一种具有抗耐药性的抗菌脒类低聚物及其制作方法和用途与流程

本发明涉及医药化工领域，更具体地说涉及一种具有抗耐药性的抗菌脒类低聚物及其制作方法和用途。

背景技术：

抗生素的耐药性问题已经逐渐成为人类医疗保健的新威胁。近来我们确立了抗耐药性抗菌药这一概念，旨在通过降低耐药性的产生速率来应对这一巨大的威胁。

具有抗耐药性的抗菌剂应具有以下特征：1)在药物治疗过程中产生细菌对其产生抗药性的速率较低；2)对具有多药耐药性的病原体有良好的杀灭效果。众所周知，抗生素耐药性产生的根本原因是其靶标发生突变，从而使各种不同作用机理的药物失效。因此，如果一种药物可以靶向于多个靶标，或者其靶标涉及复杂的生物过程，那么产生耐药性的概率将大大降低。抗菌聚合物这个类型的化合物符合抗耐药性这一概念。抗菌聚合物主要的作用机理是破坏细胞膜，而细胞膜的生物合成涉及复杂的生物过程，因此其既具有低耐药性产生速率又具有抗多药耐药性细菌的特性，符合抗耐药性的抗菌剂的要求。然而，细菌细胞膜和哺乳动物细胞膜结构的相似性使抗菌聚合物具有较高的细胞毒性和溶血活性，导致其副作用较大。因此，到目前为止尚无fda批准的抗菌聚合物用于治疗细菌感染治疗。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明公开了一种具有抗耐药性的抗菌脒类低聚物及其制作方法和用途。本发明公开的结构具有破坏细胞膜和结合染色体dna双重抗菌机制，具有快速杀菌和抗耐药性的特征，呈现出抗菌广谱性。除此以外，该结构利用细菌无细胞核而细菌有细胞核的区别，特异性靶向细菌的dna，显著地降低了其细胞毒性，提高了其治疗指数。

为达到上述技术效果，本发明的技术方案是：

一种具有抗耐药性的抗菌脒类低聚物，所述脒类低聚物的分子式如下所示：

其中5≤n≤8；

其中r的分子式包括式(ⅰ)、式(ⅱ)、式(ⅲ)、式(ⅳ)、式(ⅴ)、式(ⅵ)、式(ⅶ)和式(ⅷ)中的一种或任意几种；

进一步的改进，所述脒类低聚物的分子式中r如式(ⅳ)所示。

一种具有抗耐药性的抗菌脒类低聚物的制作方法，包括如下步骤：称取对苯二甲酸二亚氨酸酯盐酸盐、h2n-r-nh2和无水n,n-二甲基甲酰胺dmf混合均匀，加入三乙胺tea，在惰性气体保护下30℃-40℃搅拌84-96h得到混合物，将混合物的ph调节至1～2，然后截留得到分子量为＞1.5kda物质，冷冻干燥后即制得脒类低聚物；

其中r如式(ⅰ)、式(ⅱ)式(ⅲ)、式(ⅳ)、式(ⅴ)、式(ⅵ)、式(ⅶ)或式(ⅷ)所示；

进一步的改进，包括如下步骤：

称取对苯二甲酸二亚氨酸酯盐酸盐、1，4-双(3-氨基丙基)哌嗪，然后加入和无水n,n-二甲基甲酰胺dmf混合均匀，加入三乙胺tea，在惰性气体保护下30℃-40℃搅拌84-96h得到混合物，将混合物的ph调节至1-2，然后截留得到分子量为＞1.5kda物质，冷冻干燥后即制得脒类低聚物；其中苯二甲酸二亚氨酸酯盐酸盐、1，4-双(3-氨基丙基)哌嗪、tea的摩尔比为1：1：4。

进一步的改进，所述对苯二甲酸二亚氨酸酯盐酸盐包括对苯二甲酸二亚氨酸酯盐酸铁、对苯二甲酸二亚氨酸酯盐酸铝和对苯二甲酸二亚氨酸酯盐酸锂中的一种或任意混合。

上述具有抗耐药性的抗菌脒类低聚物的用途，所述脒类低聚物用于作为抗菌剂。

进一步的改进，所述脒类低聚物用于抗菌，所述脒类低聚物的抗菌种类包括枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌。

