一种源于簇毛麦的小麦抗白粉病基因Pm21的KASP分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术和遗传育种领域，具体地说是一种源于簇毛麦的小麦抗白粉病基因pm21的kasp分子标记及其应用。

背景技术：

小麦（triticumaestivuml.,2n=42,aabbdd）是我国最重要的粮食作物之一，保持小麦的高产、稳产对保障国家粮食安全十分重要。在众多影响小麦产量和品质的因素中，病害的发生十分关键。小麦白粉病是一种由布氏白粉菌引起的叶部病害，一般可造成小麦10-15%的产量损失，并在一定程度上影响小麦品质（singhetal.diseaseimpactonwheatyieldpotentialandprospectsofgeneticcontrol.annurevphytopathol2016,54,303–322.）。为防控小麦白粉病，一般可采用田间农业管理、喷施农药和种植抗病品种等几种措施。相比较而言，种植抗病品种无疑是最为经济、有效和环保的措施（selteretal.identificationandimplementationofresistance:genomics-assisteduseofgeneticresourcesforbreedingagainstpowderymildewandstagonosporanodorumblotchinwheat.in:tuberosar.,granera.,frisone.(eds)genomicsofplantgeneticresources.2014,springer,dordrecht.）。

在一项我国小麦品种抗白粉病能力调查中，发现我国目前主要推广品种中仅有3.4%的品种具有广谱抗性，更多参与国家区试试验的育种品系的白粉病抗性也不容乐观（李洪杰等，中国小麦品种对白粉病的抗性反应与抗病基因检测.作物学报.2011,37:943-954.）。因此，目前我国小麦抗白粉病育种一方面需要发掘利用更为广谱的抗性基因，另一方面也需要加快育种进程，缩短育种周期，以应对我国日益严重的小麦白粉病疫情。

目前，科学家已在61个位点发现80多个小麦抗白粉病基因及其等位基因(pm1-pm65,pm8isallelictopm17,pm18=pm1c,pm22=pm1e,pm23=pm4c,pm31=pm21)（lietal.aspontaneouswheat-aegilopslongissimatranslocationcarryingpm66confersresistancetopowderymildew.theorapplgenet,2020,inpress），但是很多抗病基因在长期推广过程中由于植物-病原菌互作逐渐丧失了对白粉病的抗性，一些抗性较好的基因也由于存在不利的一因多效、遗传连锁累赘等因素，需要多代回交才可以使用，进而又造成了育种上竞争滞后，大大影响了在抗白粉病育种中的利用（summers&brown.constraintsonbreedingfordiseaseresistancein6commerciallycompetitivewheatcultivars.plantpathol,2013,62:115-121）。因此，在抗病基因选择时，不但要考虑抗病基因的抗性强弱和抗谱宽窄，还要考虑到载体品种的产量、农艺等性状能够满足育种家的要求。

在已发掘的小麦白粉病基因中，pm21是一个源于簇毛麦6vs染色体的广谱抗白粉病基因，20世纪80年代，通过小麦-簇毛麦远缘杂交，携带pm21以6vs染色体臂易位的形式转移到了小麦基因组中，大大提高了小麦的抗白粉病能力，在推广20多年以来，鲜有pm21致病白粉病菌株的报道，是一个具有重要育种的价值的抗白粉病基因。2018年，xing等（2018）和he等（2018）分别采用抗病基因富集测序及图位克隆的方法克隆了pm21基因，证实pm21基因编码了一个cc-nbs-lrr抗病蛋白赋予了小麦白粉病抗性（heetal.(2018)pm21,encodingatypicalcc-nbs-lrrprotein,confersbroad-spectrumresistancetowheatpowderymildewdisease.molplant,11:879-888；xingetal.pm21fromhaynaldiavillosaencodesacc-nbs-lrrproteinconferringpowderymildewresistanceinwheat.molplant,2018,11:874-878）。

