一种自生固氮菌株及其用途的制作方法

本发明涉及农业微生物领域，特别涉及一种自生固氮菌株及其用途。

背景技术：

自然界中存在一些微生物能将空气中的氮气还原为氨，为微生物和植物提供氮源，这种现象被称为生物固氮。

根据高等植物与固氮微生物之间的关系，将生物固氮分为自生固氮、共生固氮、联合固氮三个体系。

固氮菌每年从空气中约固定1.5亿吨氮肥，是全世界生产氮肥总量的几倍。因此，固氮菌及其固氮酶的研究已成为当今农业生产应用和科学研究的热点。

据估算，非共生生物固氮提供了作物氮素总量24%的氮素来源。接种非共生固氮菌是提高土壤生物固氮能力，从而降低氮肥施用量的最可行方案之一。前人研究表明，从预期发挥功能的环境中分离出的菌株可能更能适应原位生态胁迫。因此，为了扩大成功接种固氮菌的可能性，有必要在各种生态条件下筛选丰富的高效固氮菌株。

能够在广泛的温度、盐碱度、极限铵离子浓度等范围内的自生固氮菌，是固氮菌制类菌剂应用到土壤环境中的商品化前提。通过从土壤环境中筛选具有的固氮、解磷等土壤改良功能微生物和植物促生微生物，并开发成应用范围广的改良专用的微生物菌肥，改善土壤理化性质和生态结构的同时，达到提高农作物的抗逆性，促进农作物的生长和减施增效的目的。

技术实现要素：

为了开发形成应用范围广的改良专用的微生物菌肥，本发明提供了一种自生固氮菌株及其用途；该菌株为高效固氮菌株。

本发明的技术方案为：

一种自生固氮菌株，该菌株命名为圆褐固氮菌(azotobacterchroococcum)qf-101，其保藏编号为cgmccno.19427，保藏日期为2020年2月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号。

该固氮菌株qf-101是从菜园地土壤中分离纯化所得，对该菌株的16srdna部分序列进行测定，通过系统发育分析，确定为圆褐固氮菌（azotobacterchroococcum），并命名为圆褐固氮菌（azotobacterchroococcum）qf-101。

该菌株的形态特征是：培养2d，细胞呈大卵圆形，常成对出现，呈“8”字型排列，直径约为2~5μm；ashby固体培养基上，菌落直径约0.88~1.66cm，由白色逐渐变为褐色；30h后菌落颜色逐渐变成黄褐色；菌落表面比较湿润，菌体边缘近似椭圆形，表面隆起呈花纹状，不透明。

本发明所述的圆褐固氮菌qf-101属于自生固氮菌，具有较强的固氮能力，它们在土壤中可以进行繁殖和发生固氮作用，将空气的氮气转化为可供植物生长利用的氨；并且能够分泌生长素iaa，具有促生、解磷的优良性能。

对该菌株培养条件进行研究，得：

所述自生固氮菌株，其生长条件为：温度15~42℃，ph为5~10，耐受nacl浓度为0%~5%，极限铵离子浓度为2mmol/l。

所述自生固氮菌株，其最佳生长条件为：温度20~30℃，ph为6~8，耐受nacl浓度为1%~2%，适宜生长铵离子浓度为0~1mmol/l。

基于该菌株的生长条件可知，该菌株适用的地域与环境范围非常广。

所述自生固氮菌株的用途，用于土壤固氮、解磷，提供植物生长素，促进作物生长。

采用所述自生固氮菌株制成微生物制菌剂，施用到土壤中，一方面可以通过固氮、解磷、提供植物生长的所需的营养，改良土壤、提高土壤疏松性及有机质含量；另一方面，可以促进种子的发芽，促进植株的根部发育和全株的生长，提高农作物的产量。

作为优选方案，所述用途，采用所述自生固氮菌株制成菌液或菌粉。

采用所述自生固氮菌株制备菌液的方法，将圆褐固氮菌（azotobacterchroococcum）qf-101接种到种子培养基中作为种子液20~35℃下振荡培养4~6d，将种子液接种到发酵培养基中于25~32℃下发酵培养30~45h；发酵终止，得到的发酵液即为所述菌液。

