一株溶磷、促生、适应性强的玉米根际促生菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及一株溶磷、促生、适应性强的玉米根际促生菌及其应用。
背景技术：
：全国土壤普查表明，我国土壤中约95％的磷都以难溶性无机态和有机态存在，难以被植物吸收利用。磷(p)是作物生长发育所必需的三大营养元素之一，对植物的生长起重要作用。随着集约化农业的发展，磷肥不断大量施入，一定程度上提高了粮食产量，但同时也严重破坏了环境，过量施用磷肥造成磷矿资源的浪费，还导致土壤磷素积累，引发水体富营养化等一系列严重的环境问题。因此，利用溶磷微生物促进土壤中难溶磷的转化进而提高植物对磷的利用效率，减少磷肥的使用，对植物生长和生态保护都具有非常重要的意义。随着微生物肥料行业的发展，越来越多的研究表明微生物在提高磷肥利用率方面具有广泛的潜力。农业生产中把能够将土壤难溶磷酸盐和有机磷转化为植物可利用有效磷的微生物类群，统称为溶磷菌。它们能够依靠自身的代谢产物或与其他生物协同使土壤中易于被植物吸收利用的磷含量提高，从而增加作物吸磷量，提高作物产量，并减少磷肥的施用量。此外，有些高效溶磷菌还具有合成iaa的能力，而iaa作为调节植物生长的信号物质，是在植物体内普遍存在的生长素物质。能够分泌iaa的植物根际促生菌可直接促进植物根系生长发育，进而高效的吸收植物所需营养。大部分溶磷菌株会受到土壤环境和生物多样性的影响，对于环境的变化十分敏感，导致其对作物促生效果差异较大。因此，应针对特定土壤环境和作物筛选生态适应性较强的促生菌。玉米作为我国第一大粮食作物，同时东北地区又地处玉米黄金生产带，是全国玉米主产区之一。但是东北地区播种期地温低，从而抑制了土壤磷的迁移和活化，导致玉米生长初期对磷的利用效率较低。因此针对我国东北地区土壤及环境特点选育能够促进土壤难溶磷转化及玉米生长的多功能溶磷菌极其重要。技术实现要素：本发明的目的是提供一株溶磷、促生、适应性强的玉米根际促生菌及其应用。第一方面，本发明要求保护一株溶磷、促生、适应性强的玉米根际促生菌。本发明要求保护的菌株为肠杆菌(enterobactersp.)mgpr2，该菌株已于2019年07月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmccno.18240。本发明所述肠杆菌(enterobactersp.)mgpr2经血琼脂平板培养法检测，溶血活性为阴性，表明对人畜无害。本发明所述肠杆菌(enterobactersp.)mgpr2经鉴定具有多种功能特征，主要包括：(1)溶磷：具有溶无机磷能力，可溶性指数为2.08；具有溶有机磷能力，可溶性指数为2.23。(2)产iaa：iaa合成量为46.71μg/ml。(3)抗逆性：可耐盐7％；耐酸ph5；耐碱ph10；耐干旱(30％peg，重度干旱)。(4)耐药性：可耐受农业应用中普遍使用的除草剂乙草胺(4500ppm)、杀虫剂吡虫啉(88ppm)和杀菌剂嘧菌酯(312.5ppm)的最大使用剂量。(5)促进植物生长：增加植物株高、地上生物量(地上干重)、地下生物量(根干重)、叶面积指数、百粒重(百粒干重)、穗粒数、产量。第二方面，本发明要求保护肠杆菌(enterobactersp.)或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂的新用途。本发明要求保护肠杆菌(enterobactersp.)或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在如下a1)-a7)中任一种中的应用：a1)促进植物生长；a2)制备促进植物生长的产品；a3)溶磷；a4)制备溶磷的产品；a5)产iaa；a6)制备产iaa的产品；a7)作为植物根际促生菌。第三方面，本发明要求保护一种产品。本发明要求保护的产品的活性成分为肠杆菌(enterobactersp.)或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂；所述产品的用途为如下中的全部或部分：b1)促进植物生长；b2)溶磷；b3)产iaa。以上任一所述应用或产品中，所述产品可为微生物肥料。第四方面，本发明要求保护一种促进植物生长的方法。本发明要求保护的促进植物生长的方法包括用上述肠杆菌(enterobactersp.)或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂处理植物的步骤。