核酸分子在植物转基因、分子育种、病害防治和分子标记物中的用途的制作方法

文档序号：21887368发布日期：2020-08-18 17:26阅读：599来源：国知局

本发明涉及分子植物学领域，具体地涉及一种核酸分子在植物转基因、分子育种、病害防治和分子标记物中用途。

背景技术：

镰刀菌属(fusariumsp.)是一类世界性分布的真菌，它不仅可以在土壤中越冬越夏，还可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，寄主植物达100余种，侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质，是生产上防治最艰难的重要病害之一。受镰刀菌侵染的植物或籽粒中含有多种霉菌毒素，主要有单端孢霉烯族化合物(trichothecenes，ctcs)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)、丁烯酸内酯(butenolide)和伏马菌素(fumonisinsfb)等毒素。

由禾谷镰刀菌(主要包括f.asiaticum、f.graminearumschwabe和f.pseudograminearum)侵染谷物引起的病害主要包括小麦、大麦、燕麦、玉米和谷子的赤霉病和茎基腐病。当前无论是小麦、大麦还是玉米赤霉病都是世界性难以解决的重大真菌病害。例如，由小麦赤霉病导致的谷物减产和籽粒霉菌毒素污染已成为我国及世界范围内最亟待解决的粮食安全问题之一。禾谷镰刀菌在小麦杨花期侵染小麦穗部，分泌大量单端孢霉烯族毒素从而显著增加病原菌的致病性，导致对产量造成毁灭性的破坏。同时食用受到该类毒素污染的小麦籽粒后会导致食欲减退或废绝、胃肠炎症和出血、呕吐、腹泻、坏死性皮炎、运动失调、血凝不良、贫血和白细胞数量减少、免疫机能降低和流产等，严重威胁人畜健康。

技术实现要素：

鉴于现有技术存在的问题，发明人提供一种编码去环氧基蛋白酶的核酸分子，通过该核酸可有效去除毒素中的环氧基，从而实现解毒。基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供核酸分子在植物转基因、分子育种、病害防治和分子标记物中用途，所述核酸分子具有选自下述(a)-(e)组成的组中的一种碱基序列：

(a)seqidno.:1-35所示的序列；

(b)在(a)中碱基序列的基础上经宿主密码子偏好性改造的序列；

(c)(a)中所示序列的保守区序列；

(d)与(a)-(c)的序列同一性为95％以上且来源于相同属的序列；

(e)与(a)-(d)任一序列的至少一部分互补的序列。

在(a)的序列中，seqidno.1表示来源于长穗偃麦草十倍体的去环氧酶基因，seqidno.2表示来源于长穗偃麦草二倍体的去环氧酶基因。seqidno.:3-24表示seqidno.1序列的突变体。seqidno.:25-35表示来源于香柱菌属(属)不同物种的同源基因序列。

本发明中，在(b)的序列中，经宿主密码子偏好性改造是指为了适应于不同宿主表达的需要，根据简并密码子来对(a)中的碱基序列进行碱基替换。密码子偏好性改造一般不改变产物蛋白或多肽的序列。

在(c)的序列中，保守区序列是指在长穗偃麦草属和香柱菌属的不同物种内对应的序列同一性为98％以上，优选99％以上，更优选100％一致的区域。保守区序列还可以指在长穗偃麦草属内不同物种的序列同一性为100％的部分连续区域，也可以指在香柱菌属的不同物种内对应的序列同一性为100％的部分连续区域。保守区序列可以对应于活性多肽的保守区氨基酸序列。需要说明的是，碱基的保守区序列并不一定表达或编码活性多肽。只要其为保守区即可用作检测靶标。在某些实施方案中，当以seqidno.1所示的碱基序列作为位置参考时，所述核酸分子包含至少一种选自以下的碱基序列：第436-470位之间的碱基序列、第430-476位之间的碱基序列、第808-846位之间的碱基序列。

在(d)的序列中，与(a)-(c)中的碱基序列的序列同一性一般为90％以上，优选95％以上，更优选97％以上，还优选98％以上，进一步优选99％以上。一般而言，(d)中的序列在序列同一性的基础上来源于相同属，优选来源于相同物种的碱基序列。在某些实施方案中，该核酸分子的碱基序列与(a)、(b)或(c)中的氨基酸序列的序列同一性为95％以上，且均来源于长穗偃麦草属或香柱菌属。

