一种能够检测铜离子和焦磷酸根的荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种能够检测铜离子和焦磷酸根的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

由于生物体中许多的酶在不同程度上会与金属离子发生反应，因此金属离子在生物的代谢过程中起着非常重要的作用，其中铜离子对人体健康起着至关重要的作用。饮用水中要求铜离子＜1.3mg/l；人体摄入的铜离子过量则会导致铜中毒，而缺乏铜离子则会导致贫血和冠心病等疾病；铜离子代谢紊乱，则会导致细胞内稳态破坏、肝硬化、阿尔茨海默病、威尔逊病、神经紊乱、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、低血糖和阅读障碍等。

另一方面焦磷酸根(ppi)是各种生活反应过程中的重要代谢产物，在柠檬酸和atp的水解、dna的复制、环腺苷酸(c-amp)的生成等过程中具有重要作用。足量的ppi可阻断滑膜液、血浆和尿液中的钙化，可作为细胞外液中羟基磷灰石形成的天然抑制剂。许多研究表明，ppi在关节炎和软骨钙质沉着病中起着关键作用。

因此铜离子和ppi的检测都有着极其重要的意义。目前铜离子的检测已建立了多种方法，n纳米传感法(liu,l.；fang,z.；zheng,x.；xi,d.,nanopore-basedstrategyforsensingofcopper(ii)ionandreal-timemonitoringofaclickreaction.acssensors2019,4(5),1323-1328)、荧光法(jo,j.；lee,h.y.；liu,w.；olasz,a.；chen,c.-h.；lee,d.,reactivity-baseddetectionofcopper(ii)ioninwater:oxidativecyclizationofazoaromaticsasfluorescenceturn-onsignalingmechanism.j.am.chem.soc.2012,134(38),16000-16007)、比率光声法(wang,s.；yu,g.；ma,y.；yang,z.；liu,y.；wang,j.；chen,x.,ratiometricphotoacousticnanoprobeforbioimagingofcu²⁺.acsappl.mater.inter.2019,11(2),1917-1923)、比色法(shi,y.；wang,r.；yuan,w.；liu,q.；shi,m.；feng,w.；wu,z.；hu,k.；li,f.,easy-to-usecolorimetriccyanineprobeforthedetectionofcu²⁺inwilson’sdisease.acsappl.mater.inter.2018,10(24),20377-20386)等，同时ppi的检测检测也建立了多种分析方法，kumar等人(kumar,v.；kumar,p.；kumar,s.；singhal,d.；gupta,r.,turn-onfluorescentsensorsfortheselectivedetectionofal³⁺(andga³⁺)andppiions.inorg.chem.2019,58(15),10364-10376)、feng等人(feng,x.；an,y.；yao,z.；li,c.；shi,g.,aturn-onfluorescentsensorforpyrophosphatebasedonthedisassemblyofcu²⁺-mediatedperylenediimideaggregates.acsappl.mater.inter.2012,4(2),614-618)开发的荧光增强法；chen等人(chen,c.；zhao,d.；sun,j.；yang,x.,colorimetriclogicgateforpyrophosphateandpyrophosphataseviaregulatingthecatalyticcapabilityofhorseradishperoxidase.acsappl.mater.inter.2016,8(43),29529-29535)、dey等人(dey,s.；sukul,p.k.,selectivedetectionofpyrophosphateanionsinaqueousmediumusingaggregationofperylenediimideasafluorescentprobe.acsomega2019,4(14),16191-16200)开发的比色法，li等人、liu等人(li,f.；liu,y.；zhuang,m.；zhang,h.；liu,x.；cui,h.,biothiolsaschelatorsforpreparationofn-(aminobutyl)-n-(ethylisoluminol)/cu²⁺complexesbifunctionalizedgoldnanoparticlesandsensitivesensingofpyrophosphateion.acsappl.mater.inter.2014,6(20),18104-1811)开发的电化学发光法。其中荧光分析法因其具有操作简便、稳定性强、信号灵敏、选择性高等优点在分析化学领域引起了人们的重视。

因此为了能够采用荧光分析方法达到同时检测铜离子(cu²⁺)和焦磷酸根(ppi)的目的，需要开发一种新的荧光探针来达到上述目的。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种能够检测铜离子和焦磷酸根的荧光探针；本发明的目的之二在于提供一种能够检测铜离子和焦磷酸根的荧光探针的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种能够检测铜离子和焦磷酸根的荧光探针在检测铜离子方面的应用；本发明的目的之四在于提供一种能够检测铜离子和焦磷酸根的荧光探针在检测焦磷酸根方面的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种能够检测铜离子和焦磷酸根的荧光探针，所述荧光探针的结构式如下：