所述处理植物的方法具体可为拌种。以上任一所述应用或产品或方法中，所述溶磷包括溶无机磷和溶有机磷。以上任一所述应用或产品或方法中，所述促进植物生长体现为如下中的全部或部分：c1)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的株高增加；c2)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的地上生物量(地上干重)和/或地下生物量(根重)增加；c3)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的叶面积指数增加；c4)促进所述植物的百粒重增加；c5)促进所述植物的穗粒数增加；c6)促进所述植物的产量增加。进一步的，所述促进植物生长可为在缺磷土壤中促进植物生长。更进一步的，所述缺磷土壤具体为我国东北地区(如吉林省，具体如吉林省四平市梨树县三棵树村)的土壤。在本发明的一个具体实施例中，所述缺磷土壤为不施用磷肥的土壤(正常施用氮肥和钾肥)。以上任一所述应用或产品或方法中，所述不同发育时期为如下中的任一种：苗期(出苗后25天)、拔节期(出苗后50天)、吐丝期(出苗后75天)、收获期(出苗后150天)。以上任一所述应用或产品或方法中，所述菌悬液或所述培养液或所述发酵产物或所述菌剂中除了含有作为活性成分的所述肠杆菌(enterobactersp.)外，还含有辅料。所述辅料可根据需要选择。在本发明的一个实施例中，所述菌剂具体为液体菌剂，是通过采用添加有终浓度为0.1mg/ml的色氨酸的lb液体培养基培养所述肠杆菌(enterobactersp.)获得的；所述培养条件具体为：37℃，180r/min培养24-48小时；所述肠杆菌(enterobactersp.)在所述液体菌剂中的浓度具体为1×1010-1×1011cfu/ml。所述肠杆菌(enterobactersp.)在所述液体菌剂中的浓度具体可为1×1010-11cfu/ml。以上任一所述应用或产品或方法中，所述植物可为粮食作物。进一步的，所述粮食作物可为玉米。更进一步的，所述玉米品种可为郑单958。以上任一所述应用或产品或方法中，所述肠杆菌(enterobactersp.)具体为肠杆菌(enterobactersp.)mgpr2cgmccno.18240。以上任一所述产品或方法在增加植物株高和/或增加植物地上生物量和/或增加植物地下生物量和/或增加植物叶面积指数和/或增加植物百粒重和/或增加植物穗粒数和/或增加植物产量中的应用也属于本发明的保护范围。本发明菌株肠杆菌(enterobactersp.)mgpr2分离自玉米根际土壤，该菌株具有多种促生功能如溶无机磷、溶有机磷和高产iaa等，并具有很强的适应性如耐干旱、耐受农药和耐酸碱等，同时是生物安全菌株。此外该菌株代谢能力旺盛，能利用大部分碳源，如麦芽糖、d-海藻糖、d-纤维二糖等46种碳源，且对林可霉素、二甲胺四环素等17种化学试剂有一定敏感性。在完全不施用磷肥的情况下，田间施用该菌剂比未施用阴性对照可显著增加不同发育时期的玉米株高、地上及地下生物量、叶面积指数，玉米产量提高了14％，且产量水平与全量施磷肥的水平无显著差异。本发明为我国玉米主要种植区—东北地区提供了高效溶磷、促生的微生物种质资源，有利于促进我国农业绿色健康可持续发展。利用此菌，可减少磷肥的投入和减轻过量施用磷肥对环境造成的污染，符合我国可持续绿色农业发展的需要和生态农业的要求。不仅扩大了我国粮食作物促生菌种质资源，也为研发高效稳定的微生物肥料以及应用技术提供了基础。保藏说明菌种名称：肠杆菌拉丁名：enterobactersp.菌株编号：mgpr2保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：cgmcc地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2019年07月17日保藏中心登记入册编号：cgmccno.18240附图说明图1为肠杆菌(enterobactersp.)mgpr2在pko培养基上培养3天无机磷溶解圈图示。图2为肠杆菌(enterobactersp.)mgpr2在蒙金娜培养基上培养3天有机磷溶解圈图示。图3为肠杆菌(enterobactersp.)mgpr2产iaa定性分析图。图4为肠杆菌(enterobactersp.)mgpr2在血琼脂培养基上培养3天无溶血圈图示。