶解前20min持续搅拌，搅拌的转速为60r/min，酶解20min后停止搅拌；酶解结束后冰浴，20min内冷却至25℃以下，6000r/min离心15min，收集上层粗鱼油。
（4）将步骤（2）与步骤（3）获得的粗鱼油合并。
实施例4
一种三文鱼内脏鱼油的制备方法，步骤如下：
（1）原料预处理：取冷冻三文鱼内脏2.3kg，解冻，去除胆囊及鱼鳔，挤出鱼肠中粪便，称重为1.93kg，待用。
（2）一段酶解：将步骤（1）获得的内脏组织与水按照质量比1:1混合，加入以水添加质量计的1.3wt%的氯化钙，脂肪酶添加量为以反应体系质量计120u/g，酶解温度为50℃，ph7.5条件下酶解1.5h,酶解过程中持续搅拌，搅拌的转速为60r/min；酶解结束后95℃加热5min灭酶，冷却至25℃之下后，6000r/min离心15min，收集上层粗鱼油。此时，计算得鱼油产率为23.8%。
（3）二段酶解：将步骤（2）收集鱼油后剩余的反应体系进行蛋白酶解。向反应体系中添加动物蛋白酶，添加量为以剩余的反应体系计2000u/g，酶解温度为50℃，ph7.5条件下静置酶解1.5h，酶解结束后冰浴，20min内冷却至25℃以下，6000r/min离心15min，收集上层粗鱼油。
（4）将步骤（2）与步骤（3）获得的粗鱼油合并。
实验例1
实验例1的工作条件参照实施例4，唯一区别在于一段酶解中未添加脂肪酶。
实验例2
实验例2的工作条件参照实施例4，唯一区别在于一段酶解中未灭酶，二段酶解不添加动物蛋白酶，仍然进行脂肪酶酶解。
实验例3
实验例3的工作条件参照实施例4，区别在于不进行一段酶解，直接进行二段酶解，酶解过程静置进行。
实验例4
实验例4的工作条件参照实验例3，区别在于酶解3h，相当于实施例4的酶解总时长。
实验例5
实验例5的工作条件参照实验例4，区别在于酶解过程中持续搅拌，转速100r/min。实验例5的方法相当于现有技术中常用的鱼油酶法制备方法。（除转速外，实验例5的技术方案与现有技术基本相同，现有技术中的转速一般在200r/min以上。）
实验例6
实验例6的工作条件参照实验例5，区别在于酶解时间为6h。
注：实验例1～6的原料使用量均为1.5～2.5kg。
实验1实施例4与实验例1～6的鱼油产率对比实验
计算实施例4与实施例1～6最终获得的鱼油的产率，结果见表1，计算公式如下：
表1鱼油产率对比表
从表1可见，本发明能有效提高鱼油的产率，明显优于自溶酶法、蛋白酶法。过量的脂肪酶是不利的，可能增进体系的乳化，妨碍油脂的析出。
需要注意的是蛋白酶法（实验例6）将反应时间延长至6h，产率反而下降，其原因推定为随着时间的延长，析出作用减缓，乳化作用活跃，最终乳化作用的速度超过析出速度，使产率倒退。如果继续延长酶解时间，随着体系中蛋白质分子量进一步降低，乳化作用将发生衰退，油脂再次析出，但是此时已反应18小时以上，油脂色泽呈黑褐色，气味恶劣，酸值和过氧化值也达不到国家要求。
实验2实施例4与实验例4～6最终获得的鱼油的酸值与过氧化值对比
通过gb/t5530—2005，热乙醇测定法测定实施例4与实验例4～6最终获得的鱼油的酸值，通过gb/t5538—2005，硫代硫酸钠滴定法测定实施例4与实验例4～6最终获得的鱼油的过氧化值，评价专利方法与常规酶法提取内脏鱼油过程中对鱼油品质（酸败程度）的影响。
结果见表2。
表2鱼油酸值、过氧化值对比表
由表2可见，在同样的反应时间条件下，本发明相比比蛋白酶法获得更低的酸值和过氧化值，能一定程度上抑制油脂在提取过程中的酸败。实验例6反应时间为6h，酸败程度较为严重。
实验3实施例4与实验例4～6最终获得的鱼油的感官性状对比
通过感官评价得分进行内脏粗鱼油的品质鉴定。随机选取15名专业技术人员与15名非专业技术人员分别对实施例4与实验例4～6最终获得的鱼油的气味和外观进行评分，将两组分数叠加计算平均分，取两位有效数字获得感官得分。评分标准见表3，评分标准的制定参考
粗鱼油的分级标准sc/t3502—2016见表4，评分结果见表5。
表4粗鱼油的分级标准表
表5感官评价得分表
由表5可见，本发明实施例4的气味、外观均优于各实验例，其色泽为明亮的浅橘黄色，透明度佳，无酸败气味；单使用蛋白酶的实验例4色泽尚可，但质地浑浊、透明度较差，且出现酸败气味；实验例5在实验例4的基础上增加了搅拌，虽然油脂得率得到提高，但是气味、外观进一步劣化；实验例6提取时间较长，小分子色素、风味不良物质大量从蛋白组织中释放并溶入油脂，色泽晦暗浑浊，酸败气味突出。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。