本发明涉及木糖醇的制备方法，利用农业废弃物柑橘皮清洁生产木糖醇的方法。
背景技术：
木糖醇是一种天然甜味剂，化学名为“戊五糖”，是一种五碳糖。外表和味觉都与蔗糖相似，和其他糖醇比较，是多元醇中最甜的甜味剂[1]。已广泛应用于食品、医药、印染、纺织、国防、皮革及化工等领域。20世纪70年代，木糖醇被国际粮农和卫生组织食品添加剂法规专家委员会(jecfa)批准为a类食品添加剂，1999年6月国际食品法典委员会(cac)批准木糖醇为“在食品中可以按正常生产需要使用的食品添加剂”。近年来随着国内外学者对其生理功能特性的研究，证实木糖醇具有多种生理功能，是一种重要的功能性糖醇。
我国木糖醇生产为传统生产方法，主要以玉米芯为原料，利用酸水解预处理，经多次精制木糖，再采用氢化技术生产木糖醇，存在产量低、污染严重、高消耗、生产成本高等缺点。并且镍催化剂会污染环境，严重制约企业发展和国际竞争力。而利用微生物直接发酵半纤维素水解液生产木糖醇，工艺条件温和、能耗低、环境污染小、产品质量安全可靠。柑橘皮渣一般来说没有开发利用，基本上任它随着时间而腐烂，化为尘土肥料。也曾有地方柑橘皮渣提取精油，果胶，色素，黄酮，柠檬苦素和膳食纤维等，但都未形成规模。其实柑橘皮渣富含半纤维素，用其生产木糖乃至木糖醇将是很好的原料，成本低廉，目前国内外未见相关报道。并且柑橘皮渣中的木聚糖结合不如玉米芯牢固，容易水解得到木糖。
当前生产木糖醇多采用物理、化学的方法，存在诸多弊端。研究发现，一些细菌、酵母菌以及某些真菌能将木糖转化，生成木糖醇。其中，酵母菌是最有效的木糖醇生产菌。酿酒酵母是公认的安全性微生物，应用于食品发酵已有上千年的历史，发酵工艺成熟，是理想的工业生产菌株，且自身不具有代谢木糖的能力。在酿酒酵母工业菌株中稳定高效表达木糖还原酶基因，是构建酿酒酵母木糖醇生产菌株的基本策略。
技术实现要素：
为了得到质量高、成本低廉的木糖醇，本发明提供一种原材料新颖、反应条件温和、成本低、绿色生产、环境友好，易于实现工业化的木糖醇的制备方法。选用农林废弃物柑橘皮作原料。
本发明采用如下技术方案：
一种利用柑橘皮制备木糖醇的方法，所述方法按如下步骤进行：
(1)水解：将原料柑橘皮洗净，烘干后破碎，置于水解釜中，加入原料柑橘皮质量3～5倍的水，煮沸90～120min，排水后再加入原料柑橘皮质量5～6倍的0.5wt％～1wt％硫酸，即0.5wt％～1wt％硫酸水溶液，在115～130℃，0.1～0.15mpa的条件下水解3～5h，得到水解液；
(2)中和：将步骤(1)所得水解液升温至75～80℃，边搅拌边加入caco3乳液进行中和，中和至ph为3.5～4.0后，保温60～90min，过滤除渣，得到糖液；
(3)脱色：将步骤(2)所得糖液减压浓缩至所述糖液体积的1/5～1/8倍，滤除析出的固体，升温至75～80℃，ph调为2.5～3.5，边搅拌边加入活性炭进行脱色，脱色后滤除活性炭，得到脱色后的糖液；
(4)离子交换：对步骤(3)所得脱色后的糖液进行离子交换，采用001*7型强酸性阳离子树脂和d296r或者d201型强碱多孔阴离子树脂进行交叉处理，所述交叉处理的方法为：先用所述阳离子树脂对脱色后的糖液进行离子交换，再用所述阴离子树脂进行离子交换，以此为一个周期，重复进行2～3次，得到离子交换后的糖液；
(5)发酵：首先配制培养基：将步骤(4)所得离子交换后的糖液、酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨、水混合即得到培养基，接入以热带假丝酵母candidatripicalis，保藏号：as2.1776为出发菌株制得的酶源，在200～220r/min，28～32℃的条件下发酵46～52h，得到发酵液，然后将所得发酵液在8000～10000rpm下离心20～25分钟，取上清液，纯化得抽提液冷却后析出晶体，过滤收集晶体并干燥，得到产物木糖醇；所述培养基中，所述糖液中的木糖的终浓度为120～150g/l，所述酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨的终浓度分别为8～12g/l，溶剂为水，初始ph为5.0～6.0。
