小麦抗条锈病相关蛋白TaWLT14.2及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及小麦抗条锈病相关蛋白tawlt14.2及其编码基因与应用。

背景技术：

小麦条锈病是由小麦条锈菌侵染引起的一种世界性小麦真菌病害。小麦条锈菌属于柄锈菌属的条形柄锈菌小麦专化型(pucciniastriiformisf.sp.tritici)，是一种活体寄生真菌。

条锈病是危害中国及世界小麦生产的严重病害。尽管化学药剂可以有效控制小麦病害造成的经济损失，但出于对环境安全和人类健康的考虑，培育并推广抗病品种依然被认为是最根本、最经济和最安全的途径(lineandchen,1995；xuetal.,2013)。抗小麦条锈病相关基因的克隆与功能研究对于小麦抗条锈病分子机制的研究和进行分子抗病育种具有十分重要的意义。

lt14(low-temperature-inducedprotein14)是禾谷类植物特有的低温响应蛋白家族，在大麦、黑麦、小麦等禾谷类作物中均有报道(dunnetal.,1990；ganaetal.,1997；zhangetal.,1993)。这类蛋白的编码基因在低温(2℃～6℃)或在遭受霜冻时被强烈诱导表达(babbenetal.,2018)，其编码蛋白的n-端有一段20个氨基酸组成的信号肽，帮助其分泌到细胞外部(ohnoandtakumi,2015)。gana(1997)等在小麦中克隆了lt14家族的tacr7基因，发现它的表达受低温特异性诱导，而对aba、盐、高温等其它非生物胁迫不敏感。目前关于小麦低温诱导基因wlt14(wheatlow-temperature-inducedgene14)在生物胁迫中的功能研究还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供小麦抗条锈病相关蛋白tawlt14.2及其编码基因与应用。

第一方面，本发明要求保护一种蛋白质，命名为tawlt14.2蛋白，具体可为tawlt14.2-a1蛋白、tawlt14.2-b1蛋白和/或tawlt14.2-d1蛋白。

所述tawlt14.2-a1蛋白可为如下任一所示蛋白质：

(a1)氨基酸序列为seqidno.1的蛋白质；

(a2)将seqidno.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

所述tawlt14.2-b1蛋白可为如下任一所示蛋白质：

(b1)氨基酸序列为seqidno.2的蛋白质；

(b2)将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(b3)与(b1)-(b2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(b4)在(b1)-(b3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

所述tawlt14.2-d1蛋白可为如下任一所示蛋白质：

(d1)氨基酸序列为seqidno.3的蛋白质；

(d2)将seqidno.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(d3)与(d1)-(d2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(d4)在(d1)-(d3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

第二方面，本发明要求保护编码前文所述蛋白质(tawlt14.2蛋白)的核酸分子。

进一步地，编码所述tawlt14.2-a1蛋白的核酸分子可为如下(a1)-(a3)中任一所述的dna分子：

(a1)seqidno.4所示的dna分子；

(a2)在严格条件下与(a1)限定的dna分子杂交且编码所述tawlt14.2-a1蛋白的dna分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述tawlt14.2-a1蛋白的dna分子。

进一步地，编码所述tawlt14.2-b1蛋白的核酸分子可为如下(b1)-(b3)中任一所述的dna分子：

(b1)seqidno.5所示的dna分子；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且编码所述tawlt14.2-b1蛋白的dna分子；

(b3)与(b1)或(b2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述tawlt14.2-b1蛋白的dna分子。

进一步地，编码所述tawlt14.2-d1蛋白的核酸分子可为如下(d1)-(d3)中任一所述的dna分子：

(d1)seqidno.6所示的dna分子；

(d2)在严格条件下与(d1)限定的dna分子杂交且编码所述tawlt14.2-d1蛋白的dna分子；

(d3)与(d1)或(d2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述tawlt14.2-d1白的dna分子。

上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

第三方面，本发明要求保护含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如plgy-02、pcambia-1300-221、pgreen0029、pcambia3301、pcambia1300、pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia1301-ubin或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛素基因ubiquitin启动子(pubi)、胁迫诱导型启动子rd29a等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

第四方面，本发明要求保护前文所述蛋白质或所述核酸分子或所述表达盒或所述重组载体或所述重组菌在调控植物对条锈病抗性中的应用。

在所述应用中，前文所述蛋白质(tawlt14.2蛋白)或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量降低，植物对条锈病抗性降低；前文所述蛋白质(tawlt14.2蛋白)或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物对条锈病抗性提高。

第五方面，本发明要求保护一种培育对条锈病抗性改变的植物品种的方法，为方法i或方法ii：

方法i：一种培育对条锈病抗性提高的植物品种的方法，可包括使受体植物中前文所述蛋白质(tawlt14.2蛋白)的表达量和/或活性提高的步骤。

所述方法中，一般情况下，只要在受体植物中提高其中一个tawlt14.2蛋白(即tawlt14.2-a1蛋白、tawlt14.2-b1蛋白或tawlt14.2-d1蛋白)的表达量和/或活性，就会有对条锈病抗性提高的表型。