在(e)序列中，与(a)-(d)中任一序列的至少一部分互补的序列，其中互补的序列包括在严格条件下与这些序列特异性杂交的序列。例如，探针、引物等。具有这些序列的核酸分子或寡核苷酸分子的长度不特别限定，可以是15-200bp，例如，15-40bp，150-180bp等。

在某些具体实施方案中，所述核酸分子能够编码具有去环氧催化活性的蛋白酶。

本发明中的植物不特别限定，可以是粮食作物、经济作物、药用植物等，也可以是草本植物也可以是木本植物。作为粮食作物实例包括但不限于例如大米、小麦、大麦、水稻、青稞、小米、大豆等。作为木本植物的实例包括果树，例如木本常绿果树或蔷薇科果树。植物的实例还包括紫花苜蓿、偃麦草、黑麦草、墨西哥玉米草、皇竹草牧草、甜象草牧草、大麦、花生、棉花等。本发明的植物还可以是杂交植物。例如由上述植物杂交得到的植物。

在某些具体实施方案中，所述病害包括镰刀菌属、头孢菌属、漆班菌属或木霉属的细菌引起的植物病害。此类植物病害可举例例如根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐。

本发明的第二方面，提供一种植物细胞，其包含通过基因工程手段引入具有选自(a)-(e)组成的组中的一种碱基序列的外源核酸分子。

本发明的第三方面，提供一种转基因植物，所述转基因植物通过基因工程手段将外源核酸导入宿主植物而得到。

本发明的核酸分子能够编码去环氧基蛋白酶，从而使转基因植物具有了针对单端孢霉烯族化合物的环氧基去除能力，进而降低植物内此类毒素的含量。此类毒素的实例包括但不限于脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-adon)、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-adon)、雪腐镰刀菌烯醇(niv)、镰刀菌烯酮-x(fus-x)、二乙酰氧基草镰刀菌烯醇(das)、t-2毒素(t-2)、ht-2毒素(ht-2)。

附图说明

图1为lc-hrms全扫模式下的禾谷镰孢菌(f.g)侵染转基因小麦提取的离子色谱图。

图2为lc-hrms(/ms)prm模式下f.g侵染转基因小麦提取的离子色谱图。

图3为lc-hrms(/ms)prm模式对毒素及其衍生物定量检测结果。其中，(a)表示don-gsh定量结果；(b)表示don定量结果；(c)表示3-adon-gsh定量结果；(d)表示3-adon定量结果。

图4为转基因植株抗赤霉病表型鉴定实验的结果。其中图(a)为接种21d发病情况(图中a表示转基因阳性植株，b表示转基因受体材料)；(b)为转thfhb7过量表达3个株系发病小穗数统计；(c)为转thfhb7原始表达3个株系发病小穗数统计。

图5为thfhb7转基因株系对镰孢菌种的广泛抗性结果。其中，(a)表示thfhb7转基因株系对禾谷镰孢菌抗性结果；(b)表示thfhb7转基因株系对亚洲镰孢菌抗性结果；(c)表示thfhb7转基因株系对假禾谷镰孢菌抗性结果。

图6为thfhb7对小麦茎基腐病抗性实验结果。其中，(a)表示thfhb7对小麦茎基腐病发病情况；(b)表示茎基腐抗性实验中thfhb7转基因植株死亡率统计结果。

图7为转thfhb7基因玉米赤霉病抗性鉴定结果。

图8为thfhb7的部分突变序列比对结果。

图9为突变体抗赤霉病表型鉴定结果。

图10为thfhb7的ncbi比对结果。

图11为thfhb7及同源序列进化树。

图12为lc-hrmsdon处理转基因酵母提取的离子色谱图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

本文中，术语“第y位碱基”或类似表述均以来源于长穗偃麦草十倍体的去环氧酶基因的碱基序列为位置参考，即以seqidno.1所示的氨基酸序列为位置参考，除非另有明确说明。

实施例1

一、转基因小麦抗赤霉病实验

1.过量表达载体构建

以十倍体偃麦草基因组dna为模版扩增长穗偃麦草thfhb7基因的cds区域847bp，设计引物序列为：

正向引物：5'-tgcagcccggggatccagaaatccacccatcgtcatcacc-3'；反向引物：5'-acctgtaattcacacgtgctacttcacctcggcatacttgtc-3'。

