基因Bmal1在制备检测治疗炎症性肠病的产品中的应用的制作方法

本发明涉及一种基因bmal1在制备检测治疗炎症性肠病的产品中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术：

溃疡性结肠炎(uc)和克罗恩病(cd)等炎症性肠病(ibd)是胃肠道(gi)的慢性炎症性疾病。ibd的病因尚不清楚。了解ibd的分子病理学对于制定新的治疗计划很重要。肠道稳态的维持包括三个因素：肠道菌群，肠道上皮和宿主的免疫系统。一旦某一方面发生故障，便会引起炎症性肠病。

众所周知，b细胞的主要功能是产生抗体，呈递抗原并分泌细胞因子。据报道b细胞参与自身免疫，比如自身免疫性脑脊髓炎，关节炎。b细胞在肠道炎症中的报道也有：mizoguchia等人2002年报道，产生il-10的b细胞亚群(经典breg细胞)可以通过上调il-1和激活stat3途径来抑制肠道炎症过程。同时b细胞可以特异性分化为浆细胞。大多数肠道浆细胞会分泌iga(siga)，可作为保护上皮免于病原微生物的屏障。

哺乳动物的昼夜稳态由位于大脑上裂眼上核的中央时钟维持。时钟由昼夜节律基因操纵。分子时钟的当前模型基于bhlh-高碘酸席夫转录因子bmal1和clock的循环表达。转录因子bmal1和clock形成中央振荡环的核心。bmal1：clock异源二聚体结合e-box位点并驱动生物钟基因per1-3，cry1-2和rev-erb(a和b)的表达，从而建立24小时周期。昼夜节律是大多数生理过程的重要驱动力，因为它们使身体与环境中有规律地发生的日常变化保持一致。昼夜节律的改变会严重恶化动物模型中结肠炎的发展，人体的初步研究表明，ibd患者的睡眠方式改变的风险增加。此外，有关于昼夜节律基因在淋巴细胞中的功能的报道。例如，据报道b细胞和t细胞均表达分子钟机制的核心成分。bmal1基因的b细胞特异性缺失破坏了骨髓中b细胞的成熟。t细胞中昼夜节律基因的缺失会影响淋巴细胞归巢。然而，目前尚不清楚淋巴细胞中的昼夜节律基因是否与炎症性肠病的发生和发展有关。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明从肠上皮淋巴细胞的角度发现某种高表达pdl1的breg细胞能抑制肠炎，生物钟异常会无法调控此类breg细胞，所以促进肠炎的发生发展。且我们进一步阐明了bmal1基因调控该类细胞的分子机制。进而提出一种基因bmal1在制备检测治疗炎症性肠病的产品中的应用。

本发明的第一个目的是提供一种基因bmal1在制备检测或治疗炎症性肠病的产品中的应用。

进一步地，所述的基因bmal1的cdna的核苷酸序列如seqidno.1所示。

进一步地，所述的基因bmal1的氨基酸序列如seqidno.2所示。

进一步地，所述的检测炎症性肠病的产品为定量检测基因bmal1表达量和il-33含量的试剂盒。

进一步地，所述的治疗炎症性肠病的产品为靶向基因bmal1的药物。

进一步地，所述的靶向基因bmal1药物通过上调基因bmal1表达，增加肠上皮淋巴细胞中表达pdl1的breg细胞。

进一步地，所述的基因bmal1调控il-33转录，进一步调控breg细胞表达pdl1。

进一步地，所述的药物通过注射的方式进行给药。

本发明的第二个目的是提供一种检测炎症性肠病的试剂盒，包括检测基因bmal1表达量的试剂和检测il-33含量的试剂。

本发明的有益效果：

本发明提出一种基因bmal1在制备检测治疗炎症性肠病的产品中的应用。并从肠上皮淋巴细胞的角度发现某种高表达pdl1的breg细胞能抑制肠炎，生物钟异常会无法调控此类breg细胞，所以促进肠炎的发生发展。且我们进一步阐明了bmal1基因调控该类细胞的分子机制，为研发靶向bmal1基因的药物，治疗临床炎症性肠病提供更多的依据。

