一种用于人葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的基因突变检测试剂盒的制作方法

本发明属于基因突变检测领域，特别涉及一种用于人葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的基因突变检测试剂盒。
背景技术：
：目前，人葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)缺乏症诊断的方法包括酶学诊断和基因诊断两大类，其中g6pd酶活性检测方法因其具有操作简单、方便快捷、价格低廉等诸多优点已在临床诊断和筛查中被广泛应用，但对于不同基因突变所导致的g6pd缺乏症，酶学诊断本身存在方法学的局限性，且由于g6pd不稳定，酶活性测定容易受到标本采集、递送时间、检测方法等因素的影响，因此假阳性率极高。现有的基因诊断方法可较好的解决g6pd缺乏症女性杂合子检出的问题，但是当前常规的基因诊断方法也普遍存在操作繁琐、通量低、易存在假阴性或假阳性现象而导致漏诊、误诊等缺点，均无法成为临床基因诊断的最佳选择。例如，等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法需要较为繁琐的聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)后杂交盒洗脱等步骤，杂交及洗脱条件的控制给该方法带来众多误诊及漏诊的可能；多重等位基因特异性pcr法经济、简便，但该方法对引物设计要求较高，且在pcr反应体系中，多对引物可能存在相互干扰，会对结果产生影响；高分辨率熔解曲线法操作简便，但对于不同突变位点的检测，往往需要多管操作，通量较低，而单管多位点检测结果较难判读，临床应用受限。cn103695554a等开发了针对g6pd缺乏症诊断用基因检测膜条及相关引物，针对g6pd缺乏症已报道的十余个常见突变位点进行检测，但位点覆盖不够全面，可能会造成漏诊，不利于该疾病的遗传筛查及提前干预等。cn104450925a等利用荧光定量pcr，设计覆盖多数g6pd突变人群的常见位点引物及探针，以对其进行单独分型，但仍存在缺乏标准化程序、仪器规格和试剂选择等的多样性使部分结果重复性差等不足，给其广泛开展带来阻碍。cn104450925a等则利用pcr结合一代测序的方法，扩增g6pd基因所有外显子并进行直接测序，以提高患者及携带者的检出率，但该方法操作复杂，许多外显子扩增效果不佳、存在杂峰或峰图不完整、质量差，较难适用于临床的常规检测。因此，本领域仍然需寻求一种新的g6pd缺乏症疾病遗传检测技术。技术实现要素：本发明针对现有各项诊断方法的不足，提供了一种用于人葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的基因突变检测试剂盒，可弥补现有酶学诊断方法对g6pd缺乏症检测中假阳性率高的缺陷，提高卫生经济学效益。本发明提供了一种用于人葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的基因突变检测试剂盒，包括如seqno.1～382所示序列的探针。进一步的，所述探针与含有某个特异性位点的dna片段杂交。进一步的，所述试剂盒还包括变性混合液、扩增混合液、片段化混合液、沉淀混合液和杂交混合液。进一步的，所述试剂盒在genetitanmc中进行检测。进一步的，所述genetitanmc检测采用的试剂包括染料混合物、稳定混合物和连接混合物。本发明提高了该疾病检测的标准化程度并覆盖更多可能的突变位点，提高诊断准确率，为新生儿筛查和遗传干预提供更为有效的诊断方法，提高人口质量。有益效果本发明通过设计合成捕获探针，可更全面的富集中国人群常见g6pd基因突变型，针对g6pd缺乏症分子遗传特点进行高质量和高效率的遗传学诊断。一方面可弥补现有酶学诊断方法对g6pd缺乏症检测中假阳性率高的缺陷，减少了不必要的受试者召回并利于减轻病人及家属的精神负担，提高卫生经济学效益；另一方面通过更全面的g6pd基因突变热点分析，可解决更多的g6pd缺乏症患者(近99％)遗传突变检测问题，实现g6pd缺乏症疾病遗传诊断的快速和有效进行。附图说明图1为本发明的检测流程图。图2为实施例1中的部分样本dna片段化结果。图3为实施例1中的数据质控结果。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1一、合成芯片通过数据库筛选和人群频率的计算，顺位挑选382个位点，并将这些位点合成相应探针生产成芯片(见表1，部分探针重复设计，是为了在芯片不同位置放置相同的探针，从而增加某些位点的结果准确度)。表1位点编号及序列信息(染色体位置：xq28)二、采集样品经g6pd患者知情同意，获准后采集外周血，共计25例，包括男性患者24例，女性患者1例，均为snv患者，作为验证样品。