进一步，所述步骤(1)中，推荐将所述柑橘皮烘干后破碎至粒度为2～5mm。
再进一步，步骤(2)中，由于所述水解液仍含残余的硫酸，ph值为2.3左右，因此加入caco3乳液进行中和，优选所述caco3乳液波美度为15～17度。
更进一步，所述步骤(3)中，由于浓缩后的糖液颜色较深，因此利用活性炭进行脱色处理，优选所述活性炭的质量用量以所述糖液的体积计为100～160g/l，脱色后所述糖液的透明度(折光度)为30％～40％。
所述步骤(4)中，通过离子交换处理进一步净化所述糖液，可使所述糖液的透明度(折光度)达93％～97％，糖液呈无色透明状。
所述步骤(5)中，在配制培养基前，可以通过紫外可见分光光度法测得所述糖液中木糖的含量，从而在配制培养基时，可通过调节水量使木糖的终浓度满足本发明所述的浓度范围。
所述步骤(5)中所述的纯化方法为：所述上清液，加入活性炭，调节ph至4.8～5.2，煮沸，冷却至室温，抽滤，取滤液在50～60℃下减压蒸干得到固体物质，并在50～60℃下用无水乙醇抽提得抽提液；所述活性炭的质量用量以所述上清液的体积计为18～25g/l。
所述步骤(5)中，所述的出发菌株热带假丝酵母(candidatripicalis，菌种保存号：as2.1776)，购自中国普通微生物菌种保藏中心(北京)。
所述步骤(5)中，所述的酶源为所述的热带假丝酵母种子液，推荐所述热带假丝酵母种子液的接种体积量是所述培养基体积的5％～15％，所述的热带假丝酵母种子液按如下方法制得：
(5.1)斜面培养：将热带假丝酵母菌candidatripicalis，保藏号：as2.1776接种至斜面培养基，30℃培养72～96小时，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏1.5～5g/l，蛋白胨2～5g/l，琼脂粉18～25g/l，木糖30～50g/l，ph5～6，溶剂为水；优选斜面培养基终浓度组成为：酵母膏2g/l，蛋白胨3g/l，琼脂粉20g/l，木糖40g/l，溶剂为水，ph5.5；
(5.2)种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，30℃、200rpm培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖5～15g/l，d-木糖5～15g/l，酵母膏1.5～5g/l，蛋白胨2～5g/l，麦芽汁2～5g/l，ph5～6，溶剂为水；优选种子培养基浓度组成为：葡萄糖10g/l,d-木糖10g/l，酵母膏2.0g/l，蛋白胨3.0g/l，麦芽汁3.0g/l，ph5.5，溶剂为水。
对步骤(5)中所得发酵液进行成分分析，其中，木糖醇浓度为75g/l～90g/l，残存木糖浓度为5g/l～10g/l，木糖醇转化率为60％～70％。
本发明拟以柑橘皮为原料，采用生物转化法生产木糖醇，可省去多次提纯、精制步骤，提高木糖利用率和木糖醇转化率，实现木糖醇低成本的关键技术突破，增加农民收入，提高我国木糖醇国际占有量和竞争力。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)使用柑橘皮为原材料，在国内外未见相关的报道和应用；
(2)本发明的整体生产工艺过程反应温和，不需要使用化学催化剂，以热带假丝酵母candidatripicalis，保藏号：as2.1776为出发菌株制得酶源，对环境污染较小，由于微生物菌种的特性和微生物酶作用的专一性，反应终产物单一，使得提取和精制容易，生产成本低；
