I群4型禽腺病毒DN株、禽腺病毒灭活疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明涉及禽腺病毒分离株，尤其涉及i群4型禽腺病毒dn株以及由该分离病毒株制备的禽腺病毒灭活疫苗，属于禽腺病毒分离株及其应用领域。
背景技术：
：自2010年以来，i群禽腺病毒血清4型在中国鸡群中发病率较高，是心包积水肝炎综合征的主要病因，主要临床症状为心包积水—肝炎综合征(hjl)。鸡包涵体肝炎(ibh)是由ⅰ群禽腺病毒(fav-ⅰ)引起的一种急性传染病，病理组织学特征性变化表现为肝细胞脂肪变性，肝细胞内可见嗜酸性或嗜碱性包涵体。病理剖检变化：肝脏肿大，表面有不同程度的出血点或条索状出血斑，呈淡黄色；心包积液。其临床症状表现为个别鸡突然死亡，死亡鸡多体况良好，发病鸡表现为食欲不振，羽毛粗乱，嗜睡，严重贫血，鸡冠褪色，出现一过性水样便，一般在7日内死亡或康复。i群禽腺病毒分为12个血清型，现地主要流行血清4型和血清8型，该病发病率100％，死亡率可达60％以上。i群禽腺病毒可通过卵黄囊或绒毛尿囊膜途径进行鸡胚接种，用于病毒的增殖，但获得病毒含量不高，而且存在蛋源不稳定及生产成本高等问题。该病毒也可在鸡肝癌细胞中增殖且产生病变，文献报道分离的i群禽腺病毒血清4型毒株在鸡肝癌细胞中增殖培养病毒含量仅在107.0tcid50/0.1ml左右，均存在病毒含量偏低的问题，如能提高病毒含量将有效降低生产成本。为了提高i群禽腺病毒的防控能力和防止i群腺病毒的蔓延，分离得到增殖能力强的i群4型禽腺病毒分离株，对于研制i群4型禽腺病毒灭活疫苗、提高i群禽腺病毒的防控能力具有重要的意义。技术实现要素：本发明的目的之一是提供一株分离的i群4型禽腺病毒dn株；本发明的目的之二是提供i群4型禽腺病毒灭活疫苗；本发明的目的之三是提供一种制备所述i群4型禽腺病毒灭活疫苗的方法。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本发明首先提供了一株分离的i群4型禽腺病毒dn株：本发明从发病鸡肝脏中通过毒种的分离培养得到一株i群4型禽腺病毒，通过血凝特性鉴定、群特异性鉴定、型特异性鉴定、理化特性检验、动物回归试验、病毒的pcr检测及病毒的测序检测等实验最终确定所分离的病毒株是i群4型禽腺病毒株，命名为i群4型禽腺病毒dn株，将其提交到专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号是：cgmccno.18501，分类命名是：i群4型禽腺病毒；保藏时间是：2019年08月29日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明i群4型禽腺病毒dn株的分离结果显示：病毒盲传5代，鸡胚表现为死胚、胚体矮小、发育迟缓、胎儿卷曲、肝脏肿大和质脆，胚胎充血。收获的病毒液经红细胞凝集试验检测无血凝活性。本发明i群4dn株血清学鉴定结果显示：用i群禽腺病毒1～12型标准毒株、分离毒株对i群禽腺病毒1～12型标准阳性血清，按2010年版《中国兽药典》附录固定病毒稀释血清法进行中和试验。结果：分离毒株测4型标准阳性血清的中和效价(1:872)与4型标准毒株测4型标准阳性血清的中和效价(1:858)较接近；分离毒株测其它型标准阳性血清的中和效价均在1:10以下。结果表明分离株是血清4型。分离毒株抗原仅能与i群禽腺病毒4型阳性血清出现明显沉淀线，而与iii群禽腺病毒edsv-76京911株标准阳性血清及阴性血清之间均未出现沉淀线。本发明i群4型禽腺病毒dn株理化特性检验结果显示：分离毒株不耐碱；对热敏感，60℃，1h可被灭活；对乙醚和氯仿有抵抗力，耐酸。本发明i群4型禽腺病毒dn株的动物回归试验结果显示：分离毒株引起试验雏鸡100％发病死亡。经剖检可见心包积水，肝脏肿大，边缘有黄白色坏死斑，或表面有不同程度的出血点和出血斑，肝脏褪色呈淡褐色至黄色，质脆；肾脏肿大出血。