方法ii：一种培育对条锈病抗性降低的植物品种的方法，可包括使受体植物中前文所述蛋白质(tawlt14.2蛋白)的表达量和/或活性降低的步骤。

所述方法中，一般情况下，需要在受体植物中同时降低三个tawlt14.2蛋白(即tawlt14.2-a1蛋白、tawlt14.2-b1蛋白和tawlt14.2-d1蛋白)的表达量和/或活性，就会有对条锈病抗性降低的表型。

第六方面，本发明要求保护一种培育对条锈病抗性改变的转基因植物的方法，为方法iii或方法iv：

方法iii：一种培育对条锈病抗性提高的转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达前文所述蛋白质(tawlt14.2蛋白)的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对条锈病抗性提高。

所述方法中，一般情况下，只要在受体植物中过表达其中一个tawlt14.2蛋白(即tawlt14.2-a1蛋白、tawlt14.2-b1蛋白或tawlt14.2-d1蛋白)的编码基因，所得转基因植物就会有对条锈病抗性提高的表型。

其中，向所述受体植物中导入能够表达前文所述蛋白质(tawlt14.2蛋白)的核酸分子，可通过任何能够实现这一目的技术手段实现。

在本发明的具体实施方式中，具体是通过向所述受体植物中导入含有能够前文所述蛋白质(tawlt14.2蛋白)的核酸分子的重组载体实现的。所述重组载体具体为将能够表达前文所述蛋白质(tawlt14.2蛋白)的核酸分子插入到plgy-02载体后得到的重组质粒。

方法iv：一种培育对条锈病抗性降低的转基因植物的方法，可包括如下步骤：对受体植物中能够表达前文所述蛋白质(tawlt14.2蛋白)的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对条锈病抗性降低。

所述方法中，一般情况下，需要在受体植物种对三个tawlt14.2蛋白(即tawlt14.2-a1蛋白、tawlt14.2-b1蛋白和tawlt14.2-d1蛋白)的编码基因同时进行抑制表达，才会有对条锈病抗性降低的表型。

其中，对所述受体植物中能够表达前文所述蛋白质(tawlt14.2蛋白)的核酸分子进行抑制表达，可通过任何能够实现这一目的技术手段实现。

在本发明的一个具体实施方式中，具体是通过向所述受体植物中导入bsmv病毒载体α、bsmv病毒载体β和重组bsmv病毒载体γ来实现的；所述重组bsmv病毒载体γ含有seqidno.6自5'端第9-219位所示的dna分子或含有seqidno.6自5'端第10-113位所示的dna分子。

其中，seqidno.6自5'端第9-219位所示的dna分子或含有seqidno.6自5'端第10-113位所示的dna分子与seqidno.4和seqidno.5相应片段相比，均有连续超过21个碱基的同源片段，可以干扰seqidno.4和seqidno.5序列的稳定。因此，向所述受体植物中导入bsmv病毒载体α、bsmv病毒载体β和所述重组bsmv病毒载体γ后，所述受体植物中的所述tawlt14.2-a1、tawlt14.2-b1和tawlt14.2-d1三个蛋白的编码基因的表达均会受到抑制。

在本发明的一个具体实施方式中，具体是通过crisper/cas9技术实现的；以前文所述蛋白质(tawlt14.2蛋白)的编码基因的基因组片段中符合5’-nx-ngg-3’或5’-ccn-nx-3’序列排列规则的片段为靶序列；n表示a、g、c和t中的任一种，14≤x≤30，且x为整数，nx表示x个连续的脱氧核糖核苷酸。更加具体的，在本发明的一个具体实施例中，所述靶序列具体为5’-cttgaatggtgctggtaccggtaa-3’(seqidno.4-6的第176-195位)。

在上述各方面中，所述对条锈病抗性提高体现均可体现为：提高受体植物中前文所述蛋白质(tawlt14.2蛋白)的表达量和/或活性后，植株上的条锈病菌孢子数增多。

在上述各方面中，所述对条锈病抗性降低均可体现体现为：降低受体植物中前文所述蛋白质(tawlt14.2蛋白)的表达量和/或活性后，植株上的条锈病菌孢子数减少。

在上述各方面中，所述条锈病均可为由条锈病菌(blumeriagraminisf.sp.tritici)生理小种cyr17和/或cyr33引起的条锈病。所述条锈病菌均可为条锈病菌(blumeriagraminisf.sp.tritici)生理小种cyr17和/或cyr33。

在上述各方面中，所述植物均可为单子叶植物。进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。更进一步地，所述禾本科植物可为小麦。

在本发明的具体实施方式中，所述小麦具体为小麦品种水原11(抗条锈菌系cyr17的品种)或小麦品种fielder(感条锈菌系cyr33的品种)。

实验证明，通过病毒诱导的基因沉默或者通过crispr/cas9技术降低tawlt14.2基因在小麦叶片中的表达，使小麦品种水原11对无毒条锈菌小种cyr17的侵染由抗病变成了感病。由此证明小麦的tawlt14.2基因参与了小麦对条锈菌的抗性调控。进一步，在小麦品种fielder中过量表达tawlt14.2基因，提高小麦中tawlt14.2基因的表达水平，使小麦品种fielder对毒性条锈菌小种cyr33的侵染由感病变成了抗病。可见，tawlt14.2基因能够调控小麦对条锈病抗性。本发明对于培育高抗条锈病小麦品种具有重要意义。