附图说明

图1为本发明的反应示意图；

图2为流式实验证明pbam-4具有较强的破膜能力图；

图3为sem图像：表明pbam-4处理过的大肠杆菌和鲍曼不动杆菌细胞膜表面都出现了不同程度的皱缩；

图4为pbam-4具有结合细菌基因组dna的能力图，50μg/ml的pbam-4和不同浓度的大肠杆菌的基因组dna(0.05pmol/ml和0.25pmol/ml)孵育之后，粒径有明显的增大；

图5为外加dna对化合物抗菌活性的影响。

图6为fitc标记的pbam-4在枯草芽孢杆菌(上)和大肠杆菌(下)中的分布图；pbam-4主要分布在细菌细胞的细胞膜和细胞核；

图7为罗丹明标记的pbam-4在nih/3t3细胞中的分布图；pbam-4主要分布在哺乳动物细胞的细胞质里边；

图8为分别用卡那霉素和pbam-4的次最小抑菌浓度处理大肠杆菌576代之后，比较其耐药性产生的速率图；

图9a正常的nih/3t3细胞显微镜图；

图9b1.24×10⁹cfu/ml的细菌感染nih/3t3细胞显微镜图，细胞被快速增殖的细菌杀死；

图9c10μg/ml的pbam-4处理细菌感染nih/3t3细胞的显微镜图，证明pbam-4可以有效地杀死共培养模型中的细菌，达到拯救细胞的效果；

图9d10μg/ml的pbam-4处理细菌感染nih/3t3细胞的显微镜图，说明其不会对细胞的形态造成影响，具有良好的生物相容性；

图10细菌与红细胞共培养模型。pbam-4相较于小分子抗生素而言可以有效地拯救与细菌共培养的红细胞，并不产生明显的溶血效应；

图11为运用菌感染线虫的模型来评估pbam-4的活体内抗菌活性图，相较于在体外对这些菌有较好效果的抗生素而言(庆大霉素，环丙沙星和氨苄)，pbam-4可以高效地完全杀灭线虫感染的这三种多药耐药菌株(铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌和金黄的葡萄球菌)；

图12a为pbam-4在小鼠表皮感染模型中的抗菌活性研究图；

图12b为pbam-4可以提高感染小鼠的存活率图，数据用student'st-test方法分析，统计学显著差异用星号表示,*p<0.05；

图12c为pbam-4和对照组pbs和环丙沙星组相比可以高效地完全杀灭老鼠感染部位的细菌图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式并且结合附图对本发明的技术方案作具体说明，下述实施例中的部件或设备如无特别说明，均为通用标准件或本领域技术人员知晓的部件，其结构和原理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知。

实施例1

经试验，本发明研发出8中具有广谱抗菌性的抗菌脒类低聚物，其化学式如下所示:

其中5≤n≤8；

其中r的分子式如式(ⅰ)、式(ⅱ)、式(ⅲ)、式(ⅳ)、式(ⅴ)、式(ⅵ)、式(ⅶ)或式(ⅷ)所示；

为方便记录，r的分子式为式(ⅰ)、式(ⅱ)、式(ⅲ)、式(ⅳ)、式(ⅴ)、式(ⅵ)、式(ⅶ)和式(ⅷ)时的化合物分别编号为pbam-1、pbam-2、pbam-3、pbam-4、pbam-5、pbam-6、pbam-7、pbam-8。8种化合物的抗菌特性如表1和表2所示：

表18种化合物的抗菌性一

表28种化合物的抗菌性二

其中，^a表示未测试；^b半数溶血率；^c,d,e,f,g,h抗生素的不同作用机理，分别是：^c抑制细菌细胞壁的合成；^d,e分别靶向于30s和50s核糖体，抑制蛋白质的合成；^f影响核酸合成与复制；^g影响叶酸的代谢；^h破坏细胞膜。

以下以抗菌性最好的pbam-4进行详细说明：

材料和方法：所有的试剂均由acros，tci(美国)，sigma-aldrich,麦克林，阿达马思等有机试剂公司和碧云天生物科技公司提供，均直接使用不须进一步纯化(除其它注明外)。实验用超纯水来自于milli-q纯化仪器。惰性气体为氮气或氩气。

pbam-4的合成合成步骤如图1所示。称取对苯二甲酸二亚氨酸酯盐酸盐(43.9mg,0.15mmol,1eq.)和1，4-双(3-氨基丙基)哌嗪(30.0mg，0.15mmol,1eq.)放在7ml的玻璃瓶子中，加入1.5ml无水dmf混合均匀后加入83.7μltea(0.6mmol,4eq.)。在惰性气体保护下，35℃搅拌96h。向混合物中加入稀盐酸溶液调节ph至1-2之间，放在截留分子量为1.5kda的透析袋中透析10h，每两个小时换一次水。冷冻干燥后得到白色的固体36mg。

