一种抗神经坏死病毒的单克隆抗体及其制备方法与流程

本发明涉及一种单克隆抗体及其制备方法，具体涉及一种抗神经坏死病毒的单克隆抗体及其制备方法，其属于鱼类分子免疫学技术领域。

背景技术：

神经坏死病毒（nervousnecrosisvirus，nnv)是一种世界范围内流行、严重危害多种海水和淡水鱼类的传染性病原，其主要感染鱼类的神经系统和视网膜，导致神经系统和视网膜的空泡化坏死，故因其引起的病症被称为病毒性神经坏死症或病毒性脑病和视网膜病。nnv存在垂直和水平两种传播途径，宿主众多，分布广泛。到目前为止，已知可被nnv感染的鱼类超过120种，在除南极洲以外的其余大陆均有相关报道。nnv属野田村病毒科（nodaviridae）乙型野田村病毒属（betanodavirus），病毒粒子为无囊膜的二十面体，直径约25nm，基因组由两个单股正链rna组成。其中，rna1（3.1kb）编码非结构蛋白a，即rna依赖性rna聚合酶（110kda）；rna2（1.4kb）编码病毒衣壳蛋白（cp，42kda），为病毒的唯一结构蛋白。

根据rna2核苷酸序列的t4可变区，可将nnv划分为4种基因型，分别为拟鲹神经坏死病毒型（sjnnv型）、鲀神经坏死病毒型（tpnnv型）、鲽神经坏死病毒型（bfnnv型）和石斑鱼神经坏死病毒型（rgnnv型）。其中，rgnnv是存在最为普遍的基因型。进一步研究表明，nnv主要分为三种血清型，分别为血清型a（sjnnv），血清型b（tpnnv）和血清型c（bfnnv和rgnnv）。目前，4种基因型nnv的基因组测序已经全部完成，序列比对分析表明，不同基因型的nnv基因组序列具有不同程度的相似性。

自首次在广东省大亚湾孵化的赤点石斑鱼（epinephelusakaara）中发现nnv以来，nnv在我国养殖或野生的斜带石斑鱼（epinepheluscoioides）、珍珠龙胆石斑鱼（epinepheluslanceolatus♂×epinephelusfuscoguttatus♀）、牙鲆（paralichthysolivaceus）、半滑舌鳎（cynoglossussemilaevisgunther）、太平洋真鳕（gadusmacrocephalus）等鱼类中相继报道（均为rgnnv型），其引起的病害给我国水产养殖业造成了巨大的经济损失。然而，关于nnv的入侵途径，在宿主细胞内的感染机制和复制过程尚不明确。且nnv主要感染特异性免疫系统尚未充分发育的稚苗期，无法使用常规免疫法来防治。因此，制备抗nnv的单克隆抗体，对于快速诊断病原并及时切断传播途径、鉴定病毒感染的受体靶点、跟踪病毒的复制过程、检测病毒的变异及分型等，均具有重要现实意义。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种抗nnv的单克隆抗体，用于快速检测nnv的存在，为精确诊断鱼体内是否携带nnv提供重要的免疫学工具。

本发明的另一个目的是提供一种上述抗nnv的单克隆抗体的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种抗nnv的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株nnv-cp-3d11，保藏号为：cctccno：c202037，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2020年01月15日的杂交瘤细胞分泌的。

所述杂交瘤细胞株nnv-cp-3d11是以nnv衣壳蛋白多肽-血蓝蛋白（klh）复合物作为抗原制备的，所述nnv衣壳蛋白多肽的氨基酸序列结构为：²⁴rrrannrrrsnrtdap³⁸。

所述单克隆抗体经间接酶联免疫吸附实验结果显示能与未偶联klh的nnv衣壳蛋白多肽和nnv均发生特异性结合。

所述单克隆抗体能特异性识别分子量约为40kda的nnv衣壳蛋白天然蛋白，显示紫褐色条带并经质谱验证。

所述单克隆抗体与部分nnv感染48h的ssn-1细胞发生特异性结合，呈现荧光信号，在100倍下能够观察到荧光信号在细胞质及细胞膜处呈散点状分布。

一种所述抗nnv单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：运用生物信息学软件预测分析nnv衣壳蛋白抗原表位，选择抗原性强的15个氨基酸（²⁴rrrannrrrsnrtdap³⁸）作为抗原肽，通过多肽合成技术合成并偶联klh载体，以偶联载体的多肽免疫balb/c小鼠，采用细胞融合法制备杂交瘤细胞，经间接酶联免疫吸附实验、免疫印迹和间接免疫荧光实验，筛选出稳定分泌抗nnv单克隆抗体的杂交瘤细胞株nnv-cp-3d11，采用常规方法扩大培养上述所得到的杂交瘤细胞株，收集细胞培养上清液，经纯化后得到抗nnv的单克隆抗体。