图5为肠杆菌(enterobactersp.)mgpr2在lb固体培养基上的菌落形态。图6为肠杆菌(enterobactersp.)mgpr2在geniii鉴定板上的反应。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1、溶磷、促生菌株的筛选及其它功能的鉴定东北是我国玉米主要种植区之一，且东北黑土地也急需采取有效保护措施以遏制黑土退化。本发明针对东北地区玉米生产及土壤现状，通过从玉米根际土壤中分离溶磷菌并测定菌株的产iaa、生态适应性等功能，筛选出多功能玉米根际促生溶磷菌。一、材料和方法1、实验材料(1)土壤样品的采集2017年9月15日于吉林省四平市梨树县三棵树村，采用5点采样法取玉米根际土壤，将样品混匀，放入无菌的自封袋里，于4℃冰箱保存并尽快分离。(2)培养基及试剂的配制①lb(luria-bertaniagar)培养基胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，nacl10g，琼脂15-20g(固体培养基加)，去离子水1000ml，ph6.8-7.2，121℃灭菌20min。②pko(pikovskaya'smedium)无机磷培养基葡萄糖10g，ca3(po4)25g，(nh4)2so40.5g，nacl0.2g，kcl0.2g，mgso4·7h2o0.03g，mnso40.03g，feso40.003g，酵母膏0.5g，琼脂18g(固体培养基加)，去离子水1000ml，ph6.8-7.0，121℃灭菌20min。③蒙金娜有机磷培养基葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，nacl0.3g，kcl0.3g，mgso4·7h2o0.03g，mnso40.03g，卵磷脂0.2g，caco35g，酵母膏0.4g，琼脂18g(固体培养基加)，去离子水1000ml，ph6.8-7.2，121℃灭菌20min。④改良yma培养基(基础培养基)甘露醇10.0g，k2hpo40.5g，kh2po40.5g，mgso40.2g，nacl0.1g，酵母粉1.0g，色氨酸10mg，琼脂18g(固体培养基加)，去离子水1000ml，ph6.8-7.2，121℃灭菌20min。⑤血琼脂培养基蛋白胨18g，酵母粉1g，nacl5g，琼脂15-20g，去离子水1000ml，ph6.8-7.2。121℃灭菌20min后，待培养基冷却至50℃添加5％(5ml/100ml)脱纤维羊血，混匀后倒平板。⑥耐盐培养基配制lb培养基，其中nacl按1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％nacl(g/100ml)盐浓度分别称取加入，121℃灭菌20min。⑦耐酸碱培养基配制lb培养基7瓶，灭菌后在超静工作台中，用无菌稀盐酸和氢氧化钠溶液调整培养基的ph值分别至4、5、6、7、8、9、10，冷却至50℃左右倒平板。⑧耐农药培养基选取东北地区玉米常用除草剂、杀菌剂、杀虫剂各一种，按照说明书的最高和最低使用浓度之间递减设4个浓度梯度，并计算出四个梯度的用量/100ml(表1)。灭菌后的lb培养基冷却至50℃左右，分别快速加入4个浓度梯度的农药量，迅速摇匀后倒平板。表1实验所用农药梯度设置及相应农药含量⑨耐干旱培养基耐干旱培养基采用聚乙二醇(peg6000)调节水势人工模拟干旱条件进行耐干旱菌株鉴定。共设置4个处理，peg6000含量分别为：0(ck)、10％(轻度干旱)、20％(中度干旱)和30％(重度干旱)。其对应的水势分别为：0mpa，-0.185mpa，-0.559mpa和-1.122mpa，121℃灭菌20min。⑩试剂salkowski比色液：用1ml浓度为0.5mmol/l的fecl3溶液与50ml质量分数为35％的高氯酸溶液(用70％(质量分数)的商业高氯酸制剂与水1：1混合配制而成)混合配制而成，显色液需现配现用，不能长时间保存。无菌生理盐水：0.8gnacl溶于100ml去离子水中，121℃灭菌20min。2、实验方法(1)溶磷(溶无机磷和有机磷)菌株初筛将0.5g土壤样品溶于50ml质量分数为0.8％的无菌生理盐水中，37℃，180rpm温和摇动1h(三个样品重复)形成土壤浑浊液原液；从原液中取1ml梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，5个稀释梯度，充分摇匀获得梯度稀释液。