附图说明

图1为bsmv-vigs下调tawlt14.2基因表达后普通小麦品种水原11叶片中tawlt14.2基因的相对表达量。示沉默片段tawlt14.2-1和tawlt14.2-2均可极显著下调tawlt14.2基因的表达，“**”代表p≤0.01。mock：模拟接种的空白对照植株；bsmv:gfp：转gfp基因的阴性对照植株；bsmv:tawlt14.2-1和bsmv:tawlt14.2-2分别代表利用沉默片段tawlt14.2-1和沉默片段tawlt14.2-2下调tawlt14.2基因表达的植株。

图2为bsmv-vigs下调tawlt14.2基因表达的水原11植株接种无毒小麦条锈菌生理小种cyr17后14天的叶片表型。示下调tawlt14.2基因表达的水原11失去对cyr17的抗性，沦为高感(反应型为3-4)。mock：模拟接种的空白对照植株；bsmv:gfp：转gfp基因的阴性对照植株；bsmv:tawlt14.2-1和bsmv:tawlt14.2-2分别代表利用沉默片段tawlt14.2-1和沉默片段tawlt14.2-2下调tawlt14.2基因表达的植株。

图3为crispr/cas9系统中针对tawlt14.2基因的sgrna活性检测。wlt14.2表示靶标tawlt14.2基因的sgrna。+agei/bshti表示分别以ptau6-wlt14.2-sgrna载体质粒(wlt14.2)转化的原生质体dna为模板和野生型(wt)原生质体dna为模板进行pcr扩增得到的tawlt14.2基因片段，加入agei/bshti酶进行酶切反应处理。红色箭头示突变条带。

图4为三个crispr/cas9编辑tawlt14.2基因的水原11转基因系的基因编辑类型示意图。红线标注的是pam位点，橙线标注的是wlt14.2基因编辑所用的引导序列(wlt14.2-sg)，用“+”或者“-”代表插入或者删除事件，数字代表插入或者删除的碱基数目,“……”代表省略的碱基。su11代表受体小麦品种水原11野生型序列；t1-171-1.2，t1-173-1.9和t1-671-1为经过crispr/cas9编辑tawlt14.2基因后的t1代小麦转基因系的序列。

图5为crispr/cas9编辑tawlt14.2基因的水原11植株接种cyr17后的叶片表型。示tawlt14.2基因编辑的水原11失去了对无毒条锈菌生理小种cyr17的抗性，反应型为3-4级，属感病表型。同期，未经基因编辑的对照植株叶片无孢子堆出现，表现为免疫或近免疫，反应型为0～0；级。su11：受体小麦品种水原11；t1-171-1.2，t1-173-1.9和t1-671-1为经过crispr/cas9编辑tawlt14.2基因后的t1代小麦转基因系。

图6为tawlt14.2基因在过表达转基因小麦中的相对表达量。示在过表达转基因植株中tawlt14.2的表达量较对照植株显著提高。oewlt14.2-l4、oewlt14.2-l6和oewlt14.2-l10代表3个不同的转基因系；null为转基因阴性系；wt代表受体小麦品种fielder。

图7为过表达tawlt14.2基因的感病小麦品种fielder接种生理小种cyr33后的叶片表型。示过表达tawlt14.2基因的fielder对条锈菌小种cyr33的抗性显著提高，反应型由高感变为中抗到高抗，不同株系的反应型为0；～2级。oewlt14.2-l4，oewlt14.2-l6和oewlt14.2-l10为3个不同的过表达转基因株系null为转基因后为发现wlt14.2转基因阴性系；wt代表受体小麦品种fielder。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的bsmv-vigs病毒载体(包括α、β和γ质粒)和重组的γ-gfp质粒在文献“holzbergs,brosiop,grossc,pogueg.barleystripemosaicvirus-inducedgenesilencinginamonocotplant.plantj.,2002,30:315-327.”中公开过。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验室用，不得他用。

下述实施例中的条锈菌(blumeriagraminisf.sp.tritici)生理小种cyr17，cyr33在文献“hux,lij,wangy,wangb,liq,kangz,yangm,pengy,liut,chenw,etal.racecompositionofpucciniastriiformisf.sp.triticiintibet,china.plantdis,2012,96,1615-1620.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验室用，不得他用。

下述实施例中的小麦品种水原11(triticumaestivumvar.suwon11)在文献“杨作民.小麦对条锈病抗性遗传的研究.作物学报，1981，7(2)：81-90。”中公开过。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验室用，不得他用。

下述实施例中的小麦品种fielder(triticumaestivumvar.fielder)在文献“尹米琦，张双喜，范春捆，王坤杨，王静，王轲，杜丽璞，叶兴国.不同化学试剂和处理方式加倍小麦单倍体植株的效果.中国农业科学，2018，51(5)：811-820。”中公开过。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验室用，不得他用。

下述实施例中的质粒ptau6、pjit163-2nlscas9和pjit163-gfp在文献“shanqw,wangyp,lij,gaocx.genomeeditinginriceandwheatusingthecrispr/cassystem.natureprotocols,2014,9(10):2395-2410.”中公开过。小麦幼胚转化由转化平台完成。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验室用，不得他用。

