一种苹果花叶病的高效快速检测方法与流程

本发明涉及植物保护领域及分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种苹果花叶病的高效快速检测方法。

背景技术：

我国是苹果生产大国，多年来种植面积和总产量均居世界首位。然而我国陕西、山东、北京等苹果产区病毒病发生普遍，不同病毒病复合侵染率达90％以上，导致减产20-30％，商品果率降低25％以上，病毒病害已成为严重影响果品产量和品质的主要因素之一。苹果树被病毒侵染后终生带毒，目前尚无有效的药剂去除。病毒在果树体内增殖，干扰、破坏树体的正常生理机能，导致长势减退，产量下降，品质变劣。其中，苹果花叶病是苹果生产中最常见的病毒性病害之一，严重制约着我国苹果产业的健康发展。为从源头杜绝苹果花叶病害，针对病毒病原进行检测，以获得无病毒接穗和无病毒苗木，成为我国苹果产业的重大技术需求。

目前，已鉴定的可导致苹果发生花叶病害的病毒主要包括李属坏死环斑病毒(prunusnecroticringspotvirus，pnrsv)、苹果坏死花叶病毒(applenecroticmosaicvirus，apnmv)和苹果花叶病毒(applemosaicvirus，apmv)。采用实时荧光定量pcr技术进行病毒核酸检测，是现今最为可靠和应用最多的方法，具有准确、灵敏、快速等突出优势。然而，由于田间苹果植株上普遍存在多种病毒复合侵染现象，利用常规检测方法只能针对单一病毒甚至单一病毒株系进行检测，逐一检测多种病毒和病毒株系不仅工作量大、成本高，而且难以兼顾病毒突变株系多的特性，容易造成漏检(即假阴性)。

针对上述苹果病毒检测中存在的问题，我们通过对genbank数据库中已知的pnrsv、apnmv、apmv病毒及其突变体核酸序列的比对分析，发现该3类病毒外壳蛋白(coatprotein，cp)的核酸序列存在保守区，适用于进行一次性检测(兼容检测)，以减少现有实时荧光定量pcr检测方法的时间、工作量和成本。由此，本发明通过设计针对该3种病毒序列保守区的特异简并引物，优化与检测引物配套的实时荧光定量pcr检测体系，建立了一种苹果花叶病的高效快速检测方法，为苹果花叶病的田间检测及无病毒苗木的繁育和检疫提供了技术保障。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种苹果花叶病的高效快速检测方法。

本方法所检测的对象为与苹果花叶病症有关的3种苹果病毒，包括李属坏死环斑病毒(pnrsv)、苹果坏死花叶病毒(apnmv)和苹果花叶病毒(apmv)。

所述检测方法为实时荧光定量pcr检测，该pcr检测方法中使用下述2个特异脱氧核苷酸核酸序列seqidno.1、seqidno.2作为简并引物，在检测体系中成对使用，seqidno.1、seqidno.2序列如下：

seqidno.1：5’–gagaggttggcagttsgwascycc-3’

seqidno.2：5’–cactyaccactaygtamawatcc-3’

其中，s＝g/c；w＝a/t；y＝c/t；m＝a/c。

所述pcr检测采用10μl反应体系，包括sybr反应液5.0μl，10pm/μlseqidno.1、seqidno.2引物溶液各0.5μl，待测苹果样品cdna模板1.0μl，rnase-free水3.0μl。

所述待测苹果样品cdna模板的制取方法为：提取待测苹果样品的总rna，反转录为cdna。

所述pcr检测的反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性15s，60℃退火15s，40次循环，每次循环第2步进行荧光采集；最后退火至65℃，每隔30s上升0.5℃至95℃变性1min，采集荧光强度，绘制溶解曲线。

所述检测方法包括判定步骤即根据溶解曲线tm值判断带毒情况，具体为当tm值介于81.0-83.0℃时，则待测苹果样品为苹果花叶病植株；当tm值不在81.0-83.0℃区间，则待测苹果样品为无苹果花叶病的植株。