2、上述荧光探针的制备方法，、所述方法的反应通式为：

优选的，所述反应具体为：

将4-羟基伞形酮、多聚甲醛和脯氨酸，混合溶解于乙醇或者甲醇中，在油浴中加热回流反应12～14h，反应结束后将反应产物过滤，烘干，即可得到所述荧光探针。

优选的，所述4-羟基伞形酮、多聚甲醛和脯氨酸的物质的量比是0.8～1.0:1～1.1:0.8～1.0。

优选的，所述加热回流的温度为78℃以上。

3、上述荧光探针在检测铜离子方面的应用。

4、上述的荧光探针在检测焦磷酸根方面的应用。

优选的，所述应用中的荧光探针首先与铜离子配位形成cu²⁺-荧光探针。

本发明的有益效果在于：本发明合成了一种能够检测铜离子(cu²⁺)和焦磷酸根的荧光探针，由于荧光探针分子中存在n原子与o原子，能够与cu²⁺发生配位作用形成化合物cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)，降低了荧光探针本身的共轭性能，使荧光探针的荧光强度发生荧光猝灭；同时因为cu²⁺与焦磷酸根的配位能力比荧光探针(probe)更强，因此在同时存在荧光探针(probe)与焦磷酸根(ppi)的情况下，铜离子(cu²⁺)优先与焦磷酸根配位，从而导致恢复荧光探针的结构，增强荧光强度；铜离子(cu²⁺)可在瞬间猝灭荧光探针的荧光，且荧光信号的猝灭程度与铜离子浓度在0.01～0.8μm范围内呈良好的线性关系；焦磷酸根可在瞬间将cu²⁺猝灭的荧光恢复，且荧光信号的恢复程度与焦磷酸根的浓度在2～40μm范围内呈良好的线性关系。说明本发明的荧光探针可同时应用于铜离子和焦磷酸根的高选择性灵敏检测。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为实施例1中制备的荧光探针(probe)氢谱表征结果；

图2为实施例1中制备的荧光探针(probe)碳谱表征结果；

图3为实施例1中制备的荧光探针(probe)溶液在可见光(a)和紫外灯(b)照射下的图片；

图4为实施例1中制备的荧光探针(probe)溶液的紫外荧光图谱；

图5为铜离子(cu²⁺)和焦磷酸根(ppi)对实施例1中制备的荧光探针(probe)的荧光强度的影响；

图6为不同ph值的溶液中铜离子(cu²⁺)对实施例1中制备的荧光探针(probe)的荧光强度的影响；

图7为不同反应时间下铜离子(cu²⁺)对实施例1中制备的荧光探针(probe)的荧光强度的影响；

图8为不同反应温度下铜离子(cu²⁺)对实施例1中制备的荧光探针(probe)的荧光强度的影响；

图9为不同浓度的铜离子(cu²⁺)对实施例1中制备的荧光探针(probe)的荧光强度的影响(a)以及线性关系(b)；

图10为不同金属离子对荧光探针(probe)的荧光强度的影响；

图11焦磷酸根(ppi)对不同浓度的铜离子(cu²⁺)形成的cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)荧光强度的影响；

图12为不同反应时间下焦磷酸根(ppi)对cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)荧光强度的影响；

图13为不同反应温度下焦磷酸根(ppi)对cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)荧光强度的影响；

图14为不同浓度的焦磷酸根(ppi)对cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)荧光强度的影响(a)以及线性关系(b)；

图15为不同阴离子对cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)的荧光强度的影响。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

制备一种能够检测铜离子和焦磷酸根的荧光探针(probe)，其反应式如下：

具体的反应步骤为：将1.50g的4-羟基伞形酮、0.28g的多聚甲醛和1.08g的脯氨酸，混合溶解于乙醇中，在油浴中加热到78℃以上进行回流反应过夜；反应结束后将反应产物过滤，烘干，即可得到一种能够检测铜离子和焦磷酸根的荧光探针(probe)。

制备过程中4-羟基伞形酮、多聚甲醛和脯氨酸的物质的量比在0.8～1.0:1～1.1:0.8～1.0之间均可进行相应的反应得到上述能够检测铜离子和焦磷酸根的荧光探针(probe)，其中反应的中采用的乙醇溶剂也可以替换成甲醇溶剂。