下述实施例中的质粒plgy-02在文献“梁芳，刘亦菲，崔钟池，王海燕，刘大群.利用农杆菌介导法快速鉴定小麦病程相关蛋白基因tapr1的功能.河北农业大学学报，2019，42(2)：12-17。”中公开过。小麦幼胚转化由转化平台完成。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验室用，不得他用。

文中所述对于小麦条锈病抗病性的反应型分级标准，在文献“lizq,shanghs.wheatrustsandtheircontrol.1989,shanghaiscienceandtechnologypress,shanghai,china.”中有详细描述，按照0-4级反应型将条锈病抗病性分为无症状，为免疫级(0级)；产生枯死斑点或失绿反应，不产生夏孢子堆，为近免疫级(0；级)；夏孢子堆很小，数量很少，周围有枯死反应，为抗病级(1级)；夏孢子堆小到中等，周围有枯死和失绿反应，为中抗级(2级)；夏孢子堆中等大小，周围无枯死反应，但有轻微失绿现象，为中感级(3级)；夏孢子堆大而且多，无枯死反应，失绿现象不明显，为感病级(4级)。

下述实施例中的gkpbuffer含有50mm甘氨酸(glycine)、30mmk2hpo4(ph9.2)、1％(质量百分比)膨润土(bentonite)和1％(质量百分比)硅藻土(celite)。

实施例1、tawlt14.2基因cdna和dna序列的克隆

1、小麦cdna和基因组序列的获得

(1)小麦基因组dna和总rna的提取

取0.2g新鲜小麦叶片，放入装有钢珠的2ml离心管中，用液氮速冻后，在组织研磨仪中将材料研磨成粉末。加入0.8ml裂解液(1％sls(十二烷基肌氨酸钠)，417mmtris/hclph8.0，417mmnacl，83mmedta)，剧烈震荡，涡旋充分混匀，冰上静置10min，使细胞充分裂解。向离心管中加入与裂解液等体积的提取液(tris饱和酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1，体积比)，缓慢摇匀至乳浊液，冰上(或室温)静置10min，12000rpm离心10min，将上清液移至新的离心管中。重复此操作一次。吸取上清液至另一个1.5ml离心管，加入上清液0.6倍体积的预冷异丙醇，充分混匀，于-20℃沉淀30min。4℃，10000rpm离心10min后，弃上清，加入1ml75％乙醇洗涤沉淀两次，每次4℃，10000rpm离心5min后弃上清。然后用无水乙醇洗涤，离心后弃上清，倒置离心管，室温干燥dna。向干燥的dna中加入100μl的te缓冲液，待dna充分溶解后按1/1000的比例加入rnasea，消解rna。用nanodrop微量核酸蛋白分析仪测定dna样品的浓度与纯度，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定dna的完整性。

采用rna提取试剂盒提取普通小麦品种水原11和小麦品种fielder的总rna。rna提取试剂盒购自pexbio公司(货号：a010400)，具体的提取操作步骤和条件要求按照产品说明书进行。

(2)rna的反转录

利用takara公司的反转录试剂盒(货号：rr047a)对上述步骤(1)中获得的小麦叶片总rna进行反转录，获得cdna。具体的操作步骤和条件要求按照产品说明书进行。

2、tawlt14.2基因dna和cdna序列的pcr扩增与测序

以上述步骤(1)中获得的dna为模板，利用引物对wltcds-f和wltcds-r，以水原11(抗条锈菌菌系cyr17)基因组dna为模板进行pcr扩增。

pcr反应体系：dna模板0.5μl(<0.5μg)，dntp(2.5mm)4μl，wltcds-f(10μm)1μl，wltcds-r(10μm)1μl，5×transstartfastpfubuffer10μl，transstartfastpfudnapolymerase1μl(2.5u)，最后用水补足至50μl。pcr反应程序：95℃预变性2min；然后95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸20s，35个循环；最后72℃延伸5min。

wltcds-f：5’-atggcaaagtatctcgccgtcg-3’；

wltcds-r：5’-tcatgggtgagcagggatccc-3’。

将上述pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶分离纯化后连接到-bluntzerocloningvector(transgencb501)载体上，得到重组质粒peasy-t-tawlt14.2，转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，并用通用引物m13f对细菌单克隆进行一代测序。

大量测序结果表明，pcr扩增得到的长度为240bp的dna序列即为普通小麦的3条tawlt14.2基因组全长序列，经过序列分析，tawlt14.2的基因组dna序列不包含内含子，其序列分别如seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示。

以上述步骤1中获得的cdna为模板，利用引物对wltcds-f和wltcds-r，以水原11(抗条锈菌生理小种cyr17)cdna为模板进行pcr扩增。

wltcds-f：5’-atggcaaagtatctcgccgtcg-3’；

wltcds-r：5’-tcatgggtgagcagggatccc-3’。

pcr反应体系：cdna模板0.5μl，dntp(2.5mm)4μl，wltcds-f(10μm)1μl，wltcds-r(10μm)1μl，5×transstartfastpfubuffer10μl，transstartfast(10μm)1μl，qcbhlhr2(10μm)1μl，5×transstartfastpfubuffer10μl，transstartfastpfudnapolymerase1μl(2.5u)，最后用水补足至50μl。pcr反应程序：95℃预变性2min；然后95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸20s，35个循环；最后72℃延伸5min。