为转育pm21基因，目前已开发了众多类型的6vs染色体臂特异的分子标记，如rapd标记（qietal.identification,mapping,andapplicationofpolymorphicdnaassociatedwithresistancegenepm21ofwheat.genome,1996,39:191-197）、scar标记（刘志勇等(1999)小麦抗白粉病基因pm21的分子鉴定和标记辅助选择.遗传学报,26:673-682）、ssr标记（songetal.a‘one-marker-for-two-genes’approachforefficientmoleculardiscriminationofpm12andpm21conferringresistancetopowderymildewinwheat.molbreeding,2009,23:357–363）和est标记（bieetal.efficientmarker-assistedscreeningofstructuralchangesinvolvinghaynaldiavillosachromosome6vusingadouble-distal-markerstrategy.molbreeding,2015,35:34.）。he等（2017）采用cisp（conserved-intronscanningprimer）开发了基于内含子的6vs特异标记（heetal.genetic,physicalandcomparativemappingofthepowderymildewresistancegenepm21originatingfromdasypyrumvillosum.frontiersinplantscience,2017,8:1914）。另外，cao等（2011）根据stpk-v基因开发的cinau15和bie等（2015）根据pm21基因启动子区域开发的mbh1，也应用比较广泛（caoetal.serine/threoninekinasegenestpk-v,akeymemberofpowderymildewresistancegenepm21,conferspowderymildewresistanceinwheat.procnatlacadsciusa,2011,108:7727–7732;bieetal.developmentandcharacterizationofmarkermbh1simultaneouslytagginggenespm21andpmvconferringresistancetopowderymildewinwheat.mol.breeding,2015,35:189）。但是这些标记均是建立实验室凝胶电泳基础上基于普通pcr的分子标记，无法实现高通量、自动化、平台化选育，影响了pm21基因的转育效率。

近年来，随着分子标记技术的发展，尤其是以snp（singlenucleotidepolymorphism）为基础的第三代分子标记的出现，大大提升了目标基因的选择效率。在第三代分子标记中，kasp（kompetitiveallelespecificpcr）技术是实现snp高效分型的关键，它能够准确、高通量、平台化的实现基因分型，避免传统以凝胶电泳为基础的标记显示手段，具有高通量、低成本、遗传稳定性好等特点。因此，kasp标记在小麦基因定位、图位克隆及分子标记辅助选择育种中发挥了越来越重要作用（rasheedetal.developmentandvalidationofkaspassaysforgenesunderpinningkeyeconomictraitsinbreadwheat.theorapplgenet,2016,129,1843–1860）。然而，pm21作为一个具有重要育种价值的抗白粉病基因，虽然已经被克隆，却尚未有育种可用kasp标记，尤其是功能kasp标记的报道，严重影响了pm21基因在小麦遗传改良中的高效利用。因此，利用已克隆的pm21序列与小麦基因组比对，开发pm21功能kasp标记，能够实现pm21基因的快速、精准的检测，将大大加快pm21基因在分子标记辅助选择育种中的高效利用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种源于簇毛麦的小麦抗白粉病基因pm21的kasp分子标记及其应用，可高通量检测和追踪小麦背景中抗白粉病基因pm21，大大加快pm21基因分子标记辅助选择育种的效率。

本发明是通过以下方法实现的：一种源于簇毛麦的小麦抗白粉病基因pm21的kasp分子标记，所述kasp分子标记为kasp-pm21，其kasp分子标记kasp-pm21的引物包括簇毛麦等位型上游引物kasp-pm21-f、小麦等位型上游引物kasp-pm21-h以及共用下游引物kasp-pm21-c；

所述簇毛麦等位型上游引物kasp-pm21-f的核苷酸序列如seqidno:1所示；

所述小麦等位型上游引物kasp-pm21-h的核苷酸序列如seqidno:2所示；

所述共用下游引物kasp-pm21-c的核苷酸序列如seqidno:3所示。

一种所述源于簇毛麦的小麦抗白粉病基因pm21的kasp分子标记在分子标记辅助选择育种中的应用。

一种所述的源于簇毛麦的小麦抗白粉病基因pm21的kasp分子标记在鉴定小麦品种或品系中是否携带源于簇毛麦的小麦抗白粉病基因pm21中的应用。

一种小麦品种或品系中是否携带小麦抗白粉病基因pm21的鉴定方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的dna，作为模板；

（2）利用所述kasp分子标记kasp-pm21的引物对待测样品的基因组dna进行pcr扩增，获得扩增产物；

所述kasp分子标记kasp-pm21的引物包括簇毛麦等位型上游引物kasp-pm21-f、小麦等位型上游引物kasp-pm21-h以及共用下游引物kasp-pm21-c；所述簇毛麦等位型上游引物kasp-pm21-f的核苷酸序列如seqidno:1所示；所述小麦等位型上游引物asp-pm21-h的核苷酸序列如seqidno:2所示；所述共用下游引物kasp-pm21-c的核苷酸序列如seqidno:3所示。