下划线部分是与线性化载体末端互补的扩展序列。thfhb7cdna全基因序列通过pcr获得，载体pcambia3300经内切酶bamhi处理后，将pcr产物与线性化的质粒进行纯化回收，利用in-fusionhd克隆试剂盒将其插入pcambia3300强启动子下游的mcs中，并转化到大肠杆菌dh5α中，经菌落pcr鉴定后，将阳性单克隆菌液进行测序验证，序列如seqidno.:1所示。经序列验证正确的质粒送山东农业大学国家重点实验室小麦转化平台进行小麦转基因，受体为小麦品种fielder。

2.原始表达载体构建

以十倍体偃麦草基因组dna为模版扩增长穗偃麦草抗赤霉病基因thfhb71308bp的启动子区域和cds区域的847bp，设计引物序列为：

正向引物：5'-acatgattacgaattcttctactagtgccccacctacg-3'

反向引物：5′-acctgtaattcacacgtgcgaccagccaggaaacaccactg-3′.a下划线部分是与线性化载体末端互补的扩展序列。通过pcr获得包含thfhb7启动子和开放阅读框的序列，载体pcambia3300经内切酶ecori处理后，将pcr产物与线性化的质粒进行纯化回收，利用in-fusionhd克隆试剂盒将该片段插入去除ubi启动子的pcambia3300载体中，并转化到大肠杆菌dh5α中，经菌落pcr鉴定后，将阳性单克隆菌液测序进行验证。经序列验证正确的质粒送山东农业大学国家重点实验室小麦转化平台进行小麦转基因，受体为小麦品种科农199。

3.转thfhb7基因植株的pcr检测

取转基因植株幼嫩叶片，以ctab法提取小麦基因组dna。利用pcambia3300表达载体序列和thfhb7启动子区域及cds区域序列信息，分别开发过量表达与原始表达载体的跨载体引物，对转基因植株进行pcr。扩增产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。其中，过表达载体跨载体引物为f:5'-tgcagtccctccgaaacatg-3'；r:5'-caaatggacgaacggataaacc-3'。原始表达跨载体引物为f:5'-agcggaaacacgcatctgacct-3'；r:5'-ttacccgccaatatatcctgtc-3'。

4.转thfhb7基因植株的rt-pcr检测

取小麦幼苗叶片于液氮中研磨成粉末，利用reagent，按说明书进行提取。利用反转录试剂盒去除基因组dna并将rna逆转录为cdna。根据thfhb7基因序列设计荧光定量引物f：5'-tgattcttcttccgtttctaagga-3'；r：5'-atgtcaaaggagtcgccgacga-3'。使用roche480进行rt-pcr分析。管家基因β-actin作为内标。利用ct值对thfhb7的相对表达量进行计算，挑选出高表达的小麦转基因株系，严格套袋连续自交得到t3植株，进一步进行抗赤霉病表型鉴定。

5.转thfhb7基因植株抗赤霉病表型鉴定

取出禾谷镰刀菌菌株，接种活化后，挑取活化的菌丝，接种于cmc产孢培养基中，培养诱导产生分生孢子。用纱布滤去菌丝，收集菌液到无菌锥形瓶中；离心倒掉上清，加入适量ddh2o，调节孢子浓度为2×10⁵个/ml，用于单花接种；分装至离心管，-20℃保存备用。于小麦扬花初期，用移液器吸取10μl孢子悬浮液，注入小穗中上部小花的外稃和内稃之间；套上塑料袋，保湿72h后揭去塑料袋，每个转基因株系接种30个穗子左右，每个单株接种一个小穗。接种21d后，统计发病小穗数(nds)。

6.禾谷镰刀菌菌种活化

用牙签刮取土豆培养基上的菌丝放入绿豆培养基，28℃，200rpm摇菌3天；摇菌完成后，菌液用滤布过滤，分装至50ml离心管，离心弃去上清液，加30ml灭菌水震荡混匀；4000rpm离心20min，弃去上清液；沉淀物用少量的灭菌水重悬，显微镜下检测菌量，并根据孢子量稀释至1×10⁵/ml浓度。

7.小麦材料单花滴注法接菌

在小麦开花期对相同穗位的小花基部两个小穗(通常是穗顶部第三个小穗的左右两个基部小花)接种10ul禾谷镰刀菌分生孢子(浓度为每亳升1×10⁵个)。接菌部位做好标记，套袋保湿。整个接菌过程中，尽量使小穗不要直接暴露于空气中以免干枯。接菌后72h对接菌穗取样，将收集的样品迅速用液氮冷冻，并转至-80℃超低温冰箱保存备用。