将上述pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶分离纯化后连接到-bluntzerocloningvector(transgencb501)载体上，得到重组质粒peasy-t-tawlt14.2，转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，并用通用引物m13f对细菌克隆进行一代测序。

大量测序结果表明，pcr扩增得到的长度为240bp的cdna序列即为普通小麦的3条tawlt14.2基因的编码区全长序列，其序列分别如seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示。

三个不同的基因拷贝分别命名为tawlt14.2-1a、tawlt14.2-1b和tawlt14.2-1d，tawlt14.2基因三个拷贝的基因编码区全长序列分别为seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6。相应地将tawlt14.2基因编码的蛋白分别命名为tawlt14.2-1a、tawlt14.2-1b和tawlt14.2-1d蛋白。tawlt14.2-1a蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示；tawlt14.2-1b蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示；tawlt14.2-1d蛋白的氨基酸序列如seqidno.3所示。

实施例2、利用bsmv-vigs实验下调tawlt14.2基因的表达

一、沉默tawlt14.2基因小麦的获得

1、诱导tawlt14.2基因下调bsmv-vigs载体系统的构建

(1)根据实施例1中tawlt14.2基因序列(seqidno.6)，选取了两个不同长度沉默片段，一个片段具体位置为+9bp～+219bp，长211bp，命名为沉默序列tawlt14.2-1，利用引物对v-tawlt14.2-f1和v-tawlt14.2-r1进行pcr扩增获得。另一个片段起始于+10bp，到+113bp结束，长104bp，命名为沉默序列tawlt14.2-2，利用引物对v-tawlt14.2-f2和v-tawlt14.2-r2进行pcr扩增获得。

v-tawlt14.2-f1：5’-attgctagcgtatctcgccgtcgcgct-3’；

v-tawlt14.2-r1：5’-taagctagcagcgggccggtaatggt-3’。

v-tawlt14.2-f2：5’-attgctagcgtatctcgccgtcgcgct-3’；

v-tawlt14.2-r2：5’-taagctagcggcaccggcaccgcgtg-3’。

下划线序列即为限制性内切酶nhei的酶切识别位点。

(2)按照常规分子生物学方法，参见“颜子颖，王海林译《精编分子生物学实验指南》，2001，科学出版社”中的方法进行载体构建。具体操作步骤如下所述。

将上述步骤(1)获得的沉默序列tawlt14.2-1和tawlt14.2-2分别反向插入bsmv-vigs病毒载体γ的nhei酶切位点处，且保持其它序列不变，得到重组载体γ-tawlt14.2-1和γ-tawlt14.2-2。

以引物对v-tawlt14.2-f1和γ-strain-p对重组载体γ-tawlt14.2-1进行pcr扩增和测序鉴定，阳性克隆即为将seqidno.6自5’末端起第9-219位核苷酸的序列按基因表达的相反方向插入bsmv-vigs病毒载体γ链的nhei酶切位点处，且保持其它序列不变的tawlt14.2基因沉默载体γ-tawlt14.2-1。

以引物对v-tawlt14.2-f2和γ-strain-p对重组载体γ-tawlt14.2-2进行pcr扩增和测序鉴定，阳性克隆即为将seqidno.6自5’末端起第10-113位核苷酸的序列按基因表达的相反方向插入bsmv-vigs病毒载体γ链的nhei酶切位点处，且保持其它序列不变的tawlt14.2基因沉默载体γ-tawlt14.2-2。

γ-strain-p：5’-caactgccaatcgtgagtagg-3’。

bsmv-vigs病毒载体α、β和γ-gfp载体共同构成病毒载体系统bsmv:gfp。

bsmv-vigs病毒载体α、β和重组载体γ-tawlt14.2-1共同构成可沉默tawlt14.2基因的病毒沉默载体系统bsmv:tawlt14.2-1。

bsmv-vigs系统载体α、β和重组载体γ-tawlt14.2-2共同构成可沉默tawlt14.2基因的病毒沉默载体系统bsmv:tawlt14.2-2。

2、bsmv体外转录

(1)用mlui酶切bsmv病毒载体α、γ-gfp载体、重组载体γ-tawlt14.2-1和重组载体γ-tawlt14.2-2，用spei酶切bsmv病毒载体β，分别得到线性化质粒。

(2)以上述步骤(1)获得的线性化质粒为模板进行体外转录，分别得到体外转录的bsmv病毒载体α、β、γ-gfp、γ-tawlt14.2-1和γ-tawlt14.2-2。体外转录反应按照ribomax^tmlargescalernaproductionsystem-t7(promega公司产品，货号：p1300)说明书进行操作。转录反应体系和条件分别为：反应总体积20.0μl，包括线性化质粒(1.0μg)和无rnase水共6.5μl，5×transcriptionbuffer4.0μl，m7g(5')ppp(5')g1.5μl(promega公司产品，货号：p1718)，rntppremix6.0μl，enzymemix2.0μl，37℃反应4h，转录产物置-70℃保存备用。其中rntppremix是由试剂盒中四种试剂datp(100mm)15μl，dctp(100mm)15μl，dutp(100mm)15μl，dgtp(100mm)1.2μl，及13.8μlddh2o混合而成。