吸取100μl上清液涂布于pko无机磷培养基上，于37℃培养3天，将能产生透明溶磷圈的菌株转接到蒙金娜有机磷培养基上，于37℃培养3天，将仍能产生透明溶磷圈的菌株转接到lb固体培养基上保存备用。(2)溶磷(溶无机磷和有机磷)能力测定将上述产生溶磷圈的菌株纯化后分别重新接种于pko无机磷培养基和蒙金娜有机磷培养基，各菌株设3个重复。于37℃培养3天，用直尺对菌体直径以及溶解圈(包括菌体)直径进行测量，按以下公式计算可溶性指数：p＝d/d(d为溶解圈直径，d为菌落直径。试验结果表明编号为mgpr2(即cgmccno.18240)的菌株在pko无机磷及蒙金娜有机磷培养基上可溶性指数均较大。菌株mgpr2形成的无机磷溶解圈如图1所示，有机磷溶解圈如图2所示。(3)mgpr2产iaa能力测定产iaa菌株定性测定：将纯化后的菌株mgpr2接种于改良yma液体培养基，摇床培养(37℃，180r/min)1天后，取500μl菌悬液于1.5ml离心管中，同时加入等体积的salkowski比色液，并以加入500μl未接菌的yma液体培养基与等体积比色液的混合溶液作为对照。将白色陶瓷板于室温避光放置10min后观察，颜色变粉红者为阳性，表示能够分泌iaa，不变色为阴性，表示不能分泌iaa。结果如图3所示。结果表明：mgpr2菌悬液与显色液反应变红，而对照不变色，说明菌株mgpr2能产生iaa。产iaa菌株定量测定：对菌株mgpr2进行定量测定，培养条件同上。首先用分光光度法测定菌悬液的od600值，然后将菌悬液在10000r/min条件下离心10min后取上清液加入等体积salkowski比色液，避光静置20min，测定其od530值。对照标准曲线计算单位体积上清液中iaa的含量。(4)安全性检测将菌株mgpr2接种于血琼脂培养基中，37℃培养3天，观察有无溶血圈。有溶血圈出现代表菌株有溶血活性，对人畜有潜在威胁，则菌株应禁止应用于微生物肥料；若无溶血圈出现代表菌株无溶血活性，为安全菌种，可作为微生物肥料应用菌种。(5)抗逆性检测将菌株mgpr2分别接种于耐盐、耐酸碱能力的检测培养基中，37℃培养3天，观察细菌生长情况。(6)耐旱性检测将菌株mgpr2接种于耐干旱能力的检测培养基中，37℃培养3天，观察细菌生长情况。(7)耐药性检测将菌株mgpr2接种于耐农药能力的检测培养基中，37℃培养3天，观察细菌生长情况。二、结果分析1、功能特征鉴定结果功能特征鉴定结果如表2所示。表2菌株mgpr2的功能特征鉴定结果功能特征定性分析可溶性指数(d/d)定量分析溶无机磷能力+2.08—溶有机磷能力+2.23—产iaa能力++—46.71μg/ml注：+号表示阳性；-号表示阴性；+号越多代表能力越强；—表示未测。2、安全性检测结果菌株mgpr2在血琼脂平板上培养3天，结果如图4所示。结果表明：未出现溶血圈，溶血活性为阴性。3、抗逆性检测结果抗逆性检测结果如表3所示。结果表明：菌株mgpr2具有良好的抗逆性，耐盐7％、耐酸ph5、耐碱ph10、耐干旱30％peg。表3菌株mgpr2的抗逆性检测结果抗逆性菌株生长情况耐盐7％+耐酸ph4-耐酸ph5++耐碱ph10+++耐干旱30％peg++注：+表示菌株生长；-表示菌株未生长；+号越多代表菌株生长情况越好。4、耐药性检测结果耐药性检测结果如表4所示。结果表明：菌株mgpr2对常用的除草剂(如乙草胺)、杀菌剂(吡虫啉)和杀虫剂(嘧菌酯)均有良好的耐药性。表4菌株mgpr2的耐药性检测结果注：+表示菌株生长；+号越多代表菌株生长情况越好。实施例2、菌株mgpr2的鉴定与保藏一、菌株mgpr2的鉴定方法1、形态特征鉴定将实施例1中筛选获得的菌株mgpr2接种于lb固体培养基，37℃培养3天，观察菌落形态。2、生理生化特征鉴定对实施例1中筛选获得的菌株mgpr2进行革兰氏染色，并利用biolog技术对该菌株进行94种表型测试，采用的geniii微孔板包括：71种碳源利用测试(表5，1-9列)以及23种化学敏感性测试(表5，10-12列)。所有必要的营养物质以及生化试剂都被预先填充、干化在96个孔中。孔中的四唑类氧化还原染料通过色度的变化来指示微生物对碳源的利用程度以及对化学物质的敏感程度。孵育一段时间后细菌在能利用的碳源孔中呼吸作用增强，使四唑氧化还原染料被还原，变成紫色，而阴性孔保持无色，蓝色孔代表“边界值”。