（3）采用荧光定量pcr检测仪分析pcr扩增产物基因型；37℃测量荧光信号，bio-radcfxmanager3.1读取分型结果；分型结果中若等位型为allele1/allele1则为簇毛麦的基因型或/和携带基因pm21载体的基因型，若等位型为allele1/allele2则为小麦中携带抗白粉病基因pm21的基因型，若等位型为allele2/allele2则为不含抗白粉病基因pm21的小麦的基因型。

所述的小麦品种或品系中是否携带小麦抗白粉病基因pm21的鉴定方法，所述pcr扩增的反应体系为：120ng/μldna6.0μl，2×kaspmasetermix10.0μl，引物混合液0.24μl，ddh2o3.76μl，总体系为20.0μl；其引物混合液中所述黑麦等位型上游引物kasp-pm21-f和小麦等位型上游引物kasp-pm21-h的浓度均为12μm；共用下游引物kasp-pm21-c的浓度为30μm。

所述的小麦品种或品系中是否携带小麦抗白粉病基因pm21的鉴定方法，所述pcr扩增的程序为：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒，64℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃变性20秒，58℃退火并延伸60秒，38个循环。

本发明通过已克隆的pm21基因序列与中国春小麦参考基因组序列进行比对分析，利用pm21基因序列中相比较于中国小麦a、b和d三套亚组特异的snp，首次开发了pm21基因的功能kasp分子标记kasp-pm21，利用该标记对簇毛麦、pm21基因载体、携带pm21基因的6vs易位系品种、pm21转基因系及不携带pm21基因的普通小麦品种进行检测，均能正确分型，准确无误，利用该标记可快速、高通量高效检测和追踪小麦品种或品系中pm21基因、加快pm21基因的高效育种利用。

具体来讲，本发明较现有技术的优点在于：

1）本发明开发小麦抗白粉病基因pm21的kasp标记，相比于传统基于普通pcr扩增的pm21的分子标记，kasp标记可以不用实验室凝胶电泳，实现快速、高通量、平台化检测和追踪pm21基因，大大提高pm21的转育利用。

2）本发明开发的kasp标记基于已克隆的pm21序列，属于功能标记，相比较于传统的连锁标记，功能标记与目的基因共分离，不存在重组现象，在追踪pm21基因时更为精准。同时，由于本发明开发的kasp标记基于pm21基因序列，不但可以追踪携带pm21的6vs染色体，利用更多6vs染色体上的优异基因，还可以追踪仅仅转移到小麦背景中携带pm21的小片段易位或pm21转基因系。

附图说明

图1为利用pm21基因的kasp标记kasp-pm21检测簇毛麦、携带pm21的6vs易位系小麦品种、小麦等不同样品的基因分型结果。

橙色圆形点代表簇毛麦和携带pm21基因的载体；绿色三角形点代表8个携带pm21的6vs易位系小麦品种（扬麦18、扬麦21、南农9918、金禾9123、石麦14、内麦9号、国麦301、石郑816）和2个pm21转基因系1和2；蓝色方形点代表20个不携带pm21的普通小麦品种（中国春、烟农19、烟农21、烟农1212、烟农999、济麦20、济麦21、济麦22、济麦262、济麦44、济南17、良星66、良星99、汶农14、山农20、山农29、泰农18、石新633、石新733和石新828）。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1小麦抗白粉病基因pm21的kasp分子标记kasp-pm21的获得和应用

1、dna扩增模板的准备

小麦抗白粉病pm21基因的载体为he等（2018）中已构建好的载体，备用。其余dna扩增模板利用ctab法分别提取1个簇毛麦、2个pm21转基因系、8个携带pm21的6vs易位系和20个不携带pm21的普通小麦的一叶期叶片的基因组dna，具体操作步骤如下：

（1）剪取新鲜叶片用液氮冷冻研磨，每个样品取0.5g研磨粉末于2ml离心管中；

（2）每个样品加入600μl65℃预热的ctab提取液，65℃水浴45min；

（3）离心管冷却至室温，加入与ctab提取液等量的氯仿-异戊醇(24:1)，摇床摇晃15min混匀，静置分层后，4℃条件下以12000rpm离心15min，上清液移至1.5ml离心管；

（4）加入3倍体积的-20℃下预冷的无水乙醇加入上清液离心管中，至絮状dna出现，放入-20℃冰箱静置30min；

（5）用移液枪头挑出絮状沉淀至另一1.5ml离心管中，预冷70%乙醇洗涤2次，dna沉淀常温下自然干燥；

（6）加入60μl1×te缓冲液将dna沉淀充分溶解；

（7）利用分光光度计检测dna溶液的浓度与纯度，根据所测浓度，用超纯水配置浓度为10-30ng/μl的dna工作液，用做pcr扩增模板。

2、小麦抗白粉病pm21基因kasp标记的开发及应用

利用已克隆的pm21基因序列（heetal.2018）与小麦参考基因序列（iwgscreferencesequencev1.0）进行序列比对分析，获得pm21基因序列中与小麦a、b和d三套亚组均特异的snp位点，根据该位点开发了一个pm21的功能kasp标记kasp-pm21，其引物包括：