三、样品制备与检测反应25例验证样品先进行dna抽提，通过凝胶电泳，nanodrop等进行质控，确保每个dna样品胶图清晰可见且均无降解，光密度(opticaldensity,od)260/280比值介于1.8至2.0之间，od260/230比值大于1.5(不满足任一条件的样品需进行纯化等处理)。质检合格的样品先进行全基因组扩增，扩增产物再经过酶切、沉淀回收与重悬等步骤得到dna片段(片段长度为25-125bp，全基因组分布)，重悬液中加入杂交反应试剂，转移至杂交板然后上机进行杂交。杂交结束后再加入配制好的荧光试剂进行连接反应，经过冲洗与成像处理后，即完成检测反应(图1)。具体制备步骤：第一步：dna扩增试剂：module1,–20℃,p/n901711(axiom2.0reagentkit)1.按照以下体系配置变性混合液(denaturationmastermix)：成分1×axiom2.0denatsoln10x2μlaxiomwater18μl2.取20μldna样本(5ng/μl)，分别加入20μl上述变性混合液，室温孵育10min。3.立即加入130μlaxiom2.0neutralsoln，盖好密封膜震荡混匀离心。4.按照以下体系配置扩增混合液(amplificationmastermix)：成分1×axiom2.0ampsoln225μlaxiom2.0ampenzyme5μl旋涡混匀扩增混合液，而后转管2次，再次旋涡混匀。5.将230μl扩增混合液沿管壁缓慢加入样本板中，切忌反复上下吹打，盖好密封膜，震荡混匀2次，1000rpm离心1min。6.将上述样本置于37℃孵育箱中23±1h。第二步：片段化和沉淀试剂：module2-1,–20℃,p/n901528；module2-2,2–8℃,p/n901529(axiom2.0reagentkit)1.将样本置于65℃孵育箱中孵育20min，而后转移至37℃孵育箱中继续孵育45min。2.按照以下体系配置片段化混合液(fragmentationmastermix)：成分1×axiom10xfragbuffer45.7μlaxiomfragdiluent10.3μlaxiomfragenzyme1.0μl3.小心将上述扩增后样本由37℃孵育箱转移至室温，加入57μl片段化混合液，盖好密封膜，震荡混匀2次离心。4.将样本迅速转移至37℃孵育箱中孵育30min，而后加入19μl终止液(室温)，盖好密封膜震荡混匀离心。5.按照以下体系配置沉淀混合液(precipitationmastermix)：成分1×axiomprecipsoln1238μlaxiomprecipsoln22μl6.在室温环境下加入240μl沉淀混合液，盖好密封膜震荡混匀离心。7.加入600μl异丙醇，用移液器上下混匀以保证充分混合，盖好密封膜，并将样本转移至-20℃环境中过夜(16-24h)。第三步：干燥、重悬及质量控制试剂：module2-1,–20℃,p/n901528；module2-2,2–8℃,p/n901529(axiom2.0reagentkit)invitrogentmtrackitcyan/orangeloadingbuffer(invitrogenp/n10482-028)25bpinvitrogenladder(invitrogenp/n10488-022)nucleasefreewater,ultrapurembgrade(usb,p/n71786)invitrogene-geltm484％agarosegelsg8008-041.将样本从-20℃中取出，4℃3200×g离心40min。2.将密封膜小心揭下，并将样本倒置于废液桶上以使液体流出，而后轻轻倒置于无尘纸上5min。3.将样本正置于37℃杂交炉中20min晾干。4.在样本中加入35μlaxiomresuspbuffer，盖好密封膜，置于震荡仪中(titerplateshakers-4pl速度9震荡10min或jitterbug速度7震荡10min)。5.按照以下体系配置杂交混合液(hybridizationmastermix)：成分1×axiomhybbuffer70.5μlaxiomhybsoln10.5μlaxiomhybsoln29μl6.确认5中样本完全重悬后，加入80μl杂交混合液，盖好密封膜震荡混匀离心。7.取33μl无核酸酶水至pcr板中，并混入3μl上述6中混合液，置备为qc稀释液，盖好密封膜震荡混匀离心。8.取10μl上述qc稀释液样本至od板中(96-welluvstarplate,e&kscientificp/n25801)，加90μl无核酸酶水至上述od板中，上下吹打混匀，读取吸光值。9.取120μl1000倍稀释胶上样染料至胶样本板中，并混入3μl上述qc稀释板样本，盖好密封膜震荡混匀离心，跑胶进行质量控制。