单核、二核及成熟玉米花粉分离方法及花粉发育阶段判定模型的构建与应用与流程

本发明涉及植物生物化学技术领域，具体涉及一种单核、二核及成熟玉米花粉分离方法及花粉发育阶段判定模型的构建与应用。

背景技术：

玉米花粉发育过程可以分为两个阶段：小孢子发生和雄配子体发生，小孢子发生始于雄蕊原基细胞的有丝分裂，终止于小孢子母细胞减数分裂产生小孢子。初生造孢细胞经过有丝分裂生成花粉母细胞，花粉母细胞启动减数分裂，产生四个单倍体小孢子，随着胼胝质壁解体，小孢子（单核花粉）被释放出来。雄配子发生始于释放的小孢子，终止于精细胞的形成；极化后的小孢子经过一次特殊的不对称有丝分裂，产生一个大的营养细胞和一个小的生殖细胞（二核花粉）。生殖细胞则进入第二次有丝分裂，产生两个精细胞，完成雄配子体发生，此时是三核花粉。

花粉是植物有性生殖的重要参与者，一旦花粉发育异常，会严重影响禾谷类作物产量，危害国家粮食安全。而分离得到不同发育时期花粉是研究花粉发育机制及风险预警的基础；但目前分离不同发育时期玉米花粉的方法尚无文献报道。

在实际应用中，玉米散粉期的成熟花粉可以通过抖落花粉进行分离和收集；单核花粉主要是通过体外培养和繁琐操作才可以分离少量单核花粉，而二核花粉的分离更是报道有限，更重要的是难于准确的判断出玉米花粉何时发育到二核时期，同时由于雄穗上、中、下部位的小花发育进度不一致，进一步增加了二核花粉的分离难度。

当前仅是通过玉米株高、叶片数对花粉发育时期进行粗略判断，虽然方法简单，但准确度差。而现有判断玉米花粉发育时期较准确的方法是从叶片包裹的雄穗中取出花粉进行dapi染色镜检；但是此方法繁琐不利于实际研究应用，且花粉分离提纯难度大，必须以破坏植株雄穗为前提。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种不同发育阶段（单核、二核及成熟）玉米花粉纯化分离方法，以及解决无法分离纯化出各阶段具有生物活性的花粉细胞（如单核、双核、成熟）的技术难题。

另一方面，本发明还提供了构建玉米花粉发育阶段判定模型的方法，并应用于玉米花粉发育时期的快速确定，实现精准的数值化定量判断，以解决现有技术中花粉细胞时期判断准确度差的技术问题。

再一方面，本发明还探索建立了一种简便、直观的玉米花粉发育阶段快速判断方法，无需破坏性取样检测，以解决现有方法中操作复杂且必须破坏雄穗的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

设计一种玉米花粉的分离纯化方法，包括如下步骤：

（1）在对应的玉米花粉发育时期取雄穗中部的小穗，加入研磨缓冲液，在0～4℃下研磨得研磨液；

（2）以150～300目筛网过滤步骤（1）所得研磨液，收集滤液，再进行离心分离，弃上清液得富集沉淀物；

（3）以研磨缓冲液重悬步骤（2）所得富集沉淀物，再以percoll密度梯度分离液对其进行离心，得沉淀物；

（4）向步骤（3）所得沉淀物加入纯化缓冲液洗涤后，离心分离得花粉细胞。

优选的，在所述步骤（1）中，以每100ml计，所述研磨缓冲液的原料组成如下：含8～12ml甘露醇、7.0～8.0mgkcl、5.4～5.8mgcacl2、余量为水。

优选的，在所述步骤（4）中，以每100ml计，纯化缓冲液由以下成分组成：0.210～0.215gmes、5.80～5.90mgnacl、7.0～8.0g蔗糖，以koh调ph值至6.0，余量为水。

优选的，在所述步骤（3）中，所述percoll密度梯度分离液由percoll、研磨缓冲液按3:15～18的体积比组成。

优选的，在所述步骤（2）中，离心条件为：0～4℃，转速2500～3500转/分，离心3～5分钟；在所述步骤（3）中，离心条件为：0～4℃，转速6000～7000转/分，离心5～10分钟；在所述步骤（4）中，离心条件为：0～4℃条件，转速3000～4000转/分，离心2～4分钟。

优选的，在所述步骤（1）中，研磨破碎采用榨汁机，每研磨破碎3～5s后停顿5～10s，重复3～5次。

优选的，在所述步骤（2）中，对于处于单核花粉时期，采用300目筛网过滤，处于二核花粉时期采用230目筛网过滤，处于成熟花粉时期则采用150目筛网过滤，以提高分离纯度。