8.毒素衍生物提取

小麦样品磨碎后，加入预冷的1.5ml75％的甲醇水(含有0.1％甲酸)。震荡10s，室温下超声30min，取上清后转移至一新的离心管中。真空浓缩至干粉状。进样前用100μl20％乙腈重悬，通过0.22μm滤膜过滤后，转移到进样小瓶中进行lc-hrms检测。

9.实验结果：

为了鉴定thfhb7在小麦体内的生化及生物学作用，首先在玉米ubiquitin启动子的驱动下在小麦中进行了过量表达，对t3代纯合转基因小麦穗部进行了禾谷镰刀菌接种。在小麦扬花期，接种禾谷镰刀菌72小时后，取样进行检测。检测结果如图1所示，以lc-hrms(fullscan)正离子模式从fg侵染转thfhb7小麦中检测到don-gsh加合物，m/z604.21730(对应于[m+h]⁺，δ±5ppm)；fg侵染转thfhb7小麦中检测到niv-gsh加合物，m/z620.21199(对应于[m+h]+，δ±5ppm)。而在相应的对照(禾谷镰刀菌侵染的小麦转基因受体材料)中均未检测到相应的gsh加合物产生。

因3-adon与15-adon是分子量相同的同分异构体，fullscan模式一级谱不能区分，故选用lc-hrms(/ms)正离子prm模式进行检测，检测结果如图2所示。以母离子m/z646.22764(对应于[m+h]⁺，δ±5ppm)，子离子m/z321.11210从fg侵染转thfhb7小麦中检测到3-adon-gsh加合物；以母离子m/z646.22764(对应于[m+h]⁺，δ±5ppm)，子离子m/z450.15471从fg侵染转thfhb7小麦中检测到15-adon-gsh加合物。而在相应的对照小麦转基因受体fielder中均未检测到相应的gsh加合物产生。

结论：单一的禾谷镰刀菌种侵染扬花期小麦穗部72小时内即会产生单端孢霉烯毒素，本实验利用lc-hrms明确检测到了don、3-adon、15-adon及少量niv，但由于含量极少而未检测到其他毒素如t2、ht-2等。该实验结果表明：当禾谷镰刀菌侵染过量表达thfhb7的转基因小麦时，可以高效将don、3-adon、15-adon、niv催化成谷胱甘肽加合物。转基因thfhb7小麦提高了耐毒素的能力，证明thfhb7可以以单端孢霉烯族毒素为底物并将其催化成相应的gsh加合物，并可以提高小麦的赤霉病抗性。

二、转基因小麦里毒素及其衍生物定量检测

鉴于以上实验证明了在受禾谷镰刀菌侵染的情况下，thfhb7在小麦体内可以将don、3adon、15adon、niv等毒素催化成gsh形式的衍生物。为了进一步印证这些毒素的含量变化，进一步利用高分辨液质lc-hrms(/ms)prm模式对这些毒素进行了定量。由于prm模式对毒素含量具有较高要求，本实验仅对过量表达thfhb7的转基因小麦中don及3adon进行了相关定量检测，具体结果如图3所示。

转thfhb7小麦穗部接种禾谷镰刀菌后不同时间点取材，然后进行don、don-gsh、3-adon、3-don-gsh含量测定。图3(a)中表明含有thfhb7的转基因小麦特异催化形成don-gsh，而不含thfhb7的对照材料jw1则无法检测到的don-gsh的积累。图3(b)的结果表明，在接种fg后，由于的don-gsh在含有thfhb7的情况下大量合成，因此底物don相对不含有thfhb7的小麦中明显减少(约1/3)。同样地，图3(c)含有thfhb7的转基因小麦可以合成3-adon-gsh，而不含thfhb7的对照材料jw1则检测不到3-adon-gsh(绿色)。图3(d)穗部接种fg后含有thfhb7的小麦较不含thfhb7的对照受体材料3-adon明显减少(约1/3)。该实验证明，在小麦受到禾谷镰刀菌侵染后thfhb7可以高效将don、3-adon衍生成don-gsh，从而减少don毒素在小麦体内的积累，从而起到去毒化的作用。