第四步：变性和杂交试剂：module3,p/n901472(axiom2.0reagentkit)杂交盘，p/n901606(axiomgenetitantmconsumableskit)1.将杂交后的混合液置于室温中5min，短暂震荡后，1000rpm离心30s，并置于室温中至少25min。2.将上述杂交板放置于pcr仪中，开始变性程序(axiom2.0denatureprogram)：95℃for10min；48℃for3min；48℃forhold。3.变性程序结束后，取出杂交板，放置于预热96孔金属槽中。用移液器小心将105μl变性杂交液转移至杂交盘中，切勿产生气泡。4.将上述杂交板载入genetitanmcinstrument仪器中，持续杂交23.5h-24h。第五步：genetitantmmc仪器试剂准备试剂：module4-1,–20℃,p/n901278；module4-2,2-8℃,p/n901276仪器：genetitanmcinstrument耗材：扫描盘(1)、染料盘(5)-axiomgenetitantmconsumableskit(p/n901606)1.按照以下体系配置染料混合物1(stain1mastermix)：成分1×axiomwasha201.6μlaxiomstainbuffer4.2μlaxiomstain1-a2.1μlaxiomstain1-b2.1μl轻轻翻转试管10次以混合，避光置于冰上。2.按照以下体系配置染料混合物2(stain2mastermix)：成分1×axiomwasha100.8μlaxiomstainbuffer2.1μlaxiomstain2-a1.05μlaxiomstain2-b1.05μl轻轻翻转试管10次以混合，避光置于冰上。3.按照以下体系配置稳定混合物(stabilizationmastermix)：成分1×axiomwater93.19μlaxiomstabilizediluent10.50μlaxiomstabilizesoln1.31μl最大速度旋涡混匀3s，置于冰上。4.按照以下体系配置连接混合物(ligationmastermix)：stage1成分1×axiomligatebuffer66.15μlaxiomligatesoln113.12μlaxiomligatesoln23.73μl最大速度旋涡混匀3s，置于冰上。5.将axiomligationenzyme从-20℃冰箱中取出，置于冷却块中冷却至20℃。而后按下列顺序准备连接混合物(ligationmastermix)：stage2成分1×ligationmastermixfromstage182.42μlaxiomprobemix110.5μlaxiomprobemix210.5μlaxiomligateenzyme1.58μl轻轻翻转试管10次以混合，避光置于冰上。6.将上述混合物分别加入对应的反应盘中：其中染料混合物1染料盘2个(每孔105μl)、染料混合物2染料盘1个(每孔105μl)、稳定混合物染料盘1个(每孔105μl)、连接混合物染料盘1个(每孔105μl)，避免产生气泡。7.将上述反应盘用对应盖子覆盖，而后直接载入genetitanmc仪器中。8.将扫描盘的顶盖移去，每孔中加入150μlaxiomholdbuffer，避免接触扫描盘底部。将盖子的切口角对准扫描盘的切口边缘，盖住扫描盘，而后放置于工作台顶部。四、数据分析与注释反应完成后会得到每块芯片板的原始荧光信号数据，利用软件(axiomanalysissuite)进行芯片板质控、单个样品质控、探针序列比对、样品比对和结果验证即可得到相应样品的位点信息的结果文件。分析原理如下，每块芯片板上含有96张芯片，每张芯片均固定好定制探针，这些探针能特异性的与含有某个位点的dna片段杂交。共有四种类型的双色报告探针，其一端分别携带碱基a、t、g、c，其中a/t探针另一端携带一种荧光基团(别藻青蛋白)，g/c探针另一端携带另一种颜色荧光基团(藻红蛋白)。杂交结束，再利用dna连接酶将报告探针与杂交序列进行连接反应，进而通过酶反应促使两种基团发出荧光信号，机器能捕捉并区分这些荧光信号并记录。结果文件包含每个样品得到的突变位点，这些位点需要进一步的注释分析，包括突变评级和医学解读，方可得到的明确的位点信息。临床医生会联合分析注释信息与样品患者的表型数据，最终判断是否符合g6pd缺乏症特征，从而给出最终诊断结果。五、其他说明制备过程中，一些操作行为如移液、试管、混匀器、定量等涉及到的耗材为本领域常用物品，常见操作手段、血液样本dna提取及质检步骤等均是本领域的公共知识，不再赘述。六、实验结果1.g6pd缺乏症现有酶学诊断方法容易受到标本采集、递送时间、检测方法等因素的影响，假阳性率约为6.5％；而基于pcr的检测方法过于依赖引物设计，且本身稳定性不是很好，检测位点一般只有十几个，且存在约3％的假阳性率；本发明单次检测具备高通量，结果更准确，假阳性率极低，操作简单等优点。