所述待测苹果样品来自于苹果植株的叶片、枝条、花或果实。

本发明还提供根据上述方法制备的试剂盒。

与现有检测方法相比，本发明具有以下优点：

(一)本方法可一次性检测导致苹果花叶病症的3种苹果病毒，将现有技术至少需要3次或3次以上才能完成的检测一次性就可实现，减少了工作量、检测时间和检测成本；

(二)本方法中检测所用的简并引物能够特异性识别genbank数据库中的221种pnrsv、所有的16种apnmv和24种apmv核酸序列，其中包含了我国发现的所有病毒核酸序列。与现有方法相比，采用了专门用于针对多种病毒及其变种核酸序列的简并引物对，扩大了现有方法的检测对象范围(从每次检测1种病毒增加到每次检测3类病毒)，能够兼容检测花叶病症相关的病毒变种，可有效避免假阴性，降低漏检风险；

(三)本方法中的pcr检测反应体系、反应条件和检测引物对经过了系统优选，使目标病毒核酸的检出限达到1×10¹拷贝/μl，与传统检测方法相比，提高了检测灵敏度；

(四)本方法经过阳性样本实时荧光定量pcr产物测序验证、检测阴性样本sirna高通量测序验证，证明了本发明所述检测方法的准确性和稳定性；

(五)本发明采用的实时荧光定量pcr法，通过对溶解曲线tm值进行判读，相较于传统核酸染色后依赖肉眼观察，易观察、易判断、易定性，可稳定用于实际生产中苹果花叶病的检测。

附图说明

图1为苹果花叶病相关病毒外壳蛋白核酸序列比对及保守区分析，

其中a为核酸序列保守区检测引物区域选择；b为检测引物区域碱基保守性分析；

图2为苹果花叶病分子检测特异简并引物优选；

其中a为12个候选引物组合引物二聚体分析；b为f2/r3引物组合扩增效率分析；c为f2/r3引物组合检测灵敏度分析；d为f2/r3引物组合检测溶解曲线分析；图中1-8分别表示：以10倍浓度梯度依次为1×10⁷-1×10¹拷贝/μl的pnrsv外壳蛋白核酸序列重组质粒和空白对照作为模板的实时荧光定量pcr反应。

图3为宫藤富士检测阴性脱毒苗sirna高通量测序分析，

其中a为sirna序列不同数据库注释维恩图；b为鉴定出的不同类型病毒/株系进化关系分析。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或制造厂商说明书建议的条件进行。

下述实施例中涉及的微生物实验材料，本申请人实验室均有保存，可以对外发放。

实施例1苹果花叶病检测方法的建立

1.1主要试剂

easyspin植物rna提取试剂盒(北京博迈德科技发展有限公司)，反转录cdna合成试剂盒(宝生物工程大连有限公司)，sybr反应液(宝生物工程大连有限公司)，引物合成(北京擎科新业生物技术有限公司)，克隆载体pmd19-t及其他常规试剂(北京蕾创生物科技有限公司)。

1.2实时荧光定量pcr反应

(1)提取待测苹果叶片、枝条、花或果实样品的总rna，反转录为cdna；

(2)反应体系：sybr反应液5.0μl、10pm/μlseqidno.1、seqidno.2引物溶液各0.5μl，、cdna模板1.0μl、rnase-freewater3.0μl，共计10μl；

(3)反应条件：反应于bio-radcfx384thermalcycler荧光定量pcr仪上进行，采用两步pcr法，即95℃预变性3min，94℃变性15s，60℃退火15s，40次循环，每次循环第2步进行荧光采集；最后退火至65℃，每隔30s上升0.5℃至95℃变性1min，采集荧光强度，绘制溶解曲线，利用cfxmanager3.1软件进行数据分析。

1.3特异简并引物设计

从ncbigenbank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)数据库中下载所有pnrsv、apnmv、apmv病毒的外壳蛋白(cp)核酸序列，应用mega6.0软件clustalw进行比对，去除cp序列完全一致的病毒株系，最终获得共261种cp序列，其中包含有221种pnrsv、16种apnmv和24种apmv；再通过邻位相连法(neighbor-joining)进行了聚类分析。根据核酸序列的保守性及实时荧光定量pcr引物的设计原则，即扩增片段长度不小于80bp、引物两端保守性较强、引物长度18bp以上、无连续3个以上单一碱基等，选择上、下游检测引物设计的选择区域amrv-fregion和amrv-rregion(图1中a)。对选定的引物设计区域通过在线软件weblogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)进行该261个cp序列间的碱基保守性分析(图1中b)。