3、bsmv接种

将小麦品种水原11播种于营养土中，待生长至二叶期，各取8μlbsmv:tawlt14.2-1重组病毒载体溶液和bsmv:tawlt14.2-2重组病毒载体溶液分别涂抹接种于水原11平展的第二叶上，10min后用灭菌超纯水喷施叶面，覆保鲜膜保湿24h，之后转为22℃正常条件培养，分别得到转bsmv:tawlt14.2-1植株和bsmv:tawlt14.2-2植株。同时，部分植株接种bsmv:gfp重组病毒载体溶液，得到转bsmv:gfp植株，部分植株涂抹1×gkpbuffer，得到模拟接种植株。

上述bsmv:tawlt14.2-1重组病毒载体溶液是将体外转录的bsmv-vigs载体α、β和γ-tawlt14.2-1经无rnase水稀释3倍后等量混合，再加入等体积的2×gkpbuffer得到的溶液。

上述bsmv:tawlt14.2-2重组病毒载体溶液是将体外转录的bsmv-vigs载体α、β和γ-tawlt14.2-2用无rnase水稀释3倍后等体积混合，再加入等体积的2×gkpbuffer得到的溶液。

上述bsmv:gfp重组病毒载体溶液是将体外转录的bsmv-vigs载体α、β和γ-gfp用无rnase水稀释3倍后等体积混合，再加入等体积的2×gkpbuffer得到的溶液。

上述转bsmv:tawlt14.2-1和bsmv:tawlt14.2-2的植株即为沉默tawlt14.2基因的小麦植株，转bsmv:gfp的植株即为阴性对照植株，涂抹1×gkpbuffer的模拟接种植株即为空白对照植株。

4、沉默tawlt14.2基因小麦的rt-pcr验证

bsmv-vigs系统沉默tawlt14.2基因效果的具体检测方法如下：将上述步骤3)获得的转bsmv:tawlt14.2-1植株和bsmv:tawlt14.2-2植株、转bsmv:gfp植株及模拟接种植株(mock)在正常条件下培养10天后，取第三叶提取总rna，反转录后通过定量pcr检测tawlt14.2基因的相对表达量，设置taef-1α为内参基因，相对表达量通过δδct法计算得到，由abi7500型荧光定量pcr仪自带计算公式计算。

qtawlt14.2-f：5’-tgaaccagaaggaccaggcact-3’；

qtawlt14.2-r：5’-cgagatgatcatgggtgagcagggat-3’。

qtaef-f：5’-tggtgtcatcaagcctggtatggt-3’；

qtaef-r：5’-actcatggtgcatctcaacggact-3’。

引物对qtawlt14.2-f和qtawlt14.2-r可以同时检测tawlt14.2-1a、tawlt14.2-1b和tawlt14.2-1d三个基因的相对表达量。

tawlt14.2基因的相对表达量的检测结果如图1所示。从图可以看出，与转bsmv植株以及mock植株相比，转bsmv:tawlt14.2-1和转bsmv:tawlt14.2-2植株中tawlt14.2基因的相对表达量较阴性对照植株(bsmv:gfp)和空白对照植株(mock)都极显著地降低了，说明本实验所选择的两个沉默片段tawlt14.2-1和tawlt14.2-2都是有效的。

二、tawlt14.2基因沉默植株的条锈病抗性分析

将有效沉默了tawlt14.2基因表达的植株(bsmv:tawlt14.2-1和bsmv:tawlt14.2-2)、阴性对照植株(bsmv:gfp)，以及空白对照植株(mock)在第三叶展开后(约14天龄)接种条锈病菌菌系cyr17(收集新鲜小麦条锈病菌夏孢子0.1g，放于培养皿中加入50ml清水，并加入25μl吐温20，用玻璃棒轻轻搅拌，后导入喷壶中，摇匀，配成孢子悬浮液。用喷壶将配好的孢子悬浮液在上述处理的小麦叶片上均匀喷雾接种。避光保湿24小时后放置在22℃培养室中进行条锈病培养)，接种14天后观察第三叶发病情况。

结果如图2所示。模拟接种的空白对照植株(mock)的叶片没有任何症状，反应型为0级(免疫)，有个别坏死斑。转bsmv:gfp的阴性对照植株叶片可见明显的病毒过敏反应(hr)斑，但没有孢子产生，反应型为0-0；级，表现为免疫或近免疫。而tawlt14.2基因沉默效果明显的转bsmv:tawlt14.2-1植株和转bsmv:tawlt14.2-2植株没有明显的抗病反应，出现大量的条锈病菌孢子堆，反应型为3-4级，呈高感表型。

以上结果表明tawlt14.2基因表达量的降低使得水原11对条锈病菌菌系cyr17的抗性完全丧失，沦为高感。由此证明tawlt14.2是一个参与小麦抗条锈病反应过程的重要基因。