基于长期的观察研究，拟合构建一种玉米花粉发育阶段判定模型的方法，包括如下步骤：

(1)取处于不同花粉发育时期的玉米雄穗中部的小穗，采用权利要求1所述的纯化分离方法，分离富集对应发育时期的花粉细胞，进行dapi染色后确定花粉发育阶段及花粉直径；

(2)同时分别考察或测量玉米单核花粉期、二核花粉期、成熟花粉期所对应的玉米植株的叶环数、雄穗上小穗长度；

(3)将玉米植株叶环数、雄穗上小穗长度、花粉直径与对应的花粉时期进行逻辑回归，建立如下预测模型：

其中，y为叶环数，s为小穗长度，mm；h为花粉直径，μm；，y1为单核花粉变量系数，y2为二核花粉变量系数，y3为成熟花粉变量系数；z1为单核花粉变量修正系数，z2为二核花粉变量修正系数，z3为成熟花粉变量修正系数；p1为归属单核花粉概率，p2为归属二核花粉概率，p3为归属成熟花粉概率；

（4）比较p1、p2、p3，其中数值最大者则为相应时期的花粉细胞。

利用上述预测模型准确判断玉米花粉发育时期的方法，包括如下步骤：

（1）考察或测量待预测玉米植株的叶环数、雄穗上小穗长度；检测对应时期的花粉直径；

（2）将以上数据代入上述的预测模型，计算出归属单核花粉、二核花粉、成熟花粉时期的概率，完成玉米花粉发育时期快速确定。

一种玉米花粉发育时期快速判断方法，包括如下步骤：

（1）考察或测量待预测玉米植株的叶环数、雄穗上小穗长度；检测对应时期的花粉直径；

（2）若叶环数为14～15，小穗长度8～8.6mm，此玉米花粉属于单核花粉；

若叶环数为16～17，小穗长度8.5～9.5mm，此玉米花粉属于二核花粉；

若叶环数为18～20，小穗长度9.7～11mm，此玉米花粉属于成熟花粉。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果包括：

1.本发明中的花粉分离纯化方法可用以分离纯化大量不同发育时期的高纯度玉米花粉，其纯度可以达到80%以上。

2.本发明花粉分离纯化方法中通过合理设置匹配兼容的研磨缓冲液、分离缓冲液及纯化缓冲液，不但能有效的保持花粉细胞的活性（例如，percoll密度梯度分离液具有渗透性低、不穿透细胞、粘度低、密度高和无毒害的优点，有利于维持花粉细胞之活性），而且有利于后续步骤实施（比如，纯化缓冲液可以克服因研磨缓冲液中甘露醇影响dapi染色的问题）。

4.本发明在长期的大量观察研究的基础上，发现了玉米植株叶环数、雄穗中部小穗长度、花粉直径与花粉发育阶段之间存在关联性，并据此分别建立了玉米花粉发育阶段定量数值化的判定模型和简便快捷的直观判断法，其中，利用定量数值化的判定模型能准确判断玉米花粉所处发育时期，定量、精准、可靠，而简便快捷的直观判断法则不破坏玉米雄穗、损伤包叶（叶环数、小穗长度等指标易于考察获取），操作简单、直观，解决了传统的判定方法必须破坏玉米雄穗（如要取出由叶片包裹的雄穗还必须破坏叶片）。

附图说明

图1为本发明的分离方法的流程示意图。

图2为本发明分离所得花粉细胞的dapi染色镜检照片，其中，a为单核玉米花粉镜检照片，b为二核玉米花粉镜检照片，c为三核玉米花粉镜检照片，比例尺=10um。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的原料和试剂，如无特别说明，均为市售常规原料和试剂；所涉及的检测、测试、制备方法等视情况而选择，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一

玉米单核、二核及成熟花粉的分离纯化方法，参见图1，包括如下步骤：

（1）可根据叶环数及小穗长度大致判断一下花粉所处的发育阶段，取玉米雄穗（对于早期雄穗尚包裹与顶叶内的，可通过解剖小心取出叶片包裹的玉米雄穗），放入自封袋中冰上保存，进一步根据雄穗上的小穗的长度，取雄穗中部附近的小穗，放入榨汁机中，加入4℃预冷的研磨缓冲液，研磨12～15s（轻轻上下震荡研磨，3s停顿一次，磨4次）；

（2）用不同目数筛网（如果要分离纯化单核花粉时期选300目筛网，分离二核花粉时期用230目筛网，分离成熟花粉时期用150目筛网）过滤步骤（1）研磨破碎后的花粉，收集滤液装入50ml离心管中，在4℃下以3500转/分，离心5分钟，弃上清得富集沉淀物；筛网可以用分子筛替代；