鸡肝脏组织切片可观察到肝细胞核内包涵体。本发明i群4型禽腺病毒dn株的pcr检测结果显示：通过i群4型禽腺病毒特异性引物和相应的pcr试验，分离毒株扩增出了相应的632bp目的片段。本发明i群4型禽腺病毒dn株的测序检测，其中i群4型禽腺病毒dn株hexon基因序列为序列表中seqidno.1所示；结果显示：使用dnastar软件包对测序结果进行拼接。使用在ncbi上在线比对工具blast对拼接后的序列进行相似性搜索，结果发现所分离的毒株是i群禽腺病毒4型。本发明所分离的i群4型禽腺病毒dn株具有良好的特异性和免疫原性，可作为灭活疫苗生产用毒株及检验用毒种。因此，本发明进一步提供了i群4型禽腺病毒灭活疫苗，由防治上有效量的i群4型禽腺病毒dn株的灭活的抗原液和药学上可接受的免疫佐剂或辅料组成。本发明还进一步提供了一种制备所述i群4型禽腺病毒灭活疫苗的方法，包括：(1)制备抗原液：将i群4型禽腺病毒dn株接种细胞进行增殖培养，收获病毒液得到抗原液；(2)将抗原液灭活后制备水相；(3)将水相和油相混合后乳化，即得i群4型禽腺病毒灭活疫苗。其中，步骤(1)中所述的细胞优选为鸡肝癌细胞(lmh细胞)。作为一种更优选的实施方式，步骤(1)中所述抗原液的制备方法包括：当鸡肝癌细胞长成60％以上的单层时弃去生长液，按照0.001％-1％的病毒接种量接种i群4型禽腺病毒dn株，加入含1-3％新生牛血清的维持液，在温度34℃-38℃、5％co2培养箱中培养，收获病毒液，即得。本发明通过试验发现，在制备抗原液时，接毒时间、维持液血清含量、接毒剂量、细胞培养温度、收毒时间等参数对于抗原液病毒含量有较为显著的影响，为了确定最适宜的参数，本发明分别对接毒时间、维持液血清含量、接毒剂量、细胞培养温度、收毒时间等参数进行了优化确定制备抗原液的最适宜参数。本发明考察了接毒时间对于病毒液病毒含量的影响：以鸡肝癌细胞在三种生长状态下繁殖dn株病毒液，当鸡肝癌细胞传代24h(细胞长成60～70％单层)、36h(长成70～80％单层)和48h(长成90％以上单层)种病毒，按0.01％的量接毒，37℃、5％co2培养箱培养，当80％以上的细胞出现cpe时，收获病毒液，反复冻融2次后，分别测定其tcid50，以tcid50最高者的接毒时间为最佳接毒时间，结果发现采用鸡肝癌细胞生长48h长成90％以上良好单层时接种培养i群4型禽腺病毒dn株，收获的病毒液病毒含量最高。本发明考察了维持液中新生牛血清含量对于病毒液病毒含量的影响：将i群4型禽腺病毒dn株病毒液按0.01％的量接种长成良好单层的鸡肝细胞，维持液中新生牛血清含量分别为1％、2％、3％，分别于37℃、5％co2培养箱培养，观察细胞病变出现的时间，当80％细胞出现cpe时收获细胞毒液，反复冻融2次后分别测定其tcid50，以tcid50最高者的培养基为最佳维持液血清含量。结果表明，含1％、2％新生牛血清的细胞维持液，在收毒时间和病毒含量差异不显著，1％较2％的维持液在培养后期形态稍差，死细胞稍多；含3％新生牛血清的dmem细胞维持液与2％血清的差异不大，考虑到生产成本，本发明确定2％新生牛血清的dmem作为培养i群4型禽腺病毒dn株的最佳维持液。本发明考察了病毒接种剂量对于病毒液病毒含量的影响：本发明分别以0.001％，0.01％，0.1％、1％、4个不同剂量的dn株病毒液接种鸡肝癌细胞，观察并记录出现细胞病变的时间及病变程度，当80％以上的细胞出现细胞病变收获病毒液，反复冻融2次后，分别测定其病毒含量(tcid50)，以tcid50最高者的接毒剂量为最佳接毒剂量；试验结果表明，种毒接种剂量以0.01％接种，收获的病毒液病毒含量最高。