(3)发酵液离心后的剩余物主要成分是单细胞蛋白，可以进一步开发利用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
一种利用柑橘皮制备木糖醇的方法，选用柑橘皮作原料，所述方法按如下步骤进行：
(1)水解
将选好的柑橘皮用清洗机清洗干净，烘干后破碎，将破碎后的柑橘皮(粒度为3mm)100g放入水解釜，加入300g水，升温至100℃煮沸90min，排水后再加入600g0.5wt％的硫酸，然后升温至121℃，在0.1mpa的压力条件下水解3h，得到水解液；
(2)中和
所得水解液仍含残余的硫酸，ph值为2.5左右，因此加入波美度16度caco3乳液进行中和，具体步骤为：将所述水解液加到中和罐中，升温至75℃，边搅拌边加入所述的caco3乳液，调控至ph为3.5，为充分沉淀，中和后保温60分钟，再过滤除渣，得到糖液；
(3)脱色
将除渣后的糖液进行减压蒸发，浓缩至其原来体积的1/5(80ml)，并将析出的caso4滤除；
浓缩后的糖液颜色较深，利用活性炭8g进行脱色处理：将所述糖液加热到75℃，调控ph为2.5，边搅拌边加入活性炭进行脱色，脱色后滤除活性炭，所得脱色后的糖液透明度(折光度)为36％；
(4)离子交换
为了进一步净化糖液，需进行离子交换，选用001*7型强酸性阳离子树脂和d296r型强碱多孔阴离子树脂进行交叉离子交换处理，层析柱直径为4cm，柱床高度为42cm，木糖醇液流速控制为1.5ml/cm2·min。所述交叉离子交换处理的方法为：先用所述阳离子树脂进行离子交换，再用所述阴离子树脂进行离子交换，以此为一个周期，重复进行2次，可使糖液透明度(折光度)达96％左右，糖液呈无色透明状；
(5)发酵：首先配制培养基：将40ml离子交换后的糖液、0.8g酵母提取物、0.8g牛肉膏、0.8g蛋白胨、60ml水混合即得到培养基，所得培养基中，所述糖液中的木糖的终浓度为120g/l，所述酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨的终浓度均为8g/l，培养基配制好后，在超净台接入5ml热带假丝酵母种子液，接着置于摇床中，在200r/min，30℃的条件下发酵48h，得到发酵液，然后将所得发酵液在8000rpm下离心20分钟，取上清液，加入2.0g活性炭，调节ph至4.8，煮沸，冷却至室温，抽滤，取滤液在55℃下减压蒸干得到固体物质12.4g，并55℃下用60ml无水乙醇抽提所得的固体物质，抽提液冷却后析出晶体，过滤收集晶体并干燥，得到产物7.2g，采用紫外可见分光光度法测定为木糖醇；
上述发酵过程中，对所得的发酵液进行成分分析，其中木糖醇浓度为75g/l，残存木糖浓度为5g/l，木糖醇转化率为66％。
其中，所述热带假丝酵母种子液是按如下方法制得的：
(5.1)斜面培养：将热带假丝酵母菌as2.1776接种至斜面培养基，30℃培养72～96小时，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏2g/l，蛋白胨3g/l，琼脂粉20g/l，木糖40g/l，溶剂为水，ph5.5；
(5.2)种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，30℃、200rpm培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖10g/l,d-木糖10g/l，酵母膏2.0g/l，蛋白胨3.0g/l，麦芽汁3.0g/l，ph5.5，溶剂为水。
实施例2
方法同实施例1，不同之处是培养基的配制和热带假丝酵母的接种量：将45ml离子交换后的糖液、1g酵母提取物、1g牛肉膏、1g蛋白胨、55ml水混合得到培养基，所得培养基中，所述糖液中的木糖的终浓度为135g/l，所述酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨的终浓度均为10g/l，培养基配制好后，在超净台接入10ml热带假丝酵母。