（3）用少量研磨缓冲液重悬上步所得富集沉淀物，再转移到含有15%percoll密度梯度分离液的离心管中，4℃，6000转，离心10分钟，弃上清，得沉淀物；

（4）用研磨缓冲液重悬步骤（3）所得沉淀物，再转移至1.5ml的离心管中加入纯化缓冲液进行洗涤，在4℃条件下，以3500转/分的转速离心5分钟，弃上清，得富集花粉（不同发育时期的花粉细胞镜检如图2所示）；

（5）上步所得富集花粉用75%的乙醇洗涤两次后用固定液（乙醇：乙酸=3:1）固定1h），再用dapi进行染色，镜检花粉发育时期。

上述研磨缓冲液配制（以每100ml计）：10ml甘露醇、7.5mgkcl、5.6mgcacl2，余量为水。

percoll密度梯度分离液是由0.6mlpercoll加入3.4ml研磨缓冲液制成。

上述纯化缓冲液配制（以每100ml计）：0.213gmes（吗啉乙磺酸）、5.85mgnacl、7.5g蔗糖，余量为水，以koh调ph值至6.0。

实施例二

玉米植株的叶环数、雄穗上小穗长度、花粉直径与花粉发育时期的关联性试验研究

试验设计：

2017年6月～2019年9月连续三年按季节在河南省农科院玻璃温室和中科院植物所玻璃温室进行栽培种植；品种选用郑单958玉米500粒，每1粒分别播种到含有等重土壤的加仑盆中，定期浇水，观察记录玉米植株的在各生育时期的叶环数，待玉米生长到13个叶环数时开始取材，每个叶环数的玉米取100株，14～17叶环数的玉米雄穗包裹在顶叶，需要剥除顶叶取出幼嫩的雄穗，用尺子测量并记录各花粉发育时期雄穗中部小穗的长度，随后将对应的中部小穗在体视显微镜镜下剥开，加入dapi染色液，在荧光显微镜下的明场测量花粉直径，再转换到dapi通道，观察花粉中细胞核数目、形态、结构，最终确定花粉的发育时期，记录汇总以上各时期数据。

（一）玉米花粉发育阶段数值判定模型的构建

将以上试验中所积累获取的玉米植株叶环数、雄穗上小穗长度、花粉直径与对应的花粉时期进行逻辑回归，构建出如下预测模型：

其中，y为叶环数，s为小穗长度，mm；h为花粉直径，μm；，y1为单核花粉变量系数，y2为二核花粉变量系数，y3为成熟花粉变量系数；z1为单核花粉变量修正系数，z2为二核花粉变量修正系数，z3为成熟花粉变量修正系数；p1为归属单核花粉概率，p2为归属二核花粉概率，p3为归属成熟花粉概率。

以玉米郑单958花粉发育期间，某时期测量记录得到的叶环数、雄穗上小穗长度、花粉直径的数据为例带入上述模型进行验证运算可得：

；

从以上计算结果可知，此时期花粉大概率的处于单核发育时期，而这也与花粉样品的实际镜检结果相一致。

该方法仅需要考察玉米植株叶环数（直观目测获得）、雄穗上小穗长度（直尺两次）、花粉直径（少量取样镜检即可，不需后续复杂染色的试验操作步骤）指标，操作较简单，取样量少，能够有效的避免或减少人为的主观判断误差，进而取得客观、精确的判断结果。

（二）玉米花粉发育时期快速直观判断方法的归纳：

发明人基于上述所积累的数据的分析研究，并结合长期以实践研究，发现对于郑单958，其花粉发育时期内的叶环数、雄穗上小穗长度花粉直径与其花粉实际的发育阶段存在如表1所示的关联，即，若考察测量玉米植株的叶环数为14～15，小穗长度8～8.6mm，此玉米花粉大概率的属于单核花粉；若叶环数为16～17，小穗长度8.5～9.5mm，此玉米花粉大概率的属于二核花粉；若叶环数为18～20，小穗长度9.7～11mm，此玉米花粉大概率的属于成熟花粉。

应用此方法对前期试验统计数据进行回溯研究发现，其判断结果大多数情况下与相对应的花粉阶段镜检判读结果基本相符。

该方法只需要考察玉米植株的叶环数（可直接观察计数）、小穗长度（直接测量，对早期包裹在顶叶内雄穗，可轻轻拨开顶部叶片，以尺量测），即可简便快捷的直观判断出其花粉所属的发育阶段，而不破坏玉米雄穗、损伤包叶，判断依据直观、操作简单。

表1叶环数、小穗、花粉发育时期间关联度

。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变换或者是方法步骤的等同替代，从形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。