作为优选方案，所述种子培养基为lb液体培养基。

作为优选方案，所述发酵培养基为：葡萄糖10~30g/l，甘露醇5~10g/l，kh2po40.1~1g/l，mgso4·7h2o0.2~0.6g/l，nacl0.1~0.3g/l，caco32~10g/l，caso4·2h2o0.1~1g/l，调ph至6.8~7.0，灭菌。

所述自生固氮菌株制备菌液的方法，当发酵液中圆褐固氮菌（azotobacterchroococcum）qf-101的浓度≥10⁸个/毫升时，终止发酵。

采用所述自生固氮菌株制备菌粉的方法，将圆褐固氮菌（azotobacterchroococcum）qf-101接种到种子培养基中作为种子液20~35℃下振荡培养4~6d，将种子液接种到发酵培养基中于25~32℃下发酵培养30~45h，发酵终止，发酵液干燥得到固体菌粉。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供的自生固氮菌株，即，圆褐固氮菌qf-101，属于自生固氮菌，具有较强的固氮能力，它们在土壤中可以进行繁殖和发生固氮作用，将空气的氮气转化为可供植物生长利用的氨；并且能够分泌生长素iaa，具有促生、解磷的优良性能。

2、采用圆褐固氮菌株qf-101制成微生物制菌剂，施用到土壤中，一方面可以通过固氮、解磷、提供植物生长的所需的营养，改良土壤、提高土壤疏松性及有机质含量；另一方面，可以促进种子的发芽，促进植株的根部发育和全株的生长，提高农作物的产量。

3、该菌株适用的地域与环境范围非常广。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为圆褐固氮菌株qf-101具有解磷能力的试验结果；

图2为圆褐固氮菌株qf-101的温度生长范围实验探究结果；

图3为圆褐固氮菌株qf-101生长的ph范围实验探究结果；

图4为圆褐固氮菌株qf-101的生长的nacl浓度范围实验探究结果；

图5为圆褐固氮菌株qf-101的生长的nh4cl浓度范围实验探究结果；

图6为菌液浓度与作物根系的促生效果的关系图。

具体实施方式

下面结合符合和具体实施方式对本发明进行详细说明。

实施例1圆褐固氮菌株qf-101的分离

1、ashby无氮培养基：甘露醇10g，kh2po40.2g，mgso4·7h2o0.2g，nacl0.2g，caso4·2h2o0.2g，caco35g，定容至1l，ph7.2，121℃，30min；固体培养基添加20g琼脂。

2、自生固氮菌的初筛：

1）制备样品稀释溶液：称取盐碱地土壤样品10g，放入装有适量玻璃珠和100ml无菌水的250ml的锥形瓶中，静置20min后，以200rpm在振荡培养箱中振荡30min，经过充分振荡，细胞分散，制成菌悬液母液，然后系列稀释涂布。

2）倒平板：ashby无氮固体培养基经灭菌后，冷却至60℃时，倒平板。

3）涂布：稀释度的样品溶液各取100μl，用无菌玻璃棒轻轻均匀的涂布于培养基表面。

4）培养：将涂有菌液的平板在30℃恒温培养箱中倒置培养5d~7d。

5）初步筛选：从经过培养的平板上分离出固氮菌，利用平板划线法分离纯化，将获得的菌株接种至lb斜面培养基，置于4℃冰箱内保藏。

3、自生固氮菌的复筛

1）接种培养：将初次筛选的菌株接种于ashby无氮液体培养基，30℃，200rpm振荡培养。

2）测量：以不接菌种的液体培养基为对照，每隔8h，用凯氏定氮法测定不同菌株发酵液内总氮的含量，根据含氮量的多少来确定菌株的固氮能力。将复筛得到的高效固氮菌株的发酵液用20%甘油置于-20℃冰箱内保藏。