本发明考察了细胞培养温度对于病毒液病毒含量的的影响：将i群4型禽腺病毒dn株病毒液按0.01％的量接种长成良好单层的鸡肝癌细胞，分别置于34℃、36℃、37℃、38℃培养，观察细胞病变出现的时间及病变程度，当80％细胞出现cpe时收获细胞毒液，反复冻融2次后分别测定其tcid50，以tcid50最高者的培养温度为最佳培养温度；结果发现，病毒接种鸡肝癌细胞后，置37℃、5％co2培养箱培养病毒含量最高，在108.50～108.68tcid50/0.1ml。本发明考察了收毒时间对于病毒液病毒含量的的影响：将i群4型禽腺病毒dn株病毒液按0.01％的量接种长成良好单层的鸡肝癌细胞，分别于37℃、5％co2培养箱培养，当细胞出现70％、80％、90％左右cpe时收获病毒液，反复冻融2次后，分别测定其tcid50，以tcid50最高者的收毒时间为最佳收毒时间。结果发现，接毒后48h收毒，cpe不到50％时，病毒含量较低；接毒54h～60h，cpe达70％左右，病毒含量均≥108.38tcid50/0.1ml：72h收毒，cpe在90％，病毒含量最高，在96小时收毒，细胞基本圆缩脱落，病毒含量降低。综合上述试验结果，本发明提供了一种以i群4型禽腺病毒dn株为毒株，以鸡肝癌细胞为宿主细胞制备抗原液的最佳制备参数，即：当鸡肝癌细胞生长48h形成90％以上的细胞单层时，弃去生长液，按0.01％接种病毒，加入含2％新生牛血清的维持液，37℃、5％co2培养箱培养72小时收毒；采用该方法制备得到的病毒液中病毒含量高达108.50～108.83tcid50/0.1ml。作为一种优选的实施方式，步骤(2)中所述的将抗原液灭活包括：向抗原液中加入福尔马林溶液进行抗原液的灭活；优选的，向抗原液中加入福尔马林溶液至福尔马林溶液的终浓度为0.2％，置灭活罐中37℃温箱灭活16小时。作为一种优选的实施方式，步骤(2)中所述的水相按照以下方法制备得到：将灭活浓缩后的病毒抗原液与吐温-80混合均匀，即得；其中，灭活浓缩后的病毒抗原液与吐温-80的体积比优选为95:5。作为一种优选的实施方式，步骤(3)中所述的油相由白油和司本-80组成，二者的体积比为94:6；其制备方法包括：将二者混合后加热，加入硬脂酸铝混合均匀，即得；其中，按照g/ml计，所加入的硬脂酸铝占混合物总量的1％。作为一种优选的实施方式，步骤(4)将水相和油相混合均匀进行乳化；其中，水相和油相的体积比优选为1:2；所述的乳化时间优选为30min。用本发明所制备的i群4型禽腺病毒灭活疫苗按照一次单剂量、重复单剂量和超剂量注射雏鸡，在观察时间内，均无任何不良反应，表明本发明所制备的i群4型禽腺病毒灭活疫苗具有良好的安全性。用本发明所制备的i群4型禽腺病毒灭活疫苗进行鸡的免疫效力保护试验，对于7～21日龄鸡免疫剂量0.1ml/只，21日龄以上鸡免疫剂量0.2ml/只；结果发现，免疫后7日即可产生抗体，免疫后14日对i群4型禽腺病毒达到100％的保护率，免疫保护期达7个月；证明本发明所制备的i群4型禽腺病毒灭活疫苗可有效预防因i群4型禽腺病毒引起的鸡心包积水、包涵体肝炎。相较于现有技术，本发明的主要有益效果包括：1、本发明对制备病毒抗原液的各项关键参数进行了优化，最终摸索得到了最适宜的制备参数，所制备的抗原液中每0.1ml病毒含量达到108.5tcid50以上，从而减少疫苗注射剂量，降低动物的应激反应，提高生产性能，有效降低了生产成本。2、本发明所分离的i群4型禽腺病毒dn株免疫原性良好，用其制备的i群4型禽腺病毒灭活疫苗抗体产生快，持续时间长，减少疫苗注射剂量，降低动物的应激反应，提高生产性能。对于7～21日龄鸡免疫剂量0.1ml/只，21日龄以上鸡免疫剂量0.2ml/只，免疫后7日即可产生抗体，免疫后14日对i群4型禽腺病毒达到100％的保护率，免疫保护期达7个月。3、本发明i群4型禽腺病毒灭活疫苗安全性良好，按照一次单剂量、重复单剂量和超剂量注射雏鸡，在观察时间内，均无任何不良反应。附图说明图1为分离毒株的pcr鉴定结果；m：trans5kplusmarker；1：阳性对照，2：扩增产物，3：扩增产物，4：阴性对照。图2为hexon基因的同源性分析结果。图3为i群4型禽腺病毒灭活疫苗工艺流程图。