对毒素及其衍生物定量检测结果可以看出，禾谷镰刀菌侵染小麦会产生大量的don、3-adon。prm的定量结果表明：当f.g侵染转赤霉病抗性基因thfhb7小麦时，don、3-adon的含量较对照减少约2/3，伴随don、3-adon的减少，don-gsh、3-adon-gsh相应增加。转thfhb7基因小麦提高了耐毒素的能力，证明thfhb7可以以don、3-adon为底物将其催化成相应的gsh加合物，可以起到体内解毒作用。

三、转基因小麦抗赤霉病表型及统计数据

在对转基因小麦受禾谷镰刀菌侵染后毒素分析的基础上，对转基因小麦进行了抗病性调查。包括利用ubiquitin启动子下强制表达的过量表达转基因株系，受体材料为小麦品种fielder；以及利用thfhb7供体材料原始启动子在小麦品种科农199中转化产生的原始表达转基因株系，并进行了相关抗病性调查。

按上述方法制备禾谷镰刀菌孢子悬浮液，调整浓度到2×10⁵个/ml，取10μl孢子悬浮液接种于穗的中上部，同时套袋保湿。当孢子在小穗上萌发，能看到明显菌丝时，去袋。每个株系接种30个穗子左右，观察发病情况，并统计接种21d后的发病小穗数，并进行差异性分析。结果见图4所示，发现过量表达及原始表达的转基因株系的发病小穗数均显著小于对照受体材料。

结论：通过构建thfhb7基因的过量表达载体和原始表达载体。将这两个载体分别转入相应的小麦受体中得到t0植株，通过pcr以及rt-pcr筛选，将thfhb7高表达小麦品系进行严格自花授粉至t3。利用单花滴注法，对阳性转基因株系进行抗赤霉病穗部鉴定，过量表达与原始表达转基因株系的发病小穗数显著低于对照受体材料。以上实验结果表明thfhb7的表达能显著提高小麦的赤霉病抗性。

实施例2

本实施例为转基因小麦抗多种镰刀菌，并抗茎基腐病实验。

1.实验材料：

植物材料科农199、thfhb7原始表达核转基因株系以及菌株材料小麦赤霉病优势菌种禾谷镰孢菌(f.graminearum，或f.g)、亚洲镰孢菌(f.asiaticum)，小麦茎基腐优势菌种假禾谷镰孢菌(f.pseudograminearum)均由本实验室保存。

2.实验方法

采用类似于前述方法活化镰孢菌菌株，保存备用。将挑选饱满的转基因受体材料科农199与转基因株系种子培养至两叶一心到三叶一心，选取叶片平整、宽度一致的部位分割成3-3.5cm的叶段，要求叶段断口整齐，不要造成叶肉组织损伤，在叶段的上表面中间位置制造一个圆形伤口，圆形伤口部位接种1-2.5μl浓度为2×10⁵个/ml的不同镰孢菌孢子悬浮液，每个菌种做24个重复，在25℃且湿润条件下，培养3天，观察病斑延展情况。

选取长势一致的jm22与rjm22幼苗，培养至4叶一心，在茎基部利用移液器枪头制造一个规则圆形伤口，并在伤口部位2.5μl假禾谷镰孢分生孢子悬浮液；在28℃条件下，保湿发病15d，观察植株的发病情况，统计死亡率。

3.实验结果

3.1离体叶片多菌种抗性鉴定

通过离体的叶子fhb转基因株系对镰孢菌种的广泛抗性进行鉴定，将幼苗培养至两叶一心到三叶一心，选取相同叶位，并将叶片分割成3-3.5cm的叶段，要求叶段断口整齐，不要造成叶肉组织损伤，在叶段的上表面中间位置用移液器墙头制造一个圆形伤口，圆形伤口部位接种2.5μl浓度为2×10⁵个/ml的不同镰孢菌孢子悬浮液，每个菌种做24个重复，在25℃且湿润条件下，培养3天，观察病斑延展情况。禾谷镰孢菌和亚洲镰孢菌是引起赤霉病的两个主要菌株。假禾谷镰孢菌是造成小麦茎基腐的主要菌株。首先用移液器枪头在两叶一心幼苗的离体叶片中心制造一个圆形伤口，并在伤口部位接种2μl镰孢菌分生孢子悬浮液，并在25℃下保湿发病3天。然后测量坏死斑的面积以用于镰孢菌抗性评估。结果如图5(a)、图5(b)和图5(c)所示，转thfhb7基因植株相比于感病对照科农199在接种禾谷镰孢菌、亚洲镰孢菌，假禾谷镰孢菌这三个菌种的孢子悬浮液的条件下叶片的病斑面积均显著减小。