pbam-4具有广谱的抗菌活性:我们测试了pbam-4对多种细菌的抗菌活性(表1和表2)。pbam-4均表现出良好的抗菌活性，所有测试的最小抑菌浓度均在较低的ug/ml范围内。除此以外，我们还测试了pbam-4对12株高耐药的临床病原体的活性，发现其最小抑菌浓度均在较低的ug/ml范围内。这些广谱的抗菌活性清晰地表明了pbam-4具有抗耐药性的特性。另外，pbam-4对红细胞表现出较低的溶血活性，半数溶血浓度大于5000μg/ml。运用公认的抗菌聚合物的治疗指数的算法(治疗指数＝半数溶血浓度/最小抑菌浓度)，pbam-4对于大多数菌的治疗指数都大于2500。所有细菌的最小杀菌浓度值与相应的最小抑菌浓度极为相符，表明pbam-4种具有强力杀菌作用。

膜靶向机理的验证我们首先用流式实验来评估pbam-4的破膜能力。在流式实验中，碘化丙啶(pi)作为一种评估细菌细胞膜完整性的荧光染料。培养到静止期的大肠杆菌离心之后，弃去培基，用pbs洗三次，之后用含有100μmpi的pbs重新悬浮为od600nm＝0.1，加入指定浓度的pbam-4和环丙沙星在37℃下培养4h。运用bdaccuric6plus流式细胞仪对样品进行分析。由于碘化丙啶(pi)只能进入细胞膜受损的细胞，所以，在流式实验中pi可以作为一个好的细菌细胞膜完整性的指示剂。如图2结果表明用pbam-4处理过的大肠杆菌有更多的pi积累，从而发出更强的荧光。未经处理的大肠杆菌和用非膜靶向抗生素环丙沙星处理过的大肠杆菌则表现出极低的荧光。

我们还进一步运用扫描电子显微镜来证明pbam-4的破膜能力。如图3，相对于未经处理的大肠杆菌和鲍曼不动杆菌对照组，用pbam-4处理过的细菌都表现出了明显的膜破损和皱缩。

结合dna抗菌机理的验证该低聚物的设计主要是基于膜靶向和dna靶向的双重抗菌机理。除了对pbam-4破膜能力的证明，我们还证明了该低聚物具有结合细菌dna的能力。动态光散射(dls)研究表明不同浓度的pbam-4均可以促进大肠杆菌基因组dna的聚集，如图4所示。结合dna形成低聚物-dna的复合物为证明pbam-4和dna之间具有亲和力提供了有力的证据。除此之外，在外加dna的条件下，pbam-4的抗菌活性会得到抑制。但是，靶向于细胞膜的小分子抗生素多粘菌素在该条件下没有抗菌活性的减少，如图5所示。这一现象可以解释为pbam-4结合dna之后其抗菌活性部分失活。

在确定了pbam-4在体外具有与dna结合能力后，我们用荧光素标记的pbam-4观察其对细菌dna和细胞dna的结合情况。图6为pbam-4对两种细菌的染色情况，pbam-4染色通道(“pbam-4”)、细胞膜染色通道(“fm4-64”)和dna染色通道(“dapi”)可以很好地重合在一起，表面在细菌中，pbam-4既能靶向细胞膜，也能靶向无细胞核保护的dna。与细菌中的染色情况不同，在哺乳动物细胞中pbam-4(图7，“pbam-4”通道)停留在胞间质并不会进入细胞核(图7，“dapi”通道)中，这可能是由于其较大的尺寸被核膜排除在细胞核外，因而不能与细胞的dna结合，这对降低其细胞毒性是至关重要的。由于pbam-4可以结合细菌的dna，而不能结合哺乳类动物的dna，其对细菌的杀伤能力远大于对细胞的杀伤能力，因此表现出高的选择性和治疗指数。