实施例3、利用crispr/cas9基因编辑方法敲除水原11内源tawlt14.2基因

一、tawlt14.2基因编辑植株的获得

1、tawlt14.2基因编辑引导序列引物设计

为保证基因功能沉默的有效性，针对tawlt14.2序列搜索ngg(或ccn)pam序列。再根据ptau6载体的bbsi酶切位点序列，连同pam及其上游(或下游)19-20nt的碱基序列，一起设计为sgrna(singleguiderna)引物wlt14.2-sg-f和wlt14.2-sg-r。

wlt14.2-sg-f：5’-cttgaatggtgctggtaccggtaa-3’；

wlt14.2-sg-r：5’-aaacttaccacgaccatggccatt-3’。

下划线部分为agei/bshti的识别位点。

为进行后续的酶切检测，设计跨越sgrna部分的pcr扩增引物gwlt14.2-f和gwlt14.2-r，用于检测sgrna引导活性及突变效果。

gwlt14.2-f：5’-agggagctgaaccagaagg-3’；

gwlt14.2-r：5’-agaactgcaaagaaatacagatgac-3’。

为了同时扩增到tawlt14.2基因三个成员，从3’的非翻译区部分(utr)设计了反向引物gwlt14.2-r。

2、载体构建

将引物wlt14.2-sg-f和wlt14.2-sg-r用ddh2o稀释成10μm，然后分别取9μl，并加入2μlddh2o，配成20μl反应体系，于普通pcr仪上，按照程序94℃，5min，90-10℃，每1min降10℃，对寡核苷酸序列进行退火，退火产物于冰上放置备用。ptau6载体用bbsi限制性内切酶，按照以下方法进行酶切、检测和载体构建：5μlbuffer，2μgptau6载体质粒，1μlbbsi(20u/μl)，加ddh2o至50μl，混合均匀，于37℃反应30min，加入10μl6×gelloadingdye终止反应；用1％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化；用t4dna连接酶将退火后的sgrnawlt14.2与酶切过的ptau6载体连接，构建成基因编辑载体ptau6-wlt14.2-sgrna。

3、sgrna引导活性检测

将ptau6-wlt14.2-sgrna载体质粒与pjit163-2nlscas9质粒用peg法共转化普通小麦品种科农199的原生质体，并用单转pjit163-gfp质粒的小麦原生质体作为阳性对照，23℃培养48h。在荧光显微镜下观察原生质体状态并通过统计有荧光信号的原生质体数目来计算转化效率。原生质体饱满且呈圆形，转化效率在70％以上，即可以进行后续检测实验。

离心收集培养48h后的原生质体，用植物基因组dna提取试剂盒(tiangen公司产品，货号：dp305)提取基因组dna。然后用检测引物gwlt14.2-f和gwlt14.2-r扩增包含突变目标区域的基因片段。取5μlpcr反应产物，然后在反应产物中加入0.5μl(2.5units)的agei/bshti核酸内切酶，37℃消解1h。消解产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。以ptau6-wlt14.2-sgrna载体质粒转化的原生质体dna为模板进行pcr扩增得到的tawlt14.2基因片段，经agei/bshti酶切后，电泳图谱中出现与未酶切处理的pcr产物片段(对照)大小一致的条带，表明相应酶切位点发生了突变(图3)。说明在ptau6-wlt14.2-sgrna载体质粒转化的小麦原生质体中tawlt14.2基因发生了突变，即这说明ptau6-wlt14.2-sgrna确实具有引导活性。

4、tawlt14.2基因编辑植株的获得

用步骤2构建的基因编辑载体质粒ptau6-wlt14.2-sgrna与pjit163-2nlscas9共转化水原11的幼胚，经愈伤组织诱导和分化培养，水原11再生植株。转化过程由中国科学院遗传与发育生物学研究所遗传转化平台完成，公众可商业化联系该平台完成转化。按照步骤3中的检测方法，用引物对gwlt14.2-f和gwlt14.2-r对全部再生植株进行目标基因突变检测(实施例3，步骤一，步骤3)，将获得的t0代突变株系，于4℃冷室春化4周，然后移栽到营养土中进行常规培养。t0代植株经自交获得t0代tawlt14.2基因编辑植株的种子。

二、tawlt14.2基因编辑植株的抗条锈病鉴定

1、一代测序检测tawlt14.2基因编辑植株中tawlt14.2基因的编辑类型

将上述步骤1中获得的t1代种子，分别播种于10cm分别播种于方形花盆中，对生长7天左右的t1代基因编辑株系及对照株系，剪取叶片，按照实施例一中的方法，进行dna提取，以提取的基因编辑dna作为模板，使用引物gwlt14.2-f和gwlt14.2-r实施pcr扩增(实施例3，步骤3)，将pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶分离纯化后连接到-bluntzerocloningvector(transgencb501)载体上，得到重组质粒peasy-t-gtawlt14.2，转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，并用通用引物m13f对细菌克隆进行一代测序。三个t1代tawlt14.2基因编辑代表单株测序结果如图4所示，三个代表单株的tawlt14.2基因abd三拷贝均被编辑，且同一拷贝有不同的编辑类型。

2、tawlt14.2基因编辑植株条锈病抗性检测

对生长10天左右的水原11tawlt14.2基因编辑植株及其空白对照株系进行条锈菌菌系cyr17的接菌(同实施例2步骤二)，14天后观察叶片表型。大量接菌鉴定结果如图5所示。对照植株叶片上几乎没有条锈菌孢子的出现(反应型为0～0；级)，tawlt14.2基因编辑t1代株系叶片上则有大量的条锈菌孢子堆出现(反应型为3-4级)。