间接酶联免疫吸附反实验结果显示，本发明的单克隆抗体能与未偶联klh的nnv衣壳蛋白多肽以及nnv均发生特异性结合。免疫印迹结果显示，本发明的单克隆抗体能特异性识别分子量约为40kda的nnv衣壳蛋白天然蛋白。间接免疫荧光实验结果显示，本发明的单克隆抗体能特异性识别感染的ssn-1细胞中的nnv。

在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该杂交瘤细胞分裂旺盛、外观饱满、浑圆、折光性强、细胞大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞有无限分裂增生能力；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，其培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量抗nnv的单克隆抗体。

本发明的优点在于：本发明制备的抗nnv单克隆抗体为快速检测与诊断鱼体内是否携带nnv提供了重要工具。本发明重要的制备技术路线是：运用生物信息学软件分析预测nnv衣壳蛋白的抗原表位，选择抗原性强的15个氨基酸合成并偶联klh，以多肽-klh复合物作为免疫原免疫小鼠，采用细胞融合法制备杂交瘤细胞，再经过免疫学检测筛选方法筛选出抗nnv的单克隆抗体。这样的制备技术路线设计新颖，严密而合理。

由于使用的间接酶联免疫吸附实验，通过包被未偶联klh的nnv衣壳蛋白多肽和nnv于酶标板上，使得确认该发明的单克隆抗体与nnv衣壳蛋白多肽和nnv发生反应。本发明的制备方法将免疫印迹、质谱分析技术和间接免疫荧光实验结合起来，能够更加直观的证明本发明的单克隆抗体与nnv发生特异性结合反应。

本发明根据鱼体内是否携带nnv，从而可判断鱼体的健康状况，进而及时切断传播途径，以有效阻止病毒的传播，减少病毒感染带来的经济损失。

附图说明

图1为nnv衣壳蛋白的抗原表位参数分析图。

其中，a为亲水性，b为α螺旋，c为β转角，d为柔韧性，e为抗原性，f为表面可及性。

图2为nnv衣壳蛋白的b细胞线性抗原表位预测图。

图3为间接酶联免疫吸附实验分析单克隆抗体对nnv衣壳蛋白多肽的特异性结合图。

其中，1表示单克隆抗体与nnv衣壳蛋白多肽发生结合反应的od值；2表示骨髓瘤细胞上清液与nnv衣壳蛋白多肽反应的od值，即阴性对照；3表示未包被nnv衣壳蛋白多肽组，即空白对照。

图4为间接酶联免疫吸附实验分析单克隆抗体对nnv的特异性结合图。

其中，1表示单克隆抗体与nnv发生结合反应的od值；2表示骨髓瘤细胞上清液与nnv反应的od值，即阴性对照；3表示未包被nnv组，即空白对照。

图5为免疫印迹法分析单克隆抗体与浓缩的nnv悬液的特异性结合反应图。

其中，条带1表示分子量标准蛋白；条带2表示浓缩的nnv悬液的sds-page图谱；条带3表示单克隆抗体与浓缩的nnv悬液中40kda蛋白发生结合反应；条带4表示阴性对照。

图6为单克隆抗体与浓缩的nnv悬液的特异性结合反应后，40kda蛋白切胶质谱图。

其中，a为nnv衣壳蛋白氨基酸序列，划线部分为质谱匹配到的氨基酸序列；b为质谱结果的肽指纹图谱，星号标记的为匹配到的峰值。

图7为间接免疫荧光实验分析单克隆抗体与感染的ssn-1细胞中nnv的特异性结合反应图。

其中，a1表示在100倍物镜下观察的单克隆抗体与感染的ssn-1细胞中nnv发生特异性结合反应，荧光信号强，a2为dapi衬染的细胞核，a3为a1、a2的叠加图；b1为骨髓瘤细胞上清液孵育感染的ssn-1细胞，即阴性对照，b2为dapi衬染的细胞核，b3为b1、b2的叠加图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。