实施例2

测试实施例1中合成制备的荧光探针(probe)的核磁共振和光谱特征：

荧光探针(probe)的氢谱和碳谱表征结果分别如图1和图2所示，图中氢谱和碳谱的数据结果如下：¹hnmr(300mhz,d2o)δ＝7.60(d,j＝8.8hz,1h),6.88(d,j＝8.8hz,1h),6.11(s,1h),4.44(s,2h),3.92(m,1h),3.73(m,1h),3.27(m,1h),2.44(m,1h),2.32(s,3h),2.10(m,1h),1.96(m,2h)ppm；¹³cnmr(100mhz,d2o)δ＝173.5,163.5,159.7,156.8,152.8,128.4,112.9,112.8,109.9,104.1,68.5,55.3,46.6,29.1,23.3,18.1ppm，该数据证明实施例1中制备的荧光探针(probe)的结构确实为

将荧光探针(probe)溶于ph＝7.4的浓度为40mm的pbs缓冲溶液中形成浓度为0.05μm的溶液，在可见光照射下为无色透明溶液，如图3中比色皿a所示，在紫外灯照射下为蓝色荧光溶液，如图3中比色皿b所示。

将荧光探针(probe)溶液进行紫外检测，激发波长为300～340nm，得到激发光谱图，从而确定荧光探针(probe)的最大激发波长为316nm；在最大激发波长的条件下进行荧光检测，得到荧光光谱图，具体如图4所示。从图4可以看出荧光探针(probe)的最大激发波长为316nm，最大发射波长为445nm。

实施例3

铜离子(cu²⁺)和焦磷酸根(ppi)对荧光探针(probe)荧光的影响：

将荧光探针(probe)溶解在ph＝7.4的pbs缓冲溶液中得到浓度为0.05μm的荧光探针溶液(probe)，然后加入铜离子(cu²⁺)使cu²⁺浓度为0.5μm(probe+cu²⁺)，继续加入焦磷酸根(ppi)使ppi的浓度为180μm(probe+cu²⁺+ppi)。分别以316nm为激发波长、445nm为发射波长，测试得到三种溶液的荧光强度，其结果如图5所示。从图5中荧光强度的变化可以看出，加了cu²⁺后，探针在445nm处的荧光强度由450左右降至100左右，淬灭效果明显，猝灭效率约为78％，说明了该荧光探针可以通过荧光猝灭法检测cu²⁺；继续加入180μm的焦磷酸根(ppi)，体系的荧光再次增强。其原因在于cu²⁺与荧光探针(probe)中含有的n和o原子通过配位左右进行连接形成化合物cu²⁺-probe，从而破坏了探针分子本身的共轭效应，使其荧光淬灭，而向的含有化合物cu²⁺-probe的溶解中继续加入焦磷酸根(ppi)，由于ppi与cu²⁺的配位作用强于cu²⁺与probe，因此，溶液中的cu²⁺优先与ppi配位，破坏化合物cu²⁺-probe，使得溶液的荧光继续增强。因此，说明荧光探针(probe)可以用于荧光猝灭法检测cu²⁺、荧光增强法检测ppi。

实施例4

不同的条件对荧光探针(probe)荧光猝灭法检测铜离子(cu²⁺)的影响：

1、溶液中ph值对淬灭效率的影响

将荧光探针(probe)分别溶解在ph为5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、8.5的pbs缓冲溶液中，得到不同ph值的浓度为40mm的荧光探针溶液，加入浓度为0.3μm的cu²⁺反应10min，在25℃下分别检测其在316nm为激发波长、445nm为发射波长下的荧光强度，其结果如图6所示。从图6的结果可以看出，在ph值为5.8～8.5的溶液中，cu²⁺均可以在一定程度上降低荧光探针(probe)的荧光强度，并且随着溶液中ph值的增大，其淬灭效果逐渐增强，在ph＝8.5与ph＝7.4时铜离子对荧光探针的猝灭效率达到最大，约为70％。