最终得到产物8.2g，采用紫外可见分光光度法测定为木糖醇，并且对发酵过程中所得的发酵液进行成分分析，其中木糖醇浓度为81g/l，残存木糖浓度为6.5g/l，木糖醇转化率为63％。
实施例3
方法同实施例1，不同之处是培养基的配制和热带假丝酵母的接种量：将50ml离子交换后的糖液、1.2g酵母提取物、1.2g牛肉膏、1.2g蛋白胨、50ml水混合得到培养基，所得培养基中，所述糖液中的木糖的终浓度为150g/l，所述酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨的终浓度均为12g/l，培养基配制好后，在超净台接入15ml热带假丝酵母。
最终得到产物8.5g，采用紫外可见分光光度法测定为木糖醇，并且对发酵过程中所得的发酵液进行成分分析，其中木糖醇浓度为84g/l，残存木糖浓度为7.8g/l，木糖醇转化率为60％。
实施例4
一种利用柑橘皮制备木糖醇的方法，选用柑橘皮作原料，所述方法按如下步骤进行：
(1)水解
将选好的柑橘皮用清洗机清洗干净，烘干后破碎，将破碎后的柑橘皮(粒度为2mm)100g放入水解釜，加入380g水，升温至100℃煮沸100min，排水后再加入550g0.7wt％的硫酸，然后升温至115℃，在0.12mpa的压力条件下水解4h，得到水解液；
(2)中和
所得水解液仍含残余的硫酸，ph值为2.5左右，因此加入波美度15度caco3乳液进行中和，具体步骤为：将所述水解液加到中和罐中，升温至78℃，边搅拌边加入所述的caco3乳液，调控至ph为3.8，为充分沉淀，中和后保温80分钟，再过滤除渣，得到糖液；
(3)脱色
将除渣后的糖液进行减压蒸发，浓缩至其原来体积的1/6(80ml)，并将析出的caso4滤除；
浓缩后的糖液颜色较深，利用活性炭10g进行脱色处理：将所述糖液加热到78℃，调控ph为3.0，边搅拌边加入活性炭进行脱色，脱色后滤除活性炭，所得脱色后的糖液透明度(折光度)为30％；
(4)离子交换
为了进一步净化糖液，需进行离子交换，选用001*7型强酸性阳离子树脂和d201型强碱多孔阴离子树脂进行交叉离子交换处理，层析柱直径为4cm，柱床高度为42cm，木糖醇液流速控制为1.5ml/cm2·min。所述交叉离子交换处理的方法为：先用所述阳离子树脂进行离子交换，再用所述阴离子树脂进行离子交换，以此为一个周期，重复进行3次，可使糖液透明度(折光度)达96％左右，糖液呈无色透明状；
(5)发酵：首先配制培养基：将40ml离子交换后的糖液、0.8g酵母提取物、0.8g牛肉膏、0.8g蛋白胨、60ml水混合即得到培养基，所得培养基中，所述糖液中的木糖的终浓度为120g/l，所述酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨的终浓度均为8g/l，培养基配制好后，在超净台接入5ml热带假丝酵母种子液，接着置于摇床中，在210r/min，28℃的条件下发酵46h，得到发酵液，然后将所得发酵液在9000rpm下离心22分钟，取上清液，加入1.8g活性炭，调节ph至4.9，煮沸，冷却至室温，抽滤，取滤液在50℃下减压蒸干得到固体物质12.4g，并50℃下用60ml无水乙醇抽提所得的固体物质，抽提液冷却后析出晶体，过滤收集晶体并干燥，得到产物7.2g，采用紫外可见分光光度法测定为木糖醇；
上述发酵过程中，对所得的发酵液进行成分分析，其中木糖醇浓度为76g/l，残存木糖浓度为10g/l，木糖醇转化率为70％。
其中，所述热带假丝酵母种子液是按如下方法制得的：
(5.1)斜面培养：将热带假丝酵母菌as2.1776接种至斜面培养基，30℃培养72～96小时，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏1.5g/l，蛋白胨2g/l，琼脂粉18g/l，木糖30g/l，溶剂为水，ph5.0；