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1i群4型禽腺病毒dn株分离培养及鉴定1病毒株分离：取发病鸡肝脏，研碎后按1:5的比例加入灭菌生理盐水制成悬液；反复冻融3次后，3000r/min离心30min，取上清；加入青霉素、链霉素各5000iu/ml，4℃过夜，经微孔滤器过滤，无菌检验合格后保存备用。将上述制备的病毒液以0.2ml/胚的剂量，经卵黄囊途径接种6.5日龄spf鸡胚，弃24h内死胚，取接种48～168h内死亡鸡胚的尿囊液和胎儿，用上述方法处理后连续传5代，观察第5代死胚，鸡胚表现为死胚、胚体矮小、发育迟缓、胎儿卷曲、肝脏肿大和质脆，胚胎充血，并收集死胚尿囊液和胎儿，-20℃保存，进行下列鉴定。2血凝特性鉴定：无菌采集spf鸡和鸭血液5～10ml，反复洗3～5次，末次用生理盐水将血细胞稀释成0.8％、1％和2％浓度，4℃保存备用。按常规方法检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。同时设iii群禽腺病毒edsv-76为凝集反应阳性对照。分离毒株不能凝集spf鸡和鸭红细胞，即使改变红细胞的浓度，也不能使之凝集。阳性对照能够凝集鸡、鸭的红细胞。3群特异性鉴定：利用琼脂凝胶扩散试验(agp)制备琼脂凝胶平板对分离毒株进行群特异性鉴定。琼脂凝固后，用打孔器打孔，打孔图案为中央1孔四周6孔，孔径4mm，孔距为4mm，孔底封闭。待检病毒置于中间孔，周围孔加i群禽腺病毒标准株、edsv-76京911株标准阳性血清及阴性血清。将琼扩板放置于加盖湿盒中37℃作用24～48h，观察分离毒株抗原仅能与i群禽腺病毒4型阳性血清出现明显沉淀线，而与iii群禽腺病毒edsv-76京911株标准阳性血清及阴性血清之间均未出现沉淀线。4型特异性鉴定：i群禽腺病毒1～12型标准阳性血清首先作1:10稀释，再按2010年版《中国兽药典》附录固定病毒稀释血清法，将i群禽腺病毒1～12型标准毒株、分离毒株对i群禽腺病毒1～12型标准阳性血清进行交叉中和试验，结果显示分离毒株测4型标准阳性血清的中和效价(1:872)与4型标准毒株测4型标准阳性血清的中和效价(1:858)较接近；分离毒株测其它型标准阳性血清的中和效价均在1:10以下，表明分离株是血清4型。5理化特性检验：参照《动物病毒学》介绍的方法，病毒液分别以氯仿、乙醚、盐酸(ph3)、氢氧化钠(ph10)、温度(60℃、1h)处理后，接种鸡胚(0.2ml/胚)，另设生理盐水处理组作为对照。接种三天后观察鸡胚病变。结果显示病毒不耐碱，对热敏感，60℃，1h可被灭活，对乙醚和氯仿有抵抗力，耐酸。6动物回归试验：将分离株接种30日龄spf鸡10只，每只肌肉注射0.1ml，连续观察10日并进行剖检。分离毒株引起试验雏鸡100％发病死亡。试验鸡接种分离毒后第2日开始发病、死亡，7日内共发病死亡9只，剩余1只攻毒后第4天发病，但第7日开始恢复，第10日基本恢复。临床症状主要表现为精神沉郁，食欲不振，闭眼嗜睡、蹲伏、甚至死亡；经剖检可见心包积水，肝脏肿大，边缘有黄白色坏死斑，或表面有不同程度的出血点和出血斑，肝脏褪色呈淡褐色至黄色，质脆；肾脏肿大出血。7pcr检测：取收获的腺病毒尿囊液，提取病毒dna，利用i群禽腺病毒鉴定引物进行pcr反应。1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。以提取的病毒dna为模板，运用fadv-4特异性检测引物进行pcr扩增，体系见表1(20μl体系)。反应条件：45℃30min，94℃5min，35cycles：94℃30s，56℃30s，72℃40s，72℃10min，4℃结束反应。电泳结果见图1。