pbam-4的耐药性产生速率的测定引入双重抗菌机理的另外一个好处是可以降低细菌对化合物产生耐药性的速度。膜靶向聚合物的靶标是细胞膜，其生物合成非常复杂，只有当多种随机突变同时发生并且导致膜结构发生变化，才会降低细菌对其的敏感性，因此膜靶向聚合物被认为是一类低耐药的抗菌化合物。作为膜靶向聚合物的一种，pbam-4也具有低耐药性的特征。然而除此以外，pbam-4还具有dna作为第二靶标，因此细菌需要同时发生膜结构的突变以及dna结构的突变，才能产生对pbam-4的耐药性。因此，膜靶向和dna靶向的双重机理赋予了pbam-4抗耐药性的可能性，可以将耐药性产生速率降到更低的水平；而我们的实验观察验证了这一假设。如图8所示，当大肠杆菌被次最小抑菌浓度的标准抗生素卡那霉素重复处理后，菌株产生了耐药性突变，表现为对卡那霉素的最小抑菌浓度不断上升，细菌复制576代之后其最小抑菌浓度增加了14倍。与此相反的是，pbam-4在相同的情况下没有产生明显的耐药性。上述所有结果除了表明pbam-4具有广谱高效的抗菌活性，更清晰地揭示了其这一新型抗菌低聚物材料抵抗耐药性产生的本质。

运用细胞感染模型进行抗菌效率评估我们继续对pbam-4在哺乳动物细胞存在时的抗菌效率进行了评估。我们首先用nih/3t3细胞作为模型来进行评估。在鲍曼不动杆菌和nih/3t3共培养的情况下，原本形态正常的哺乳动物细胞(图9a)将会被快速增殖的细菌杀掉(图9b)。用pbam-4处理受感染的nih/3t3细胞可以将其恢复至感染前的状态(图9c)。作为对照试验，pbam-4对nih/3t3细胞没有明显的细胞毒性(图9d)。

相似的是，过量的细菌可以引起红细胞的溶血效应，而pbam-4可以通过其强大的杀菌作用，抑制红细胞溶血。如图10所示，在加入8μg/mlpbam-4之后，细菌的数量从1.5×10⁸cfu/ml减少到0cfu/ml，同时红细胞溶血率从88％降低到0％。作为对照的标准抗生素美罗培南只降低了10²cfu/ml的细菌以及23％的溶血率。这些实验结果表明，pbam-4不仅具有好的抗菌活性，并且其生物相容性较好。

运用线虫感染模型进行抗菌效率评估基于上述在体外研究中pbam-4表现出来的优异性能，我们继续运用简单的线虫模型对其在活体中的活性进行初步评估。在研究中，我们首先用不同的菌株，金黄色葡萄球菌，鲍曼不动杆菌或者铜绿假单胞菌感染线虫。这些感染了的线虫分为三组:pbs处理组，标准抗生素组，pbam-4处理组。药物处理之后，我们对线虫进行研磨并检测破碎液中细菌的数量。图11清楚地表明，pbam-4在线虫感染模型中可以高效地杀灭细菌及多药耐药菌株。作为比较，在体外具有中等或较好杀菌活性较好的传统抗生素在该线虫模型中对多药耐药性菌株表现出了较差的效率。这一简单活体模型的结果证明了pbam-4在治疗细菌感染尤其是多药耐药菌时的高效性。

运用老鼠伤口模型进行抗菌活性的评估为了更好地对pbam-4在动物模型中活性进行评估，我们运用一个老鼠精准伤口模型对其效率进行评估。在这一模型中，我们在老鼠表皮制造了2cm×2cm的伤口，用铜绿假单胞菌对伤口表面进行感染。之后，伤口表面分别用pbam-4，环丙沙星和pbs处理，持续15天观察老鼠的伤口恢复情况(图12a)。结果清晰地表明，pbam-4可以显著提高感染小鼠的存活率，将死亡率从50％降到10％(图12b)。pbam-4处理后，我们对伤口的细菌数目进行检测，观察到pbam-4清除了伤口处所有的细菌(图12c)，这与pbam-4的快速杀菌动力学和较低的mic/mbc数值是相符的。

综上所述，该低聚物可同时靶向细菌的细胞膜和核酸，产生协同效应并具有较高的治疗指数。得益于其双重抗菌机理，该低聚物保留了传统抗菌聚合物的所有抗菌优势，比如，快速的杀菌动力学和较低的耐药性产生机率；除此以外，dna作为第二靶标所提供的选择性使其在细胞毒性方面得到了较大改善，为多药耐药病原体的治疗提供了一种方案。

实施例2

为了扩展抗菌脒类低聚物的种类，采用不同的h2n-r-nh2作为混合原料制备抗菌脒类低聚物，发现获得的混合产物也具有明显的抗菌性，具体如表3所示：

表3混合原料制备抗菌脒类低聚物的抗菌性

表3说明，抗菌脒类低聚物的r基团为混合的基团也同样具有抗菌性能。

上述仅为本发明的一个具体导向实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明的保护范围的行为。