一种榼藤细胞色素P450基因及其获得方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种榼藤细胞色素p450基因及其获得方法和应用。

背景技术：

榼藤(entadaphaseoloides)，为豆科榼藤子属植物，又名大血藤、过山枫、扁龙等。榼藤作为一种传统的中草药，具有抗炎、医治痛风性关节炎、抗氧化、抗糖尿病等功效。其主要药理活性成分为榼藤皂苷，即为三萜类皂苷。由于榼藤属植物资源稀缺，且其中的榼藤皂苷含量极低，故天然获得的榼藤皂苷远远无法满足临床需求。建立榼藤皂苷的合成生物学技术将是解决其供需矛盾的重要途径。

近年来，解析三萜皂苷合成途径的分子机制并利用代谢工程手段合成三萜皂苷已成为科学研究的热点。榼藤皂苷的生物合成途径分为三个阶段：(1)萜类前体化合物ipp和dmapp的合成；(2)榼藤皂苷骨架的构建；(3)骨架的后修饰。前两个阶段中的大部分酶基因已被鉴定出，但参与榼藤皂苷三萜骨架结构后修饰的细胞色素p450系基因及其功能尚未完全解析，这是目前全面建立榼藤皂苷合成生物学技术的主要难点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种榼藤皂苷生物合成细胞色素p450基因及其获得方法和应用。

本发明通过基因筛选，利用pcr方法扩增、并对产物测序、拼接，得到榼藤epcyp93e1基因全长；随后，对其进行生物信息学分析、测定该基因在榼藤不同器官根、茎、叶中的表达量变化、同时检测该基因对茉莉酸甲酯(meja)的响应情况，证实该基因在榼藤皂苷生物合成中所发挥的作用。

具体地，本发明的第一方面提供一种榼藤细胞色素p450基因epcyp93e1，其核苷酸序列如seqidno：1所示。其cds全长为1542bp，编码513个氨基酸。

本发明的第二方面提供一种榼藤皂苷生物合成相关蛋白，该榼藤皂苷生物合成相关蛋白由上述榼藤细胞色素p450基因epcyp93e1编码，其氨基酸序列如seqidno：2所示。该榼藤皂苷生物合成相关蛋白的氨基酸序列包含有细胞色素p450氧化酶典型的保守结构域。

本发明的第三方面提供一种上述榼藤细胞色素p450基因epcyp93e1的获得方法，包括如下步骤：

1)提取榼藤幼嫩叶片样本的总rna；

2)以步骤1)中所提取的rna反转录得到的cdna作为模板，进行pcr扩增，得到榼藤epcyp93e1基因的cdna全长片段，在pcr扩增中所使用的特异性引物的核苷酸序列如下：

93e1-f：5’-atgctagatatccaaggctacttcg-3’(seqidno：3)

93e1-r：5’-tcaggcagcagaaaatggaac-3’(seqidno：4)

3)对步骤2)中所获得的pcr产物进行回收。

本发明的第四方面提供所述榼藤细胞色素p450基因epcyp93e1或所述榼藤皂苷生物合成相关蛋白在榼藤皂苷生物合成中的应用。

本发明的技术方案达到了如下的有益效果：

1)本发明的榼藤细胞色素p450基因epcyp93e1为榼藤中活性成分榼藤皂苷生物合成相关细胞色素p450氧化酶基因，本发明测定了该基因在榼藤不同器官根、茎、叶中的表达量变化及该基因对茉莉酸甲酯的响应情况，实验表明该基因的表达量与榼藤植物中榼藤皂苷的含量正相关，表明该基因参与榼藤皂苷的生物合成过程，该基因的克隆及研究对解析榼藤皂苷生物合成途径的分子机制具有参考价值。

2)本发明揭示了该基因在榼藤皂苷生物合成中所发挥的作用，该基因的获得为利用合成生物学技术大规模、低成本生产榼藤皂苷奠定基础。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1示出了野生榼藤幼嫩叶片rna完整性的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2示出了榼藤epcyp93e1基因的cds全长序列的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图3示出了epcyp93e1的保守结构域预测。

图4示出了epcyp93e1的跨膜结构域预测。

图5示出了epcyp93e1在榼藤不同器官根、茎、叶中的表达量差异。

图6示出了epcyp93e1受茉莉酸甲酯诱导的表达量差异。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

实施例1

本实施例以野生型榼藤cdna为模板，使用pcr方法克隆了细胞色素p450氧化酶基因，具体步骤如下：

1)以榼藤幼嫩叶片为材料，提取榼藤总rna。总rna的提取参照promegarna提取试剂盒说明书上的操作步骤，然后经1.5％含有染色液eb的琼脂糖凝胶进行电泳检测(如图1所示)，结果表明总rna提取成功。cdna的合成参照thermorevertaidfirststrandcdnasynthesiskit说明书上的操作步骤，分装后放于-20℃冰箱保存备用。

2)引物设计与pcr扩增：

在引物设计方面，课题组前期利用榼藤不同器官根、茎、叶转录组测序筛选到部分细胞色素p450酶基因序列，结合表达量差异、go注释及pathway代谢通路等的分析，发现p450氧化酶家族基因在榼藤皂苷生物合成途径中有着重要的作用。因此，以一条榼藤细胞色素p450氧化酶基因序列为基础，应用primer6.0软件设计特异性引物，其核苷酸序列如下：

