Os516蛋白及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及os516蛋白及其编码基因和应用。

背景技术：

水稻原产于中国和印度。是世界主要粮食作物之一。中国水稻播种面占全国粮食作物的1/4，而产量则占一半以上。栽培历史已有14000～18000年。为重要粮食作物；除食用颖果外，可制淀粉、酿酒、制醋，米糠可制糖、榨油、提取糠醛，供工业及医药用；稻秆为良好饲料及造纸原料和编织材料，谷芽和稻根可供药用。

近年来，生物技术的迅速发展大大地推动了植物育种研究手段的革新与研究水平的不断提高，植物抗病虫、抗除草剂生物技术育种已开始进入实用化阶段。利用生物技术手段将外源杀虫、抗除草剂基因导入植物基因组内，打破了植物种属甚至物种之间难以杂交的天然屏障，实现了抗虫、抗除草剂基因的转移，从而使植物迅速地、定向地获得抗虫性及机械化除草，同时又能保留原有的良好农艺性状。由于转基因玉米的每株植株都具有相当程度的抗性，因而其抗虫、抗除草剂效果比人工防治防治效果要好且稳定，还能够节省人力和物力的投入，有效的节约社会资源。其他农艺性状改良转基因植物进展及应用不如抗虫、抗除草剂性状理想，主要是由于没有优良的性状改良基因，大多农艺性状主要是有一些微效的多基因控制所致，一直没有理想的基因进行操作。

技术实现要素：

本发明的目的是提供os516蛋白及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，命名为os516蛋白，获自水稻(oryzasativa)，为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；

(a2)在(a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；

(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物的株高和/或穗长相关的蛋白质；

(a4)来源于水稻且与(a1)具有98％以上同一性且与植物株高的和/或穗长相关的蛋白质。

标签具体如表1所示。

表1标签的序列

编码os516蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

编码os516蛋白的核酸分子具体可为rna分子或dna分子。

编码os516蛋白的dna分子，即os516基因。

编码os516蛋白的rna分子，即os516基因转录得到的rna分子。

所述os516基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：

(b1)编码区如序列表中序列2所示的dna分子；

(b2)序列表中序列3所示的dna分子；

(b3)来源于水稻且与(b1)或(b2)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的dna分子；

(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的dna分子。

上述严格条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

含有所述os516基因的表达盒、重组载体或重组微生物均属于本发明的保护范围。

本发明还保护os516蛋白的应用，为如下：调控植物的株高性状和/或穗长性状。

本发明还保护os516基因的应用，为如下：培育株高性状和/或穗长性状改变的转基因植物。

本发明还保护抑制os516蛋白的物质在植物育种的应用，所述育种的目标为如下：培育株高增高和/或穗长增长的植物。所述抑制os516蛋白为抑制os516蛋白的活性和/或降低os516蛋白的丰度。所述降低os516蛋白的丰度可通过使os516蛋白不能被表达实现。

本发明还保护抑制编码os516蛋白的核酸分子的物质在植物育种的应用，所述育种的目标为如下：培育株高增高和/或穗长增长的植物。所述抑制编码os516蛋白的核酸分子为抑制编码os516蛋白的核酸分子的活性和/或降低编码os516蛋白的核酸分子的丰度。降低编码os516蛋白的核酸分子的丰度可通过使rna不能被转录实现。降低编码os516蛋白的核酸分子的丰度可通过基因编辑实现。所述基因编辑具体可为基于cas9系统的基因编辑。cas9系统中，sgrna中的靶序列结合区如序列表的序列7所示。cas9系统中，sgrna如序列表的序列6所示。所述基因编辑具体通过在植物中导入重组质粒sg2027实现。

本发明还保护对os516基因进行基因编辑的物质在植物育种的应用，所述育种的目标为如下：培育株高增高和/或穗长增长的基因编辑植株。所述基因编辑具体可为基于cas9系统的基因编辑。对os516基因进行基因编辑的物质具体可为sgrna和cas9蛋白。对os516基因进行基因编辑的物质具体可为编码sgrna的dna分子和编码cas9蛋白的dna分子。对os516基因进行基因编辑的物质具体可为具有编码sgrna的dna分子的表达载体和具有编码cas9蛋白的dna分子的表达载体。对os516基因进行基因编辑的物质具体可为具有编码sgrna的dna分子和编码cas9蛋白的dna分子的表达载体。sgrna中的靶序列结合区如序列表的序列7所示。sgrna如序列表的序列6所示。编码sgrna的dna分子如序列表的序列5所示。对os516基因进行基因编辑的物质具体为重组质粒sg2027。

本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物中导入抑制os516基因表达的物质，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物株高增高和/或穗长增长。所述抑制os516基因表达的物质可为编码sgrna的dna分子和编码cas9蛋白的dna分子。所述抑制os516基因表达的物质具有编码sgrna的dna分子的表达载体和具有编码cas9蛋白的dna分子的表达载体。所述抑制os516基因表达的物质可为具有编码sgrna的dna分子和编码cas9蛋白的dna分子的表达载体。所述抑制os516基因表达的物质具体可为重组质粒sg2027。sgrna中的靶序列结合区如序列表的序列7所示。sgrna如序列表的序列6所示。编码sgrna的dna分子如序列表的序列5所示。对os516基因进行基因编辑的物质具体为重组质粒sg2027。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：对受体植物中的os516基因进行基因编辑，得到基因编辑植株；与所述受体植物相比，所述基因编辑植株的株高增高和/或穗长增长。对受体植物中的os516基因进行基因编辑具体通过cas9系统实现。cas9系统中，sgrna中的靶序列结合区如序列表的序列7所示。cas9系统中，sgrna如序列表的序列6所示。对受体植物中的os516基因进行基因编辑具体通过导入重组质粒sg2027实现。所述基因编辑植株具体可为用“gcacagcaaattacgga”替换基因组dna中的os516基因的“gcacagcaaattattccgga”，且为纯合型的植株。

以上任一所述株高为抽穗后期株高。

以上任一所述cas9蛋白为序列表的序列4中第2697-6968位核苷酸编码的蛋白质。

以上任一所述重组质粒sg2027如序列表的序列4所示。

以上任一所述植物为单子叶植物或双子叶植物。以上任一所述植物为禾本科植物。以上任一所述植物为稻属植物。以上任一所述植物为水稻，例如水稻日本晴。

本发明可用于植物的株高/穗长性状改良，对于植物育种特别是水稻育种，具有重大的应用推广价值。

附图说明

图1为重组质粒sg2027的结构示意图。

图2为突变位点及其周边核苷酸的测序结果。

图3为植株的照片。

图4为植株的株高测量结果。

图5为植株的穗的照片。

图6为植株的穗长测量结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例、

os516蛋白如序列表的序列1所示。水稻日本晴的cdna中，编码os516蛋白的cds如序列表的序列2所示。水稻日本晴的基因组dna中，编码os516蛋白的基因如序列表的序列3所示。

一、构建重组质粒

构建重组质粒sg2027。重组质粒sg2027的结构示意图见图1。经全质粒测序，重组质粒sg2027如序列表的序列4所示。序列表的序列4中，第2697-6968位核苷酸编码cas9蛋白。重组质粒sg2027中，sgrna的编码区如序列表的序列5所示。相应的，sgrna如序列表的序列6所示，sgrna中的靶序列结合区如序列表的序列7所示。

二、进行遗传转化并获得再生植株

将重组质粒sg2027导入农杆菌eha105，得到重组农杆菌。采用农杆菌浸染法，将重组农杆菌对水稻日本晴的胚性愈伤组织进行遗传转化，然后筛选抗性愈伤组织(抗性筛选采用100mg/l潮霉素)，然后进行分化再生培养，然后进行生根培养，得到再生植株。

三、获得转基因植株及其后代植株

将步骤二得到的再生植株进行如下鉴定：取叶片，提取基因组dna，采用引物f和引物r组成的引物对进行pcr扩增，然后将pcr扩增产物进行测序。

f：5’-tagcggcatctcggttttga-3’；

r：5’-aggccaaacatgtggatgga-3’。

通过以上鉴定，从步骤二得到的再生植株中筛选得到一个纯合突变型植株(即两条染色体发生的突变一致)，命名为os516-1植株。经测序鉴定，与水稻日本晴(用nip表示)的基因组dna相比，os516-1植株(用os516表示)的差异仅在于在编码os516蛋白的基因中发生了三个核苷酸的缺失(引起三个核苷酸的缺失，具体为“attattccg”突变为“attacg”，相应编码的氨基酸残基由“iip”突变为“it”)，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图2。

os516-1植株自交并收获种子，将种子培育为植株，即为t1代植株。t1代植株自交并收获种子，即为t2代种子。os516-1植株及其自交后代，称为os516-1株系。

四、性状比较

供试种子为：水稻日本晴种子、os516-1株系的t2代种子。

在平行条件下培养供试植株，具体为：取种子，在温室萌发并育苗(从露白开始计时，共培养3周)，得到3周幼苗；将3周幼苗移栽至河北廊坊的大田并正常栽培管理。

在大田中栽培管理110天后植株(处于抽穗后期)的照片见图3。在大田中栽培管理110天后植株的株高见图4(每个株系取10株植株的平均值)。图3和图4中，nip表示水稻日本晴，os516表示os516-1株系。日本晴植株的平均株高为108cm，os516-1株系植株的平均株高为140cm。结果表明，与水稻日本晴植株相比，os516-1株系植株的株高显著增加，增加幅度约为29.6％。

在大田中培养110天后(也就是从移栽开始计时培养110天后)植株的穗的照片见图5。穗长见图6(每个株系取10株植株的穗长的平均值)。图5和图6中，nip表示水稻日本晴，os516表示os516-1株系。水稻日本晴植株的平均穗长为23.6cm，os516-1株系植株的平均穗长为27.8cm。结果表明，与水稻日本晴植株相比，os516-1株系植株的穗长显著增加，增加幅度约为17.8％。

sequencelisting

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>os516蛋白及其编码基因和应用

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