(5.2)种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，30℃、200rpm培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖5g/l,d-木糖5g/l，酵母膏1.5g/l，蛋白胨2.0g/l，麦芽汁2.0g/l，ph5，溶剂为水。
实施例5
一种利用柑橘皮制备木糖醇的方法，选用柑橘皮作原料，所述方法按如下步骤进行：
(1)水解
将选好的柑橘皮用清洗机清洗干净，烘干后破碎，将破碎后的柑橘皮(粒度为5mm)100g放入水解釜，加入500g水，升温至100℃煮沸120min，排水后再加入500g1.0wt％的硫酸，然后升温至130℃，在0.15mpa的压力条件下水解5h，得到水解液；
(2)中和
所得水解液仍含残余的硫酸，ph值为2.5左右，因此加入波美度17度caco3乳液进行中和，具体步骤为：将所述水解液加到中和罐中，升温至80℃，边搅拌边加入所述的caco3乳液，调控至ph为4.0，为充分沉淀，中和后保温90分钟，再过滤除渣，得到糖液；
(3)脱色
将除渣后的糖液进行减压蒸发，浓缩至其原来体积的1/8(75ml)，并将析出的caso4滤除；
浓缩后的糖液颜色较深，利用活性炭12g进行脱色处理：将所述糖液加热到80℃，调控ph为3.5，边搅拌边加入活性炭进行脱色，脱色后滤除活性炭，所得脱色后的糖液透明度(折光度)为40％；
(4)离子交换
为了进一步净化糖液，需进行离子交换，选用001*7型强酸性阳离子树脂和d201型强碱多孔阴离子树脂进行交叉离子交换处理，层析柱直径为4cm，柱床高度为42cm，木糖醇液流速控制为1.5ml/cm2·min。所述交叉离子交换处理的方法为：先用所述阳离子树脂进行离子交换，再用所述阴离子树脂进行离子交换，以此为一个周期，重复进行3次，可使糖液透明度(折光度)达96％左右，糖液呈无色透明状；
(5)发酵：首先配制培养基：将40ml离子交换后的糖液、0.8g酵母提取物、0.8g牛肉膏、0.8g蛋白胨、60ml水混合即得到培养基，所得培养基中，所述糖液中的木糖的终浓度为120g/l，所述酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨的终浓度均为8g/l，培养基配制好后，在超净台接入5ml热带假丝酵母种子液，接着置于摇床中，在220r/min，32℃的条件下发酵52h，得到发酵液，然后将所得发酵液在10000rpm下离心25分钟，取上清液，加入2.5g活性炭，调节ph至5.2，煮沸，冷却至室温，抽滤，取滤液在60℃下减压蒸干得到固体物质12.4g，并60℃下用60ml无水乙醇抽提所得的固体物质，抽提液冷却后析出晶体，过滤收集晶体并干燥，得到产物7.2g，采用紫外可见分光光度法测定为木糖醇；
上述发酵过程中，对所得的发酵液进行成分分析，其中木糖醇浓度为90g/l，残存木糖浓度为9g/l，木糖醇转化率为70％。
其中，所述热带假丝酵母种子液是按如下方法制得的：
(5.1)斜面培养：将热带假丝酵母菌as2.1776接种至斜面培养基，30℃培养72～96小时，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏5g/l，蛋白胨5g/l，琼脂粉25g/l，木糖50g/l，溶剂为水，ph6.0；
(5.2)种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，30℃、200rpm培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/l,d-木糖15g/l，酵母膏5g/l，蛋白胨5.0g/l，麦芽汁5.0g/l，ph6，溶剂为水。