93e1-f：5’-atgctagatatccaaggctacttcg-3’(seqidno：3)

93e1-r：5’-tcaggcagcagaaaatggaac-3’(seqidno：4)

其中，pcr的具体方法为：

a)pcr反应体系(25μl)：

10×pcrbuffer2.5μl，dntps(10mmol/l，各2.5mmol)2μl，上、下游引物(10mmol/l)各1μl，dna模板(50ng/l)1μl，takara-la高保真酶(5u/l)0.5μl，用ddh2o补至25μl。

b)pcr反应条件：

94℃预变性4min；95℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min；

c)pcr产物的回收、测序及序列分析：

pcr产物使用1％含有染色液eb的琼脂糖凝胶检测，在1542bp处出现特异性的目的条带(图2)，利用天根离心柱型琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收目的片段。将其连接与pmd19-t载体连接，16℃连接2-3小时，转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布到含有amp的lb琼脂平板培养基上37℃倒置过夜培养，形成单菌落。随机挑选单菌落，接种于含有amp的液体lb培养基中，震荡过夜培养，利用上海生工提供的载体通用m13引物进行扩增，鉴定阳性克隆后进行测序、拼接，得到榼藤epcyp93e1基因的cds全长序列。

实施例2

本实施例对实施例1中克隆获得的榼藤基因进行了生物信息学分析，通过聚类分析和氨基酸序列比对确定该基因属于细胞色素p450氧化酶基因家族，与豌豆中细胞色素p450氧化酶基因的同源性较高。具体如下：

通过pcr技术克隆获得一条cdna序列，长度为1542bp，编码513个氨基酸，命名为epcyp93e1，cdna序列核苷酸序列如seqidno：1所示。预测其蛋白分子量约为57.97kda，等电点为8.97，该蛋白具有seqidno：2所示的氨基酸序列。利用blastp预测epcyp93e1氨基酸序列的保守区(图3)，结果显示该序列含细胞色素p450典型保守结构域。利用tmhmm2.0server(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/)预测其跨膜结构域，结果显示含有1个跨膜区(7～25aa)，且其跨膜螺旋预期数为24.07617，因此推测该蛋白属于跨膜蛋白(图4)。

实施例3

本实施例利用实时荧光定量pcr分析表明epcyp93e1的表达量水平与榼藤植物中榼藤皂苷的含量相关，进一步确认其功能。具体如下：

1)分别剪取榼藤植物不同器官根、茎、叶，经液氮速冻后于-80℃冰箱中保存备用。三次重复。

2)配制0.1mmol/l茉莉酸甲酯溶液，均匀喷洒在植物叶片上，6h后摘取叶片经液氮速冻后于-80℃冰箱中保存备用。以均匀喷洒乙醇的植物叶片为对照组。三次重复。

3)分别提取各样品的总rna，通过nanodrop2000核酸测定仪测定浓度和纯度。在逆转录之前，对所提取的总rna浓度进行调整，使各样品所要进行逆转录的rna稀释到相同浓度，逆转录得到cdna。以β-actin基因为内参基因进行实时荧光定量pcr，每个实验三次重复，检测epcyp93e1在榼藤不同器官根、茎、叶中的表达差异及对茉莉酸甲酯诱导的响应情况。其中，新设计的榼藤β-actin和epcyp93e1的定量引物的核苷酸序列为：

β-actin-f：5’-ttggactgtgcctcatcacc-3’(seqidno：5)

β-actin-r：5’-cttccatcaccctcggcatt-3’(seqidno：6)

dl-93e1-f：5’-ctttgtcagcattcgcgagg-3’(seqidno：7)

dl-93e1-r：5’-atcagtggtcccgctactct-3’(seqidno：8)

荧光定量pcr反应体系(20μl)：2×sybrgreenqpcrmastermix10μl，上、下游引物(10mmol/l)各1μl，模板1μl，用ddh2o补至20μl。

荧光定量pcr反应条件：95℃预变性4min，95℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次；每个样品三次重复。

图5所示的结果表明，epcyp93e1在茎中的表达量较高。课题组前期研究结果表明，榼藤皂苷在茎中的含量较高，说明epcyp93e1的表达量与榼藤皂苷含量相关。茉莉酸甲酯因为其挥发性和分子特性，可以从植物的气孔进入植物体内，而促进植物次生代谢产物的合成。图6所示的结果表明，经茉莉酸甲酯诱导后，epcyp93e1基因的表达量明显升高，因此，证明该基因参与榼藤皂苷的生物合成过程。

本发明克隆得到的epcyp93e1基因不仅为揭示榼藤皂苷生物合成途径的分子机理提供了有价值的候选功能基因，也为利用合成生物学技术大规模、低成本地生产榼藤皂苷提供了重要的理论基础。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110>武汉轻工大学

<120>一种榼藤细胞色素p450基因及其获得方法和应用

<130>bji2000176whpu

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1542

<212>dna

<213>entadaphaseoloides

<400>1

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