实施例1：神经坏死病毒衣壳蛋白抗原肽的制备及单克隆抗体的研制。

一、抗原肽的制备

（1）采用dnastar软件中的protein程序对nnv衣壳蛋白抗原表位参数进行分析，参数主要包括亲水性（hydrophilicityplot-kyte-doolittle）、α-螺旋（alpha,amphipathicregions-eisenberg）、β-转角（beta,amphipathicregions-eisenberg）、柔韧性（flexibleregions-karplus-schulz）、抗原性（antigenicindex-jameson-wolf）和表面可及性（surfaceprobabilityplot-emini）。综合各参数，将位于β-转角和无规则卷曲区域，且亲水性指数≥0、表面可及性指数≥1和抗原性指数≥0的氨基酸区段作为潜在表位。从图1中可以看出nnv衣壳蛋白抗原表位可能存在的位置；

（2）采用iedb在线预测软件，结合dnastar软件分析结果，对nnv衣壳蛋白抗原表位进一步预测，选取综合评分较高的区域作为候选b细胞线性抗原表位。预测出12个可能的b细胞线性表位，主要位于6-55、68-77、114-123、127-138、155-161、171-179、211-223、227-236、247-254、268-275、286-294、313-321氨基酸区段（图2）；

（3）综合以上预测数据，最终确定候选抗原肽。首先，选取位于二级结构中的无规则卷曲和β-转角区域的抗原肽。其次，分析抗原表位参数及预测的潜在抗原表位，确定抗原肽的具体位置。最后，参考抗原肽人工合成的难易程度和与klh偶联的锲合度，选择的nnv衣壳蛋白抗原肽为²⁴rrrannrrrsnrtdap³⁸。抗原肽由生物公司合成并偶联klh载体，纯度经质谱验证。

二、免疫

用nnv衣壳蛋白多肽-klh复合物作为免疫原免疫小鼠。每次的免疫剂量为1mg，免疫共分4次进行，前2次免疫间隔为2周，后3次免疫间隔为1周，前两次为腹腔注射，后两次为尾静脉注射：

（1）基础免疫：nnv衣壳蛋白多肽-klh复合物与弗氏完全佐剂等量（v/v）混匀作为免疫原；

（2）加强免疫：nnv衣壳蛋白多肽-klh复合物与弗氏不完全佐剂等量（v/v）混匀作为免疫原；

（3）二次加强免疫：nnv衣壳蛋白多肽-klh复合物作为免疫原；

（4）融合前三天的加强免疫：nnv衣壳蛋白多肽-klh复合物作为免疫原。

三、细胞融合

（1）采用乙醚麻醉小鼠，无菌条件下取出脾脏和胸腺后，分别过100目网筛，用1640培养基吹打形成单细胞悬液。本发明中关于实验动物的处理均符合动物福利的要求；

（2）分别将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液1000rpm离心3min，弃去上清液，脾细胞沉淀用1640培养基重悬，胸腺细胞沉淀用含有1%hat的1640(含10%胎牛血清)选择性细胞培养基重悬；

（3）取大约3×10⁷个处于对数生长期的p3-x63-ag8u1骨髓瘤细胞，1000rpm离心3min，去上清液后，用1640培养基重悬；

（4）将脾细胞悬液与瘤细胞悬液混合均匀后，1000rpm离心3min，完全吸去上清液，轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混匀成糊状；用吸管吸取预热到37℃的聚乙二醇（peg）溶液lml，于1min内匀速滴加到离心管内，然后在37℃水浴中静置5min；

（5）继续滴加预热到37℃的1640培养基15ml，使peg稀释而失去作用；

（6）补加1640培养基至40ml，经1000rpm离心3min，弃去上清液；

（7）将沉淀的细胞用3ml预热到37℃的1640（含10%胎牛血清）培养基重悬，冻存2ml；

（8）将剩下的1ml细胞悬液加入(2)制成的胸腺细胞悬液，混合均匀后滴加到96孔培养板中；

（9）将培养板放入37℃，co2浓度为4.5%的培养箱中培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，大约两周后，取杂交瘤细胞培养上清液检测。

四、筛选和克隆

(1）筛选：融合后，待杂交瘤细胞群长至占96孔培养板孔底面积约1/3时开始检测，采用间接酶联免疫技术筛选阳性杂交瘤细胞；

①包被抗原：将未偶联klh的nnv衣壳蛋白多肽用碳酸盐包被液（ph9.6）稀释至浓度为50µg/ml，加入96孔酶标板中（100µl/孔），4℃下包被过夜；

②吸出包被液，用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（pbst）洗涤，每次5min，洗三次；