3.2茎基腐抗性结果

利用茎基部伤口接种的方法，对受体材料和thfhb7转基因材料接种假禾谷镰孢菌分生孢子悬浮液15d后，结果如图6(a)所示，结果表明转基因小麦茎基部发病程度相比对照减轻。图6(b)结果表明，转thfhb7基因植株的死亡率显著低于野生型。此外，f.pseudograminearum是造成小麦茎基腐的优势菌种。图6(a)中通过用移液器枪头在四叶一心小麦幼苗茎基部制造一个圆形伤口，并在伤口部位接种2μl镰孢菌分生孢子悬浮液，并在25℃下保湿发病15d，观察茎基腐发病情况。图6(b)是在25℃下发病15d后，统计死亡率并进行差异性分析。

结论：通过利用转thfhb7基因株系与受体材料科农199的离体叶片对thfhb7转基因株系对镰孢菌种的广泛抗性做了鉴定，结果发现禾谷镰孢菌、亚洲镰孢菌，假禾谷镰孢菌这三个菌种在叶片上的病斑面积均显著小于感病对照，说明thfhb7对镰孢菌具有一个比较广谱的抗性；其中假禾谷镰孢菌是造成小麦茎基腐的优势菌种。另外，实验通过jm22为背景含thfhb7的短片段易位系材料r-jm22以及转thfhb7基因株系通过接种假禾谷镰孢菌鉴定这两个材料的小麦茎基腐病抗性，结果与叶片表型相符合，两种材料均表现出良好的小麦茎基腐病抗性，说明thfhb7可以提高小麦对茎基腐病的抗性。

实施例3

本实施例为转基因玉米t0代植株的初步抗性实验。

1.实验材料

十倍体偃麦草用以扩增目的基因thfhb7序列片段，过量表达载体转化受体材料为kn5585。表达载体pcambia3300由中国农业科学院提供，大肠杆菌(escherichiacoli)dh5α菌株均由实验室保存。

2.实验方法

采用与实施例1类似的方法，由山东农业大学国家重点实验室进行玉米转基因。同时，采用前述方法进行转thfhb7基因玉米植株的pcr检测、rt-pcr检测和植株抗赤霉病表型鉴定。

将转thfhb7的t3植株挑选出阳性转基因苗培养至两叶一心，选取叶片平整、宽度一致的部位分割成3-3.5cm的叶段，要求叶段断口整齐，不要造成叶肉组织损伤，在叶段的上表面中间位置制造一个圆形伤口，圆形伤口部位接种1-2.5μl浓度为2×10⁵个/ml的禾谷镰刀菌孢子悬浮液，每个突变体做10个重复，在25℃且湿润条件下，培养3天，观察病斑延展情况。

3.实验结果

3.1转thfhb7基因植株赤霉病抗性鉴定

利用三个t3转基因阳性株系(w1、w2、w3)的离体叶部表型，对转thfhb7玉米植株的赤霉病抗性进行鉴定。在离体叶片中心制造圆形伤口，并在伤口上接种禾谷镰刀菌孢子悬浮液；在湿润条件下培养3天，统计病斑大小并与对照进行差异性分析。

挑选出三个高表达的t3转基因株系，通过使用离体叶子用于赤霉病抗性评估，与受体材料感病对照相比，病斑面积显著减小。统计接种3天后的坏死斑的面积，并且每个样品的统计中至少使用10片离体的叶片。实验结果如图7所示，实验结果表明，通过构建thfhb7基因的一个过量表达载体，并转入玉米中得到t0植株，通过pcr以及rt-pcr筛选，将thfhb7高表达玉米株系进行离体叶片抗病鉴定，对阳性转基因株系赤霉病抗性鉴定，转基因玉米离体叶片的病斑面积显著小于感病对照。该实验初步说明thfhb7的表达也能显著提高玉米对禾谷镰刀菌侵染的抵抗能力。