实施例2圆褐固氮菌株qf-101的16srdna序列分子鉴定

采用chelex法提取菌株qf-101基因组dna，使用16srdna通用引物27f、1492r对菌株qf-101基因组dna的16srdna基因全长序列进行pcr扩增。pcr产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，目的条带切割后采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒（sangonbiotech，orderno.b518131）回收目的dna片段。使用3730xldnaanalyzer（appliedbiosystems）进行dna片段的序列分析，测序试剂盒使用bigdyeterminatorv3.1（appliedbiosystems）。双向测序结果使用seqman（dnastarlasergene）进行拼接，得到接近全长的16srdna基因序列，该序列为：

gagcggatgaggggtgcttgcatcccgattcagcggcggacgggtgagtaatgcctagga60

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使用ezbiocloudidentifyservice（https：//www.ezbiocloud.net/identify）和ncbinucleotideblast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi），将16srdna基因序列结果与genbank数据库进行比对，菌株qf-101鉴定为圆褐固氮菌。

菌株qf-101的形态特征是在显微镜下细胞呈大卵圆形，培养2d后，常成对出现，呈“8”字型排列，菌体直径约为2~5μm；ashby无氮平板培养基培养2d后，菌落直径约0.88cm～1.66cm，菌落由白色逐渐变为褐色；30h后菌落颜色逐渐变成黄褐色；菌落表面比较湿润，菌体边缘近似椭圆形，表面隆起呈花纹状，不透明。

实施例3圆褐固氮菌株qf-101的生理生化特性研究

1、圆褐固氮菌株qf-101分泌植物生长素（iaa）的测定

1）king培养基：k2hpo41.725g，mgso4.7h2o1.5g，甘油10.0ml，色氨酸0.5g，蒸馏水1000ml。

2）方法

①将固氮菌qf-101接种到装有30mlking液体培养基的12.0ml试管中，每组两个重复。接种完毕后，将试管置于摇床上，30℃，150rpm，培养三天，待测。

②配制浓度为100mg/l、250mg/l、500mg/l、1000mg/l、5000mg/l的iaa溶液。分光光度计法测试530rmiaa的吸光值，并做标准曲线。

测试①中获得的菌悬液的吸光值，利用吸光值线性公式换算菌株qf-101分泌生长素的浓度含量，得到菌株qf-101分泌生长素能力为20.20(±1.27)µg/ml。

2、菌株qf-101解磷能力试验

1）国际植物研究所磷酸盐生长培养基(nbrip)：葡萄糖10g，ca3(po4)25g，mgcl25g，mgso47h2o0.25g，kcl0.2g，(nh4)2so40.1g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph7.0。

2）方法

将固氮菌qf-101接种到nbrip培养基上置于30℃恒温培养箱培养10天，观察培养基上有无透明环形成及其大小，实验结果如图1所示。用直尺测量菌落和水解圈的直径，根据水解圈与菌落圈的半径比来判断该菌株溶磷能力的相对大小。用钼锑钪比色法，分光光度计在波长700nm处测定钼蓝的吸光值，以定量分析磷含量，测定菌株qf-101株解无机磷能力达56.6mg/l。

表1菌株qf-101解磷能力定性试验结果

由表1和图1可知，菌株qf-101在nbrip培养基上水解圈与菌落圈的半径比为1.46；结合定量分析磷含量，测定菌株qf-101株解无机磷能力达56.6mg/l。表明该菌株具有较强的溶磷能力。

实施例4固氮菌qf-101的培养条件优化

将固氮菌qf-101接种到lb液体培养基中，30℃200rpm振荡培养5d。

1、温度对菌株qf-101生长的影响

将菌种接种到ashby无氮液体培养基中，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、42℃，200rpm振荡培养5d，然后紫外分光光度计测定菌悬液的od600吸光值，结果如图2所示。

由图2可见，菌株qf-101可以生长的温度范围较大。在15～30℃之间时，生长量不断增加；而当温度超过30℃时，生长量开始下降，直到温度达到42℃时，菌株停止生长。说明菌株qf-101的生长温度范围较广，为15~42℃；最适生长温度是20~30℃。

2、ph对菌株qf-101生长的影响

将菌株qf-101接种到ph5、6、7、8、9、10的ashby无氮液体培养基中，30℃200rpm振荡培养5d，然后紫外分光光度计测定菌悬液的od600吸光值，结果如图3所示。