附图说明

图1为bmal1–/-小鼠和对照小鼠在肠炎发生前后结直肠大体观；

图2为bmal1–/-小鼠和对照小鼠在肠炎发生前后的体重下降曲线和结直肠重量与长度比值；及其结直肠炎症情况；

图3为bmal1–/-小鼠和对照小鼠在肠炎发生前后he图；

图4为bmal1–/-小鼠和对照小鼠在肠炎发生前后结直肠炎症情况评分，其中a为炎症范围评分，b为炎症程度评分，c为隐窝损伤评分；

图5为肠炎时bmal1调控一类具有缓和肠炎的breg细胞；

图6为野生型(wt)b细胞回输给bmal1-/-肠炎小鼠后，能有效缓解肠炎；(a)大体观；(b)7天体重变化；(c)he；

图7为bmal1-/-b细胞回输给野生型(wt)肠炎小鼠后，能加速肠炎。(a)大体观；(b)7天体重变化；(c)he；

图8为肠炎时，bmal1-/-小鼠肠上皮浸润淋巴细胞的特性为高表达pdl1；

图9为bmal1和clock复合体通过结合il-33，在转录水平正调控il-33的表达，(a)il-33的报告基因检测结果；(b)chip实验检测结果；

图10为il-33通过bmal1在b细胞中促进pdl1的表达。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：bmal1缺失(bmal1-/-)的小鼠易感炎症性肠病

我们用1％的dss诱导5对bmal1-/-的小鼠7天，与同等诱导的野生型相比较。我们发现，bmal1-/-小鼠在第四天体重明显下降(图1和图2)，he结果显示肠炎发生时bmal1-/-小鼠肠上皮隐窝几乎全部消失，而对照(wt)小鼠肠上皮50％的隐窝只脱落了1/3，甚至不受影响(图3和图4)。

实施例2：bmal1调控小鼠肠道高表达pdl1的breg(b220+cd5+cd1d+)细胞，且其与肠炎发生密切相关

我们进一步提取本底和肠炎状态下的bmal1-/-小鼠及其对照小鼠的肠上皮淋巴细胞，监测发现其中的breg(b220+cd5+cd1d+)细胞在对照小鼠中有变化，肠炎发生时，breg细胞显著下降，而bmal1缺失的小鼠breg细胞比例在肠炎发生前后表达量很低，且没有显著的变化(图5a)。我们检测到该b细胞可以分泌il-10，il-10在bmal1缺失小鼠及对照小鼠肠炎时均减少(图5b)。我们确定该分泌il-10的b细胞为有功能的breg细胞。我们将野生型小鼠的b细胞分离出通过尾静脉注射入bmal1缺失的小鼠体内，7天诱导肠炎期间，分别在第1，3，5天注射wt的b细胞，发现bmal1缺失小鼠的肠炎情况较未接受b细胞的bmal1缺失小鼠减轻了(图6a-c)。相反，我们将bmal1缺失小鼠的b细胞分离出并通过尾静脉注射入对照小鼠体内，7天诱导肠炎期间，分别在第1，3，5天注射bmal1缺失的b细胞，发现对照小鼠肠炎情况较未接受b细胞的野生型小鼠更严重了(图7a-c)。我们进一步检测对照小鼠和bmal1缺失小鼠的肠上皮breg细胞的特性，发现野生型的breg细胞较bmal1缺失的小鼠高表达pdl1(图8)。

实施例3：bmal1直接作用并调控il-33的转录

我们通过报告基因检测转录调控因子bmal1和clock的复合物对il-33的调控作用，结果显示，转录因子bmal1和clock复合体会增加il-33的转录水平表达，随着复合体的加倍，il-33的表达水平大约三倍(图9a)，而突变的il-33不受bmal1和clock复合体的调控。同时，我们用chip实验检测发现bmal1通过e-box结合位点结合在il-33序列上(图9b)。

实施例4：b细胞中bmal1通过上调il-33促进pdl1的表达

我们分离出bmal1缺失小鼠和对照小鼠的脾脏b淋巴细胞，激活培养3天后，加入细胞因子il-33，检测pdl1的表达。发现，本底bmal1缺失的组别中pdl1的表达低于对照组，il-33的作用使得bmal1缺失组表达pdl1显著增加，大约是本底bmal1缺失组的3倍，而此时对照组中il-33的作用与对照本底水平比没有差异(图10)。推测il-33会通过bmal1促进pdl1的表达。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>苏州大学

<120>基因bmal1在制备检测治疗炎症性肠病的产品中的应用

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>390

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>1

ggtggtgctggctagagtgtatacgtttggacccaagcttaacttttccaatgtggaatc60

ctgggccttcattggtttttggaagaagctgaccgcctgaaaagaaattataaaacatga120

aaatcgctttgaggtgaccaagtccagaggcccctaactcctcccaagctggatctgggg180

tgtaagaactgtgacttcagatcatccaatggcagaccagagaatggacatttcttcaac240

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