以上结果表明，水原11基因组tawlt14.2基因alleles的突变，可以使tawlt14.2基因的表达显著下调，使水原11由抗条锈菌系cyr17转为感条锈菌系cyr17。由此证明小麦tawlt14.2基因参与小麦对条锈病的抗性过程，对小麦抗性育种具有利用价值。

实施例4、利用农杆菌介导的转基因方法在fielder中过表达tawlt14.2基因

一、tawlt14.2基因过表达植株的获得

1、tawlt14.2基因过表达载体引物设计和载体构建

为验证tawlt14.2基因在小麦抗条锈病中的功能，本发明以玉米泛素启动子(ubi1)驱动(plgy-02中自带的启动子)，将tawlt14.2-d1构建至plgy-02载体。设计过表达载体引物oewlt14.2-f和oewlt14.2-r。

oewlt14.2-f：5’-tctagaggatccccgggtaccatggcaaagtatctcgccgtc-3’；

oewlt14.2-r：5’-ttcgagctctctagaactagttcatgggtgagcagggatcc-3’。

pcr反应体系：实施例1中得到的seqidno.6序列产物dna0.5μl(<0.5μg)，dntp(2.5mm)4μl，oewlt14.2-f(10μm)1μl，oewlt14.2-r(10μm)1μl，5×transstartfastpfubuffer10μl，transstartfastpfudnapolymerase1μl(2.5u)，最后用水补足至50μl。pcr反应程序：95℃预变性2min；然后95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸5min。扩增产物oewlt14.2(seqidno.6)于冰上放置备用。

plgy-02质粒预先利用kpni和spei限制性内切酶进行酶切线性化：5μlbuffer，2μgplgy-02载体质粒，1μlkpni和1μlspei(20u/μl)，加ddh2o至50μl，混合均匀，于37℃反应30min，加入10μl6×gelloadingdye终止反应；用1％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化；利用诺唯赞(vazyme，货号：c115)一步法重组试剂盒进行重组连接：1μl上述酶切回收后的线性化plgy-02，4μl上述全长片段oewlt14.2，50℃反应5min，构建成基因过表达载体plgy-02-wlt14.2。

重组表达载体plgy-02-wlt14.2经测序可知其结构描述为：将seqidno.6所示dna片段插入到plgy-02载体的酶切位点kpni和spei之间后所得重组质粒。

2、tawlt14.2过表达植株的获得

用步骤1构建的基因过表达载体质粒plgy-02-wlt14.2转化至农杆菌菌株eha105，用以侵染普通小麦品种fielder的幼胚。小麦幼胚经愈伤组织诱导和分化培养，同时用潮霉素进行筛选获得了再生植株，通过实时荧光定量pcr鉴定(实施例2，步骤一，步骤4)，获得t0代阳性植株，在阳性植株中有3个株系oewlt-t0-4,oewlt-t0-6和oewlt-t0-10中tawlt14.2的表达较高，同时确定了一个阴性植株oewlt-t0-15(null)。因此这四个系用于后续的研究分析。转化过程由济南邦地生物工程有限公司完成，公众可商业化联系该平台完成转化。将获得的t0代突变株系，移栽到营养土中进行常规培养。t0代植株经自交2次获得t1代tawlt14.2基因过表达植株的种子。

二、tawlt14.2基因过表达植株的抗条锈病鉴定

1、荧光定量pcr检测tawlt14.2基因过表达植株中tawlt14.2基因的表达

将上述步骤一中获得的t1代种子，分别播种于10cm方形花盆中，对生长7天左右的t2代过表达株系及对照株系，剪取叶片，按照实施例1和实施例2中的方法，进行rna提取、rna反转录和荧光定量pcr，检测tawlt14.2基因的相对表达量(实施例2，步骤一，步骤4)。定量pcr检测结果如图6所示，与空白对照相比，tawlt14.2基因的表达量在t2代过表达植株中显著提高。

2、tawlt14.2基因过表达植株条锈病抗性检测

对生长10天左右的fielder野生型、tawlt14.2基因过表达植株及其null株系进行条锈菌菌系cyr33的接菌(同实施例2步骤二)，14天后观察叶片表型。大量接菌鉴定结果如图7所示。对照植株叶片上有大量条锈菌孢子的出现，tawlt14.2基因过表达t2代株系出现大量坏死，只有少量条锈菌孢子出现(反应型由高感变为高抗到中抗，不同株系的反应型为0；～2级)。

以上结果表明，在小麦中过量表达tawlt14.2基因，使小麦品种fielder由感条锈菌系cyr33转为抗条锈菌系cyr33。由此证明小麦tawlt14.2基因参与小麦对条锈病的抗性过程，对小麦抗性育种具有利用价值。

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>小麦抗条锈病相关蛋白tawlt14.2及其编码基因与应用

<130>gncln200095

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>79

<212>prt

<213>artificialsequence

<400>1

metalalystyrleualavalalaleuleuleuleuvalalaleuala

151015

tyrcysaspglyarggluleuasnglnlysaspglnalaleualathr

202530

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354045

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505560

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<210>2

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<212>dna

<213>artificialsequence

<400>4

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