实施例4

本实施例为针对核酸分子的突变及其功能研究。

1.实验材料

济麦22为背景并杂交导入thfhb7的小麦材料，编号a052-2、a079-3由本实验室前期创制并保存。

2.突变群体的构建

实验室前期根据ems预处理实验结果，选取0.8％的ems溶液避光处理，在25℃条件下，150rpm震荡10h，之后用自来水持续冲洗3-4h，每次处理2500粒种子，分4批共处理了10000粒种子，全部种于大田。m1植株严格套袋自交，成熟后每株取1粒种子，形成m2单粒传群体。每个m2单株均挂牌编号并取叶片用于后续dna提取，成熟后按单株收获。

3.tilling检测

3.1pcr扩增

由于该基因的全长为864bp，因此我们使用传统的sanger测序平台对基因的全长进行测序并筛选突变体。thfhb7的全长引物

f：5'-ttcatcatcctgctaggcgataaga-3'

r：5'-ctacttcacctcggggcatacttgtc-3'

我们利用ung酶处理与使用dutp的靶向预扩增结合使用，在pcr中，脱氧胸苷三磷酸(dttp)用脱氧尿苷三磷酸(dutp)代替。在启动pcr之前，使用尿嘧啶dnan-糖基化酶(ung)将降解任何含尿嘧啶的pcr产物，即消除残留污染物。pcr扩增是在10μl的总体积反应中进行的，其中包含1xmultiplexpcrmastermix(ung)(cwbiobio，中国)，0.7μm的每种引物和100ng的模板dna。扩增曲线包括在50℃下1个循环2-8分钟和在95℃下5分钟的循环，然后是35个循环，分别在94℃下30s，60℃下30s和72℃下50s最后在72℃下延长10分钟。每个点突变的纯合和杂合状态通过dnaman手动检查信号峰图进行验证。筛选纯合突变体用于fhb抗性的进一步表型鉴定。

3.2抗赤霉病表型鉴定

将挑选出的纯合突变体植株培养至两叶一心到三叶一心，选取叶片平整、宽度一致的部位分割成3-3.5cm的叶段，要求叶段断口整齐，不要造成叶肉组织损伤，在叶段的上表面中间位置制造一个圆形伤口，圆形伤口部位接种1-2.5μl浓度为2×10⁵个/ml的禾谷镰刀菌孢子悬浮液，每个突变体做10个重复，在25℃且湿润条件下，培养3天，观察病斑延展情况。

4.实验结果

4.1突变体筛选

通过直接测序(sanger)thfhb7的全长pcr产物(引物同前)，筛选了约4000m2突变株的突变。为了避免pcr期间可能的模板污染，在pcr中使用了脱氧尿苷三磷酸(dutp)代替了脱氧胸苷三磷酸(dttp)，并进行了尿嘧啶dnan-糖基化酶(ung)处理以降解模板中任何含尿嘧啶的pcr产物。最终筛选获得了24个氨基酸变化的突变体，其部分图编序列比对结果见图8所示。

4.2突变体抗赤霉病表型鉴定

突变体抗赤霉病表型鉴定结果如图9所示，对含有thfhb7小麦株系进行ems诱变。通过使用离体的叶子用于赤霉病抗性评估，共有7个在cds区域具有氨基酸改变的突变体与抗病对照有显著差异。统计接种3天后的坏死斑的面积，并且每个样品的统计中至少使用10片离体的叶片。

经ung酶处理与使用dutp的靶向预扩增结合使用，消除残留污染以及假阳性的方法，最终筛选获得了24个突变体。通过使用离体的叶子对赤霉病抗性进行评估，thfhb7基因的7个与抗病对照有显著差异的突变体中有5个错义突变、2个终止突变；这7个突变体感病程度虽存在一定差异，但病斑面积均显著大于抗病对照(图9中突变体坏死斑的面积统计)。经功能分析，在24个突变体中均不同程度地保留了原去环氧基活性。其中终止突变位于thfhb7的c端，分别终止于209位和243位氨基酸，但这两种终止不会导致该酶的功能完全丢失。因此，表明该酶的功能结构域主要是n端。另外，突变体中第34、48、98、99和106的5种错义突变，对于去环氧基活性影响较大。因此，可以为认定为关键氨基酸。