③每孔加入200µl3%的牛血清白蛋白封闭液（3%bsa封闭液），37℃下封闭1h；

④同②洗涤三次；

⑤将杂交瘤细胞培养上清液作为第一抗体，按每孔50µl加入酶标板，37℃温箱孵育1h；

⑥同②洗涤三次；

⑦将碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠ig单抗（1:4000稀释）作为第二抗体，按每孔50µl加入酶标板，37℃温箱孵育1h；

⑧同②洗涤三次；然后每孔加入100µl4-硝基酚磷酸盐（pnpp）应用液，暗处反应5~20min，每孔加入50µl2m的naoh溶液，稳定3~5min即可用405nm工作波长测定od值。

以骨髓瘤细胞上清液作为阴性对照，以不测波长为405nm时各孔光吸收值，计算各实验孔与阴性对照光吸收值之比（p/n），当p/n≥2.1时该孔为阳性。

（2）克隆：采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆，步骤如下：

①采用乙醚麻醉小鼠后，无菌条件下取出胸腺，在100目网筛上研磨，用1640培养基吹打形成单细胞悬液；

②把胸腺细胞悬液1000rpm离心3min，弃去上清液,胸腺细胞沉淀用10ml1640(含10%胎牛血清)细胞培养液重悬；

③把要克隆的阳性细胞孔中的细胞用血球记数板记数，然后用培养液以10倍梯度稀释，取出100个杂交瘤细胞，放入胸腺细胞悬液中；

④细胞悬液用滴管吹打均匀，滴加到96孔培养板中，每孔100µl，平均每个孔含有一个杂交瘤细胞；

⑤放入co2培养箱中培养；

⑥两周后通过间接酶联免疫技术检测各孔杂交瘤细胞培养上清，把所得阳性克隆孔的杂交瘤细胞按上述方法再克隆一次，以保证形成单克隆。

五、冻存

取生长旺盛，形态良好的杂交瘤细胞，制成细胞悬液，1000g离心3min，弃去上清，加冻存液（9份1640培养基+1份二甲亚砜），使最终细胞密度为5×10⁶个/ml，将1ml细胞悬液装于2ml冻存管中，拧紧螺盖，然后将冻存管装入盛有棉花的小盒内，放于-80℃超低温冰箱内过夜（8~12h）后，再浸入液氮内长期保存。本发明获得的生长旺盛，形态良好的杂交瘤细胞，其名称为：杂交瘤细胞株nnv-cp-3d11，保藏号为：cctccno：c202037，保藏日期为：2020年01月15日。

实施例2：本发明单克隆抗体的间接酶联免疫吸附实验鉴定。

(1)包被抗原：将未偶联klh的nnv衣壳蛋白多肽与浓缩的nnv悬液分别用碳酸盐包被液（ph9.6）稀释至浓度为50µg/ml，加入96孔酶标板中（100µl/孔），4℃下包被过夜；

(2)吸出包被液，用pbst洗涤，每次5min，洗三次；

(3)每孔加入200µl3%bsa封闭液，37℃下封闭1h；

(4)同(2)洗涤三次；

(5)将上述筛选和克隆出的杂交瘤细胞培养上清液作为第一抗体，按每孔50µl加入酶标板，37℃温箱孵育1h；

(6)同(2)洗涤三次；

(7)碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠ig单抗（1:4000稀释）作为第二抗体，按每孔50µl加入酶标板，37℃温箱孵育1h；

(8)同(2)洗涤三次；然后每孔加入100µlpnpp反应液，暗处反应5~20min，每孔加入50µl2m的naoh，稳定3~5min即可用405nm工作波长测定od值。

用骨髓瘤细胞上清液作为阴性对照，包被pbs作为空白对照，测波长为405nm时各孔光吸收值，计算阳性孔与对照孔吸收值之比（p/n），当p/n≥2.1时为阳性。

结果：未偶联klh的nnv衣壳蛋白多肽作为底物中，阳性孔吸光值为0.8225；阴性对照为0.0939，空白对照为0.0961，此结果证实本发明单克隆抗体能与nnv衣壳蛋白多肽发生特异性结合反应（图3）。浓缩的nnv悬液作为底物中，阳性孔吸光值为0.5475；阴性对照为0.0932，空白对照为0.0994，此结果证实本发明单克隆抗体能与nnv发生特异性结合反应（图4）。