2.本发明为了减少人工误差和提高通量，在设备采购与操作上尽量以自动化和多样品操作为主。主要包括自动化高通量基因芯片分析系统、芯片及自动解读软件，通过本套设备流程，可以实现每周(5个工作日)8块芯片板的通量，并能显著提高结果的可靠性。3.生产成型的芯片需要经过阳性样品的验证，对阳性样品信息，质控结果和结果准确性进行汇总分析：验证样品位点信息(转录本：nm_001042351.2)：部分样本dna片段化结果如图2所示，数据质控结果如图3所示。数据分析及解读结果：注：affected表示检测到突变，且有影响；carrier表示携带突变无明显影响。综上，本发明产品对25例阳性g6pd突变位点100％验证，所设计的探针既能检测半合子样本，也能检测出携带者样本，充分说明了本发明的通用性、有效性。sequencelisting<110>上海源庆生物科技有限公司<120>一种用于人葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的基因突变检测试剂盒<130>1<160>382<170>patentinversion3.3<210>1<211>72<212>dna<213>人工序列<400>1gtcagccactgtgaggcgggaacgggcatagcccactgatgaaggtgttttcgggcagaa60ggccatcccgga72<210>2<211>72<212>dna<213>人工序列<400>2gactggggtgcaccccctaccttctcatcacggacgttcatctgagttggtggaggcggg60cttctccatggc72<210>3<211>72<212>dna<213>人工序列<400>3gggggttcacccacttgtaggtgccctcatactggacaacccactctcttcatcagctcg60tctgcctccgtg72<210>4<211>72<212>dna<213>人工序列<400>4gggggttcacccacttgtaggtgccctcatactggacaacccactctcttcatcagctcg60tctgcctccgtg72<210>5<211>71<212>dna<213>人工序列<400>5ctctgctgggagcccggagctgcgttacccccttgaacccctcttcggggagtgaggatc60agagctgcatc71<210>6<211>72<212>dna<213>人工序列<400>6gcatctggctcccgcagaagacgtccaggatgaggcggctcataggcgtcagggagcttc60acgttctgtgag72<210>7<211>72<212>dna<213>人工序列<400>7tctgcaccatctccttgcccaggtagtggtcgatgcgggtagatctggtcctcacggaac60agggaggagatg72<210>8<211>72<212>dna<213>人工序列<400>8tctgcaccatctccttgcccaggtagtggtcgatgctggtagatctggtcctcacggaac60agggaggagatg72<210>9<211>72<212>dna<213>人工序列<400>9gcgaccctcagtgccaaagggctccttgaaggtgaaggataacgcaggcgatgttgtccc60ggttccagatgg72<210>10<211>72<212>dna<213>人工序列<400>10gcgaccctcagtgccaaagggctccttgaaggtgaaggataacgcaggcgatgttgtccc60ggttccagatgg72<210>11<211>72<212>dna<213>人工序列<400>11gccctggaaaagctcttcccgcaggatcccgcacaacctgggtccggctcagggccacct60gctctgccatga72<210>12<211>72<212>dna<213>人工序列<400>12cactgtgaggcgggaacgggcatagcccacgatgaatggtgttttcgggcagaaggccat60cccggaacagcc72<210>13<211>72<212>dna<213>人工序列<400>13gctggtaggaggctgcatcatcgtactggccagccatcataggagttgcgggcaaagaag60tcctccagcttg72<210>14<211>72<212>dna<213>人工序列<400>14gtatgcaggggccggcagctgggcctcacctgcgcatcgaagtgcatctggctcccgcag60aagacgtccagg72<210>15<211>72<212>dna<213>人工序列<400>15gtatgcaggggccggcagctgggcctcacctgcgcatcgaagtgcatctggctcccgcag60aagacgtccagg72<210>16<211>72<212>dna<213>人工序列<400>16gatactcaccgatgcacccatgatgatgaatatgtcgtgtatccgactgatggaaggcat60cgccctggaaaa72<210>17<211>72<212>dna<213>人工序列<400>17gatactcaccgatgcacccatgatgatgaatatgtcgtgtatccgactgatggaaggcat60cgccctggaaaa72<210>18<211>72<212>dna<213>人工序列<400>18cggcaagccttacatctggctcatgcaggactcgtcgaatgttcttggtgacggcctcgt60agacggtcgggg72<210>19<211>72<212>dna<213>人工序列<400>19cggcaagccttacatctggctcatgcaggactcgtcgaatgttcttggtgacggcctcgt60agacggtcgggg72<210>20<211>72<212>dna<213>人工序列<400>20ttgggctgcacgcggatcaccagctcgttgcgcttcgcactgctggtggaagatgtcgcc60ggccacatcatg72<210>21<211>72<212>dna<213>人工序列<400>21ttgggctgcacgcggatcaccagctcgttgcgcttcgcactgctggtggaagatgtcgcc60ggccacatcatg72<210>22<211>72<212>dna<213>人工序列<400>22gtgttttcgggcagaaggccatcccggaacagccacgctgagggcagggcacagctgtaa60ccagtgcgggca72<210>23<211>72<212>dna<213>人工序列<400>23tcctcggggttgaagaacatgcccggcttcttggtctatcatcttggtgtacacggcctc60gttgggctgcac72<210>24<211>72<212>dna<213>人工序列<400>24cccgcacacctgggtccggctcagggccacctgctcttgccatgacgctgtctggtggaa60gaaaggctcgtt72<210>25<211>72<212>dna<213>人工序列<400>25cactctcttcatcagctcgtctgcctccgtggggccttcggctggagagtgacgggtgga60ggagaggcatga72<210>26<211>72<212>dna<213>人工序列<400>26cactctcttcatcagctcgtctgcctccgtggggccttcggctggagagtgacgggtgga60ggagaggcatga72<210>27<211>72<212>dna<213>人工序列<400>27ccttgcgctcgttcagggccttgccgcagcgcaggagtgaagggcacccctacgtggcgg60aaagggcagcct72<210>28<211>72<212>dna<213>人工序列<400>28ccttgcgctcgttcagggccttgccgcagcgcaggagtgaagggcacccctacgtggcgg60aaagggcagcct72<210>29<211>72<212>dna<213>人工序列<400>29tcaccagctcgttgcgcttgcactgctggtggaagagtgtcgccggccacatcatggaac60tgcagcctcacc72<210>30<211>72<212>dna<213>人工序列<400>30tcaccagctcgttgcgcttgcactgctggtggaagagtgtcgccggccacatcatggaac60tgcagcctcacc72<210>31<211>72<212>dna<213>人工序列<400>31agattggggcctgggagatactcaccgatgcacccagtgatgatgaatatgtgtgtatcc60gactgatggaag72<210>32<211>72<212>dna<213>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