依据图1中b中amrv-fregion和amrv-rregion的碱基保守性设计简并引物，原则上引物前2个和后2个碱基非简并碱基、中间简并碱基不连续、单条引物简并碱基不超过5个、引物末端以c或g结尾等，分别设计了上游引物3个、下游引物4个，即12组候选引物对(表1)。

表1苹果花叶病相关病毒分子检测候选引物

其中，m＝a/c；r＝a/g；w＝a/t；s＝g/c；y＝c/t。

1.4特异简并引物优选

从引物二聚体、扩增效率和灵敏度三个方面对12个候选引物组合进行筛选。

依照“1.2实时荧光定量pcr反应”方法，在无cdna模板情况下进行，检测是否出现非特异性溶解曲线。结果显示有f1、r1和r2引物存在的各组合均出现杂峰，发生引物二聚体扩增(图2中a)，由此淘汰f1、r1和r2相关的8组候选引物组合。

为检测引物组合的扩增效率与灵敏度，将从富士苹果花叶病叶片中克隆的pnrsv外壳蛋白基因片段构建至pmd19-t载体，并将t质粒按10倍倍比稀释成1×10⁷-1×10¹拷贝/μl，共7个浓度，作为模板分别进行各引物组合的实时荧光定量pcr反应。结果显示，f2/r3引物组合扩增相关系数r²达0.999，扩增效率e达110.9％(图2中b)；检测低限可达1×10¹拷贝/μl(图2中c)；tm值82.5℃，溶解曲线稳定；优于其他候选引物组合。

由此，确定f2/r3引物组合(seqidno:1/2)为针对pnrsv、apnmv、apmv三类苹果花叶病相关病毒的实时荧光定量pcr检测的高效特异简并引物。

实施例2苹果花叶病检测的田间应用

2.1检测对象

2018年6月，对北京市林业果树科学研究院本部和试验基地苹果园的共13个苹果品种或砧木叶片进行采集，并应用本发明方法进行苹果花叶病的检测。

2019年3月，对上述苹果品种或砧木花叶病阳性植株进行高温脱毒；2019年5-8月，对通过脱毒嫩梢嫁接获得的各脱毒苗植株，应用本发明方法进行苹果花叶病的初检、复检。

2.2检测结果

对田间的13个苹果品种或砧木检测显示，富士、嘎啦、王林、红乔纳金、砧木sh6等多年树龄的苹果植株无论是否显现花叶症状，均检测呈阳性；而砧木八棱海棠实生苗和进口砧木m9-t337、g935脱毒苗检测均呈阴性。溶解曲线tm值出现81.0、82.5、83.0℃三种，表明至少存在三种苹果花叶病相关病毒株系。

表2不同苹果品种或砧木花叶病的检测情况

注：+表示阳性结果；-表示阴性结果。

2.3检测可靠性的验证

对田间检测阳性样本，回收实时荧光定量pcr检测产物并测序，获得pnrsv病毒新株系并进行了注册(genbankaccessionmf926636)；其他阳性产物均为已知的pnrsv或apnmv株系，未发现apmv株系；验证了本发明阳性检测结果的可靠性。

对检测阴性样本，包括：

(1)砧木八棱海棠、砧木g935(上述田间检测阴性样品)；

(2)宫藤富士、大卫嘎啦、砧木sh6脱毒苗(实验室保存的检测阴性脱毒苗)；

进行sirna高通量测序(北京诺禾致源科技股份有限公司)，经核酸测序数据比对分析，5种检测阴性样本均未发现pnrsv、apnmv、apmv核酸序列。如宫藤富士样本测序共检测到14种病毒序列，分属于13种病毒类型/株系，而无pnrsv、apnmv、apmv病毒(图3)；验证了本发明阴性检测结果的可靠性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。