实施例3:本发明单克隆抗体的免疫印迹法鉴定。

（1）十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳：

①将浓缩的nnv悬液分别加入等比例含十二烷基磺酸钠的样品缓冲液，在沸水中煮3~5min；

②将①处理过的样品加入上样孔，每孔内加样品10µl，在恒流条件下进行电泳；起始时用低电流(30-40ma)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电流（50-70ma），直至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取出凝胶；凝胶部分用于转膜，部分放置在考马斯亮蓝染液中染色1h；

③剪取一块与电泳凝胶大小相同的硝酸纤维素膜(孔径0.22µm)，置于转移缓冲液（25mmol/ltris-base，192mmol/l甘氨酸，20%甲醇，ph8.3）中润湿后，放在电泳过的凝胶上。在硝酸纤维素膜上剪掉一个角，以标志样品顺序的起始端。用润湿的滤纸支持，将第二块润湿的滤纸贴在凝胶片的另一面；按上述放置顺序，使胶块与硝酸纤维素膜及滤纸形成一套夹心的“三明治”；

④将“凝胶三明治”置入盛有转移缓冲液的电泳槽内，将硝酸纤维素膜面向阳极，凝胶面向阴极，200ma恒流条件下电泳5h；

⑤转移完毕，取出硝酸纤维素膜。

（2）免疫印迹：

①将硝酸纤维素膜用pbs洗10min，然后置于3%bsa封闭液中，37℃下封闭1h，；

②用pbst洗3次，每次5min；

③将硝酸纤维素膜置于杂交瘤细胞培养上清液中，37℃缓慢摇动1h；以骨髓瘤细胞上清液孵育硝酸纤维素膜作为阴性对照；

④同②洗涤三次；

⑤将硝酸纤维素膜置于碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠ig单抗(1:4000稀释)中，37℃缓慢摇动1h；

⑥同②洗涤三次；

⑦把硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶发色液（nbt-bcip发色液）中发色，直到颜色清晰为止；

⑧用去离子水洗涤，以终止反应。将硝酸纤维素膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存；

同时把放置在考马斯亮蓝中的凝胶在沸水中煮至条带清晰，硝酸纤维素膜上发出紫褐色条带的位置对应到凝胶上，将对应的条带小心切下送去质谱。

结果：本发明单克隆抗体与浓缩的nnv悬液40kda蛋白发生特异性反应（图5），显示紫褐色条带，而阴性对照无条带显示。将40kda对应的凝胶条带切下质谱，质谱结果证明单克隆抗体所识别的蛋白确实为nnv衣壳蛋白（图6）。

实施例4：本发明单克隆抗体的间接免疫荧光方法鉴定。

（1）当ssn-1细胞铺满培养瓶瓶底80%以上时，以病毒量moi=0.1的nnv接种细胞，感染48h后，收集细胞悬液，用pbs将浓度调整到约1×10⁷个/ml；

（2）把ssn-1细胞悬液滴在干净的载玻片上，每滴10µl，在湿盒中室温下沉降2h后，加入丙酮固定20min，取出风干；

（3）将3%bsa封闭液加在载玻片的细胞样品上，37℃湿盒中封闭1h；

（4）取出载玻片，用pbst洗三次，每次5min；

（5）以杂交瘤细胞培养基上清液作为第一抗体，阴性对照为骨髓瘤细胞培养基上清，加在载玻片的细胞样品上，37℃湿盒中孵育1h；

（6）同（4）洗涤3次；

（7）以异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠ig单抗（1:3000稀释）作为第二抗体，加在细胞样品上，37℃湿盒中孵育1h；

（8）同（4）洗涤3次；

（9）以dapi（1:3000稀释）作为细胞核衬染，加在细胞样品上，室温孵育15min；

（10）同（4）洗涤3次，荧光显微镜下观察。

结果：本发明单克隆抗体与部分ssn-1发生特异性结合，呈现荧光信号，在100倍下能够观察到荧光信号在细胞质及细胞膜上呈散点状分布，几乎不存在于细胞核中，这与nnv感染时在细胞质中增殖这一事实相吻合，而阴性对照则没有观察到荧光信号（图7）。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明请求保护的范围。