实施例5

本实施例为同源序列基因的功能分析。

1.序列对比

在长穗偃麦草的去环氧基酶基因的序列(seqidno.1)的基础上，通过ncbi进行blastn比对，在默认参数的情况下，未搜到任何注释的高度同源基因。ncbi比对结果见图10所示。但根据菌属存在同源基因的信息，发明人联合搜索了其他实验室的基因组数据库，获得了11条来源于该菌属的序列，其序列分别如seqidno.:25-35所示。如图11所示，这些序列与长穗偃麦草十倍体的去环氧基酶基因具有90％以上的序列同一性。另外，发明人还从长穗偃麦草二倍体中分离得到与十倍体的去环氧基酶基因的序列同一性为98％的基因，其序列如seqidno.2所示。

2.thfhb7基因同源的序列转入毕赤酵母的毒素及其衍生物实验

从菌属中获得11条同源基因，经测序验证序列正确，利用ppiczαa-thfhb7构建同源序列的酵母表达载体。然后利用saci将重组质粒线性化，将1ml单链dna样品煮沸5分钟，然后在冰上快速冷却。保持冰上。离心酵母感受态，并用移液管除去licl。对于每个转化，按照给细胞的顺序添加以下试剂。peg保护细胞免受高licl浓度的有害影响。剧烈涡旋每个试管，直到细胞沉淀完全混合(约1分钟)。将试管在30℃孵育30分钟。在42℃的水浴中热冲击20-25分钟。以6000至8000rpm离心细胞以沉淀。将沉淀重悬于1ml的ypd中，并在30℃振荡孵育。1小时和4小时后，在含有适当浓度zeocintm的ypd平板上平板接种25至100μl。将平板在30℃下孵育2-3天。挑选10个单菌落富集培养，提取酵母染色体dna，pcr检测阳性重组菌。通常采用ppiczαa通用引物进行pcr鉴定，若以酵母表达载体ppiczαa为模板，则可以扩增出目的片段；若以ppiczαa-thfhb7同源序列为模版，则将扩增出目的条带+588bp大小的目的片段。

3.同源序列的表达与毒素处理

将筛选到的阳性酵母单菌落(x33/ppiczαa-thfhb7同源序列)与阴性酵母单菌落(x33/ppiczαa)分别接种于25ml的bmgy培养基，28℃-30℃培养至od600为2-6。室温4000rpm离心5min，弃去上清，收集细胞，用50ml-100ml(0.5％-1％甲醇)bmmy液体培养基重悬细胞至od600＝1左右，转移至500ml的锥形瓶中，28℃-30℃培养，每24h向其中加入甲醇至终浓度为0.5％以保持诱导表达。在诱导48h后，分装菌液5ml到15ml离心管中，并向其中加入多种单端孢霉烯族化合物至终浓度为25μg/ml，继续诱导48h-72h，收集菌体，用于lc-hrms分析。

4.lc-hrms分析

将分装的样品于4℃条件下，离心弃去上清。置于液氮中速冻，加入少许石英砂，用塑料研磨棒研磨后，加入预冷的1.3ml75％的甲醇水(含有0.1％甲酸)。震荡10s，室温下超声30min，取上清后转移至一新的离心管中。真空浓缩至干粉状。进样前用100ul20％乙腈重悬，通过0.22μm滤膜过滤后，转移到进样小瓶中进行lc-hrms检测。

lc-hrms(/ms)分析使用xcalibur2.1.0分析数据。采用所提出的生物转化产物的色谱峰形状，保留时间(±0.2分钟)和质量(±5ppm)对毒素及其衍生物的提取离子色谱图(eic)进行了研究。根据二级图谱以及物质基本结构解析中性丢失，推测化学结构。

通过将这些基因分别转入酵母细胞表达为对应的蛋白，并利用lc-hrms进行分析。实验结果如图12所示。其他12个同源序列转入毕赤酵母中，经don处理。lc-hrms检测显示均有don-gsh的生成。在lc-hrmsdon处理转基因酵母提取的离子色谱图，正离子模式提取到don-gsh加合物，m/z604.21730(对应于[m+h]⁺，δ±5ppm)。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

序列表

<110>山东农业大学

<120>核酸分子在植物转基因、分子育种、病害防治和分子标记物中的用途

<130>bh2000026-1

<141>2020-03-05

<160>35

<170>siposequencelisting1.0

<210>36

<211>846

<212>dna

<213>tinopyrum_ponticum_(wild_type_for_mutants)

<400>36

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<210>37

<211>846

<212>dna

<213>tinopyrum_elongatum

<400>37

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<213>tinopyrum_ponticum

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