表5geniii微孔板布局3、16srdna序列测序鉴定利用trelieftmplantgenomicdnakit(tsingke)试剂盒提取实施例1中筛选获得的菌株mgpr2的dna，并对16srdna序列进行pcr扩增，所用正向引物为16srdnap1：agagtttgatcctggctcagaacgaacgct，反向引物为16srdnap6：tacggctaccttgttacgacttcacccc。扩增反应条件为：95℃5min；94℃1min，60℃30s，72℃90s，进行30个循环；最后72℃终延伸10min。pcr扩增产物检测合格后送至北京美吉桑格生物医药科技有限公司进行测序。二、菌株mgpr2的鉴定结果1、形态特征鉴定结果菌株mgpr2在lb固体培养基上的形态如图5所示，粘液状菌落，无荚膜，边缘整齐。2、生理生化特征鉴定结果菌株mgpr2革兰氏染色呈阴性。使用microstation软件读取菌株mgpr2培养7天后对各微孔利用情况，结果如图6所示。结果表明：菌株mgpr2能利用大部分碳源，如麦芽糖、d-海藻糖、d-纤维二糖等46种碳源，且对林可霉素、二甲胺四环素等17种化学试剂有一定敏感性。3、16srdna序列测序结果双端测序序列用dnaman软件进行拼接，共1430bp，核苷酸序列如seqidno.1所示。将得到的菌株mgpr2的16srdna序列(seqidno.1)在ncbi网站进行blast比对，结果显示该菌株与enterobactersp.straincspt19相似性最高，同源性为99.72％。三、菌株mgpr2的保藏鉴于以上对菌株mgpr2的鉴定结果，确定菌株mgpr2属于肠杆菌(enterobactersp.)。肠杆菌(enterobactersp.)mgpr2菌株已于2019年07月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmccno.18240。实施例3、mgpr2菌剂的制备及其应用一、mgpr2菌剂的制备将肠杆菌(enterobactersp.)mgpr2菌株接种至添加有终浓度为0.1mg/ml的色氨酸的lb液体培养基中摇床震荡培养(37℃，180r/min)24-48小时，得到mgpr2液体菌剂。所述肠杆菌(enterobactersp.)mgpr2在所述液体菌剂中的浓度为1×1010-1×1011cfu/ml。二、mgpr2菌剂的田间应用1、实验材料与方法实验材料：玉米品种郑单958。实验地点：吉林省四平市梨树县三棵树村。实验方法：于2018年4月30日在试验田按常规方法进行播种。实验田分为两部分，缺磷区和正常施肥区。缺磷区：不施磷肥，氮肥和钾肥均按常规施肥量施肥。氮肥为尿素，施用量为240kg/ha；钾肥为氯化钾(k2o)，施用量为67.5kg/ha。正常施肥区：氮肥、磷肥和钾肥均按照常规施肥量施肥。磷肥为过磷酸钙(p2o5)，施用量为85kg/ha；氮肥为尿素，施用量为240kg/ha；钾肥为氯化钾(k2o)，施用量为67.5kg/ha。所有肥料全部作为基肥混匀后一次性施入土壤。实验方法分为三组，每组处理三个重复，每组处理方法具体如下：ck-：在缺磷区进行播种，不进行任何菌剂处理；mgpr2(接种菌剂处理)：在缺磷区进行播种，进行mgpr2菌剂处理；ck+：在正常施肥区进行播种，不进行任何菌剂处理。mgpr2菌剂处理的方法如下：将待播种的种子在播种前用步骤一中制备的mgpr2液体菌剂直接拌种，阴干后进行播种。播种和农事管理等方法按照常规方法进行，且与其他两个处理组相同，如果天气干旱，在播种后进行浇水，以保证菌剂存活环境。于苗期(出苗后25天)统计各组玉米的株高、地上干重和根干重，于拔节期(出苗后50天)统计各组玉米的株高、地上干重和叶面积指数，于吐丝期(出苗后75天)统计各组玉米的株高、地上干重和叶面积指数，于收获期(出苗后150天)统计各组玉米的百粒干重、穗粒数和产量。叶面积指数计算方法如下：分别测量每株玉米的每片绿叶的长和宽，其中长为叶基至叶尖的长度，宽为叶片的最宽处的宽度，按照如下公式计算每片绿叶的叶面积：叶面积＝长x宽x0.75，然后按照如下公式计算叶面积指数：叶面积指数＝单株叶片总面积/单株占地面积。2、实验结果田间实验结果如表6和表7所示。结果表明：与ck-组相比，在苗期，接种mgpr2菌剂的mgpr2组玉米的株高、地上干重和根干重均显著提高；在拔节期和吐丝期，接种mgpr2菌剂的mgpr2组玉米的株高、地上干重和叶面积指数均显著提高；在收获期，接种mgpr2菌剂的mgpr2组玉米的百粒干重、穗粒数和产量也显著提高且与ck+组无显著差异，其中，产量比ck-组提高14％。