2、铜离子(cu²⁺)与荧光探针(probe)的反应时间对淬灭效率的影响

在其它条件相同的情况下(溶剂为pbs缓冲液、ph值为7.4、荧光探针浓度为0.05μm、cu²⁺浓度为0.3μm、检测温度为25℃)，测试向荧光探针(probe)溶液中是加入铜离子(cu²⁺)分别反应0min、5min、10min、20min和30min后的荧光强度变化，其结果如图7所示。从图7中显示的荧光强度对比可以看出荧光探针(probe)和加入的cu²⁺的荧光强度基本一致，不受反应时间的影响，铜离子(cu²⁺)与荧光探针(probe)反应时间对淬灭效率的影响不大，说明铜离子(cu²⁺)与荧光探针(probe)反应形成配合物的速度较快，且无论是荧光探针(probe)还是化合物cu²⁺-probe都具有较好的稳定性。

3、铜离子(cu²⁺)与荧光探针(probe)的反应温度对淬灭效率的影响

在其它条件相同的情况下(溶剂为pbs缓冲液、ph值为7.4、荧光探针浓度为0.05μm、cu²⁺浓度为0.3μm)，测试在不同温度(25℃、37℃和50℃)下向荧光探针(probe)溶液中是加入铜离子(cu²⁺)后反应后的荧光强度变化，其结果如图8所示。从图8中显示的荧光强度对比可以看出不同温度下的荧光探针(probe)和加入的cu²⁺后的荧光强度基本一致，不受反应温度的影响，铜离子(cu²⁺)与荧光探针(probe)反应温度的变化对淬灭效率的影响不大，说明铜离子(cu²⁺)与荧光探针(probe)反应形成配合物的速度较快，且无论是荧光探针(probe)还是化合物cu²⁺-probe都具有较好的稳定性。

4、铜离子(cu²⁺)浓度对荧光探针(probe)的荧光强度的影响(灵敏性检测)

在其它条件相同的情况下(溶剂为pbs缓冲液、ph值为7.4、荧光探针浓度为0.05μm、反应温度为25℃、反应时间为5min、激发波长为316nm；发射波长为445nm)，测试不同的cu²⁺浓度(0nm、10nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm、200nm、400nm、600nm、800nm)对荧光探针(probe)荧光强度淬灭效率的影响，其荧光强度的变化如图9中a所示。从荧光强度变化可以看出，随着cu²⁺浓度从0.01～0.8μm的逐渐增加，荧光探针的荧光强度相应的逐渐降低，说明在cu²⁺浓度能够在很大程度上影响荧光猝灭法中的效率，并存在相应的线性关系。根据cu²⁺浓度和荧光强度的变化拟合得到的线性校准图如图9中b所示，其线性方程为i＝88.93-129.66lnc(μm)(其中i为荧光强度，c为cu²⁺浓度(μm))，相关系数(r)为0.993。从图9可以看出本发明的探针对铜离子的检测具有较高的灵敏度，能够与浓度的0.01～0.8μm的发生配位作用。

5、荧光探针(probe)对铜离子(cu²⁺)的选择性研究

在其它条件相同的情况下(溶剂为pbs缓冲液、ph值为7.4、荧光探针浓度为0.05μm、金属离子浓度为0.3μm、反应温度为25℃、反应时间为5min、激发波长为316nm；发射波长为445nm)，测试不同金属离子(cu²⁺、na⁺、k⁺、ca²⁺、zn²⁺、mg²⁺、pb²⁺、hg²⁺、fe³⁺、al³⁺、ni²⁺、co²⁺)对荧光探针(probe)的荧光强度的影响，其结果如图10所示。从图10可以看出，在不同金属离子(cu²⁺、na⁺、k⁺、ca²⁺、zn²⁺、mg²⁺、pb²⁺、hg²⁺、fe³⁺、al³⁺、ni²⁺、co²⁺)中只有加入铜离子(cu²⁺)，荧光探针(probe)的荧光强度才出现明显的淬灭效果，说明荧光探针(probe)对铜离子(cu²⁺)具有良好的选择性。

实施例5

不同的条件对cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)荧光增强法检测焦磷酸根(ppi)的影响：

1、不同的铜离子(cu²⁺)浓度对cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)荧光强度的影响

首先将不同的铜离子(cu²⁺)浓度(0μm、0.1μm、0.3μm、0.5μm、0.7μm、0.9μm)与浓度为0.05μm的荧光探针(probe)形成cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)，然后加入浓度20μm为焦磷酸根(ppi)，在其它条件相同(溶剂为ph＝7.4的40mm的pbs缓冲溶液、温度为25℃、激发波长为316nm、发射波长为445nm)下测试前后的荧光强度变化，其结果如图11所示。由图11可以看出cu²⁺浓度从0.1μm增加到0.5μm时，ppi对cu²⁺-probe的荧光恢复效果逐渐增强，0.5μm到0.9μm时，恢复效果逐渐减弱，其中cu²⁺浓度为0.5μm时ppi对cu²⁺-probe的荧光增强效果最为明显。