标有fam的簇毛麦等位型上游引物kasp-pm21-f的核苷酸序列：

5’-gaaggtgaccaagttcatgctgctgaccagtctgagggagc-3’，如seqidno:1所示；

标有hex的小麦等位型上游引物kasp-pm21-h的核苷酸序列：

5’-gaaggtcggagtcaacggattgctgaccagtctgagggagt-3’，如seqidno:2所示；

共用下游引物kasp-pm21-c的核苷酸序列：

5’-gataccaaagcatcaacttcacc-3’，核苷酸序列如seqidno:3所示。

利用上述kasp分子标记kasp-pm21的引物对待测样品的基因组dna进行pcr扩增，获得扩增产物；待测样品分别为：1个簇毛麦、1个携带pm21基因的载体、8个携带pm21的6vs易位系（扬麦18、扬麦21、南农9918、金禾9123、石麦14、内麦9号、国麦301、石郑816）、2个pm21转基因系1和2（heetal.pm21,encodingatypicalcc-nbs-lrrprotein,confersbroad-spectrumresistancetowheatpowderymildewdisease.molecularplant.2018,11:879-882.）和20个不携带pm21的普通小麦（中国春、烟农19、烟农21、烟农1212、烟农999、济麦20、济麦21、济麦22、济麦262、济麦44、济南17、良星66、良星99、汶农14、山农20、山农29、泰农18、石新633、石新733和石新828）。

pcr扩增体系为：10-30ng/μldna6.0μl，2×kaspmasetermix10.0μl，引物混合液0.24μl，ddh2o3.76μl，总体系为20.0μl；引物混合液中的簇毛麦等位型上游引物kasp-pm21-f及小麦等位型上游引物kasp-pm21-h工作液浓度均为12μm；共有下游引物kasp-pm21-c工作浓度为30μm；

pcr扩增的程序为：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒，然后64℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，然后每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃变性20秒，58℃退火并延伸60秒，38个循环。

按照如上所述的pcr扩增程序和反应体系进行kasp基因分型，采用荧光定量pcr检测仪分析pcr扩增产物基因型；37℃测量荧光信号，bio-radcfxmanager3.1读取分型结果，分型结果如图1所示。图中显示：横轴远端样品为1个簇毛麦和1个携带pm21基因的载体，等位型为“allele1/allele1”，群荧光读取形式为橙色圆形点；纵轴远端样品群为20个不携带pm21基因的普通小麦，等位型为“allele2/allele2”，荧光读取形式为蓝色方形点；中间样品群为携带8个pm21基因的6vs易位系和2个pm21转基因系，等位型为“allele1/allele2”，荧光读取呈现绿色三角形点，近原点处三个方形黑点代表无模板对照。小麦抗白粉病pm21基因的kasp分子标记kasp-pm21在簇毛麦、pm21基因载体、携带pm21的6vs易位系、pm21的转基因系和不携带基因pm21的小麦中均实现了正确分型。因此，其可作为pm21基因的功能kasp分子标记。

因此，本发明提供的源于簇毛麦的小麦抗白粉病基因pm21的kasp分子标记kasp-pm21在携带pm21的6vs易位系品种、pm21转基因系及不携带pm21基因的品种中实现了准确分型，可用于不同小麦品种是否携带pm21基因进行有效鉴定，可实现pm21基因的高效追踪和检测，可用于小麦抗白粉病基因pm21的分子标记辅助选择育种。

以上所述用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以做一些修改或改进，使之对本领域技术人员是易于操作的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

sequencelisting

<110>烟台大学

<120>一种源于簇毛麦的小麦抗白粉病基因pm21的kasp分子标记及其应用

<130>

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>41

<212>dna

<213>标有fam的簇毛麦等位型上游引物kasp-pm21-f

<400>1

gaaggtgaccaagttcatgctgctgaccagtctgagggagc41

<210>2

<211>41

<212>dna

<213>标有hex的小麦等位型上游引物kasp-pm21-h

<400>2

gaaggtcggagtcaacggattgctgaccagtctgagggagt41

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>共用下游引物kasp-pm21-c

<400>3

gataccaaagcatcaacttcacc23