以上田间实验结果说明：肠杆菌(enterobactersp.)mgpr2菌株(cgmccno.18240)具有促进土壤磷营养的转化及玉米对磷养分的高效利用的功能，可作为开发稳定高效的微生物肥料菌种资源。表6应用mgpr2菌剂玉米苗期、拔节期植株性状一览表注：数据为平均数±标准误差，同列不同小写字母表示处理间差异显著(p<0.05)，下同。表7应用mgpr2菌剂玉米吐丝期植株性状及收获期产量一览表以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>中国农业大学<120>一株溶磷、促生、适应性强的玉米根际促生菌及其应用<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1430<212>dna<213>enterobactersp.<400>1aggcctacacatgcagtcgaacggtaacaggaagcagcttgctgcttcgctgacgagtgg60cggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacgg120tagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatc180ggatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatcc240ctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctac300gggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgt360gtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaaggcgatgaggtta420ataacctcgtcaattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagc480cgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcagg540cggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactg600gcaggctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagag660atctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcg720aaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcga780cttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctg840gggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtgg900agcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaa960cttagcagagatgctttggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgt1020cagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgt1080tgccagcggttaggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtgg1140ggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcgc1200atacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccgg1260attggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatg1320ccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggtt1380gcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccacttgtga1430当前第1页12