2、焦磷酸根(ppi)与cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)的反应温度对增强效率的影响

向ph＝7.4的40mm的pbs缓冲溶液中加入荧光探针(probe)(浓度为0.05μm)和cu²⁺(0.5μm)形成cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)，加入焦磷酸根(ppi)(浓度为20μm)，分别在25℃、37℃和50℃下反应10min，在激发波长为316nm、发射波长为445nm下测试其荧光强度的变化，其结果如图12所示。可以看出ppi与cu²⁺-probe的反应温度对荧光强度基本无影响，说明ppi、probe与cu²⁺之间配位能力的强弱基本与反应的温度无关。

向ph＝7.4的40mm的pbs缓冲溶液中加入荧光探针(probe)(浓度为0.05μm)和cu²⁺(0.5μm)形成cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)，在25℃加入焦磷酸根(ppi)(浓度为20μm)，在激发波长为316nm、发射波长为445nm下测试反应0min、2min、5min、10min、15min、25min、30min时的荧光强度的变化，其结果如图13所示。可以看出ppi与cu²⁺-probe的反应时间对荧光强度基本无影响，说明ppi与cu²⁺之间配位能力较强，反应速度快。

3、焦磷酸根(ppi)浓度对cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)的荧光强度的影响(灵敏性检测)

在相同的条件(溶剂为40mm的pbs缓冲液、ph值为7.4、荧光探针浓度为0.05μm、铜离子浓度为0.5μm、反应温度为25℃、反应时间为5min、激发波长为316nm；发射波长为445nm)下，测试加入不同的浓度(0μm、2μm、5μm、8μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm)的ppi对cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)荧光强度增强效率的影响，其荧光强度的变化如图14中a所示。从荧光强度变化可以看出，随着ppi浓度从0～40μm的逐渐增加，cu²⁺-荧光探针的荧光强度相应的逐渐增大，说明在ppi浓度能够在很大程度上影响荧光增强法中的效率，并存在相应的线性关系。根据ppi浓度和荧光强度的变化拟合得到的线性校准图如图14中b所示，i＝4.20c+147.18(其中i为荧光强度，c为ppi浓度(μm))，相关系数(r)为0.991。从图14可以看出本发明的探针与cu²⁺配位形成的cu²⁺-荧光探针对ppi的检测具有较高的灵敏度，在溶液中较小浓度的ppi同样能够与cu²⁺-荧光探针中的cu²⁺优先配位。

4、cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)对焦磷酸根(ppi)的选择性研究

在相同的条件(溶剂为40mm的pbs缓冲液、ph值为7.4、荧光探针浓度为0.05μm、铜离子浓度为0.5μm、反应温度为25℃、反应时间为5min、阴离子浓度为40μm，激发波长为316nm；发射波长为445nm)下，测试不同阴离子(cl^-、no3^-、co3^2-、po4^3-、hpo4^2-、h2po4^-、hco3^-、so4^2-和焦磷酸根)对cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)的荧光强度的影响，其结果如图15所示。从图15可以看出，在不同阴离子(cl^-、no3^-、co3^2-、po4^3-、hpo4^2-、h2po4^-、hco3^-、so4^2-和焦磷酸根)中只有加入焦磷酸根(ppi)，cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)的荧光强度才出现明显的增强效果，说明cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)对铜离子(cu²⁺)具有良好的选择性。

综上所述，本发明合成了一种荧光探针(probe)，不仅能够通过荧光猝灭法高效灵敏地检测cu²⁺，而且在铜离子存在下形成的cu²⁺-荧光探针(cu²⁺-probe)，还可以通过荧光增强法高效灵敏地检测焦磷酸根(ppi)。上述检测的原理在于：含羧基的荧光探针与cu²⁺发生配位作用，使荧光探针本身的共轭作用较弱，导致其荧光猝灭；而由于ppi与cu²⁺结合配位能力更强，在同时存在荧光探针(probe)和焦磷酸根(ppi)的情况下，cu²⁺优先与ppi配位，导致探针本身的共轭结构回复，使荧光强度增强。由此可见，本发明的荧光探针可以作为一个很好的检测探针，能够同时用于cu²⁺和ppi的检测。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。