由图3可知，菌株可以生长的ph范围较大。在ph为5时，菌株开始生长；当ph大于10时，菌株生长量较低。而当ph是6~8时，菌株的生长量最大。所以，qf-101的最适生长ph是6~8，生长ph范围是5~10，表明qf-101对酸碱性环境的适应性很广。

3、渗透压对菌株qf-101生长的影响

将菌株qf-101接种到nacl浓度0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的ashby无氮液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养5d，然后紫外分光光度计测定菌悬液的od600吸光值，结果如图4所示。

从图4中可以看出，nacl浓度在1%~2%时，生长量随着nacl浓度的增加而增加，当浓度超过2%时生长量开始下降，大于4%时生长量极低。因此，qf-101耐受nacl浓度范围是0%~5%，最佳生长nacl浓度是1%~2%；菌株qf-101具有一定的耐盐能力。

4、铵离子浓度对菌株qf-101生长的影响

将菌株qf-101接种到nh4cl浓度0mmol/l、0.5mmol/l、1.0mmol/l、1.5mmol/l、2.0mmol/l的ashby无氮液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养5d，然后紫外分光光度计测定菌悬液的od600吸光值，结果如图5所示。

如图5所示，铵离子浓度在0~1.0mmol/l范围内时，qf-101的生长量呈上升趋势；当铵离子浓度超过1.0mmol/l时，生长量开始下降。qf-101的极限铵离子浓度是2.0mmol/l，最适生长铵离子浓度是0~1.0mmol/l；表明菌株qf-101在土壤中具有一定的耐铵能力。

铵能抑制固氮酶的活性，因此固氮菌的耐铵能力是评价固氮菌性能的一个重要指标。土壤中铵态氮的含量一般为10~15mg/kg，而菌株qf-101在铵离子浓度达到1mmol/l（相当于18mg/l）时能够生长。结果表明菌株qf-101在土壤中可以生长和发挥固氮作用。

实施例5菌株qf-101的发酵生产

将圆褐固氮菌qf-101接种到lb液体培养基中作为种子液，30℃，200rpm振荡培养5d。种子液（3%-5%）接种到发酵培养基进行发酵，所述发酵培养基配方为葡萄糖10~30g/l，甘露醇5~10g/l，kh2po40.1~1g/l，mgso4·7h2o0.2~0.6g/l，nacl0.1~0.3g/l，caco32~10g/l，caso4·2h2o0.1~1g/l，调ph至6.8~7.0，121°c灭菌30分钟；控制温度为28℃~30℃；发酵罐搅拌速度为180rpm~220rpm，培养32h~40h；至固氮菌qf-101浓度≥10⁸个/毫升，发酵终止，作为发酵液；或经过低温干燥制备固体微生物菌粉。

实施例6菌株qf-101的发酵液对作物根系应用促生实验

将固氮菌qf-101发酵液，发酵液稀释100倍、200倍、400倍，作为微生物菌肥冲施草莓根部。比较植株的全长和根长。与对照组相比，施用固氮菌剂，其全株长势旺和根系发达，促生效果显著。

以草莓为例，稀释不同浓度，其对根的促生作用不同，如图6所示。与对照组相比，稀释200倍，菌株qf-101发酵液促生效果显著，有效促进草莓根系的生长；稀释100倍会抑制根的生长（浓度过高抑制根的生长）；稀释400倍与对照组相当。

实施例7菌株qf-101的菌粉作物应用促生实验

通过上述发酵干燥的固氮菌qf-101菌粉，制备成2×10⁸个/ml、4×10⁸个/ml、6×10⁸个/ml的菌液，分别为处理1，处理2，处理3，清水为对照；每个处理随机选60粒玉米种子，播种后施入上述不同处理菌液，覆土1.5cm，室温培养。出苗后10d调查出苗数，然后取出完整全株小心冲洗，在40℃下经12h烘干至恒重，称地上部分和地下部分干重，取平均值。通过促生能力评价，结果表明菌剂qf-101对促进出苗、提高出苗率和株高、干重都有显著效果，其中处理2、3的最为明显（表2）但差异不大。

表2固氮菌qf-101对种子出苗的影响

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<110>山东千丰农业科技有限公司

<120>一种自生固氮菌株及其用途

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<213>圆褐固氮菌（azotobacterchroococcum）

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