表1pcr反应体系dnatemplate1.0ulhexon-f(10μm)1.0ulhexon-r(10μm)1.0ul2×easytaq@pcrsupermix10.0ulddn2o7.0ul总体积20.0ul8hexon基因测序和分析：取收获的尿囊液，提取病毒dna，利用fadv-4hexona,hexonb引物进行pcr扩增，pcr扩增体系见表2(50μl体系)。反应条件﹕32cycles：98℃10sec，66℃(hexona)，57℃(hexonb)15s，72℃100s，4℃结束反应。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收胶进行测序。pcr产物经电泳鉴定大小正确后，送测序公司进行核苷酸序列测定。使用dnastar软件包对测序结果进行拼接，将测序结果使用blast流感数据库中的序列进行比较，以从分子水平确定所分离病毒的血清型。不同毒株的hexon基因序列见序列表中seqidno.1所示的碱基序列。表2pcr反应体系实施例2i群4型禽腺病毒dn株的纯化鉴定1病毒的纯化：取实施例1中病毒第5代鸡胚液100倍稀释后，在鸡肝癌细胞(lmh细胞)上盲传3代后，取盲传后的细胞病毒液用细胞维持液进行10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种长成单层的鸡肝细胞，每孔1ml，置于37℃、5％co2培养箱中吸附30min后弃掉吸附液，加入含1％低熔点琼脂糖的细胞维持液3ml，培养72小时后用中性红染色，选择最高稀释度的单斑按照上述方法进行克隆2代，选择最高稀释度的单个斑作为克隆纯化后的种毒。2克隆纯化后的毒种扩繁：将克隆的病毒进行100倍稀释后接种长成单层的鸡肝癌细胞(lmh细胞)，置于37℃、5％co2培养箱培养72小时，当细胞80％以上发生病变时收获细胞液，反复冻融3次后，按上述方法传1代后收获细胞病毒液，分装置于-70℃保存建立原始种子批c0。3毒种的鉴定3.1病毒含量测定：将c0代毒种用dmem作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93个稀释度，分别接种48孔细胞板，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml。同时设病毒阳性对照孔和细胞阴性对照孔。每孔补加0.4ml含5％血清的鸡肝癌细胞(lmh细胞)悬液，置37℃、5％co2培养箱中培养144小时，测定c0病毒含量为108.38tcid50/0.1ml。3.2致细胞病变(cpe)作用：将c0代毒种用细胞维持液进行100倍稀释，接种于长势良好的鸡肝细胞，置37℃培养48～72小时，均出现细胞圆缩等特异性病变。3.3对雏鸡的毒力：将c0代毒种，用灭菌生理盐水或pbs稀释至105.5tcid50/0.1ml，肌肉注射42～56日龄spf鸡10只，每只0.2ml。试验鸡攻毒后3～5日发病，发病后1～2日多数死亡，攻毒后7日内不发病的鸡以后不再发病，攻毒后发病但7日内不死亡的鸡逐渐康复，发病死亡鸡及处于发病期间的鸡于攻毒后7日剖检有典型的心包积水及肝脏或肾脏肿大病变。攻毒后7日内发病率10/10，死亡率9/10。3.4免疫原性：将c0代毒种制备灭活疫苗，取21～28日龄spf鸡20只，10只各颈部皮下或肌肉注射灭活疫苗，每只0.3ml，另10只不免疫作对照。接种后21～28日，所有免疫鸡和对照鸡，肌肉注射i群4型禽腺病毒dn株病毒液(约含105.5tcid50/0.1ml)，每只0.2ml。免疫组鸡观察14日，攻毒保护率为10/10；对照组鸡攻毒后7日内发病率为10/10，死亡率9/10。3.5特异性：将c0代毒种用细胞维持液稀释至200tcid50/0.1ml，与等量抗i群4型禽腺病毒特异性血清混合，在室温中和1小时后，接种长势良好的鸡肝细胞(24孔细胞板)4孔，每孔0.2ml，补充维持液至2.0ml；同时设未中和的病毒液4孔作阳性对照，正常细胞2孔作阴性对照，置37℃、5％co2培养箱培养和观察168小时，病毒阳性对照出现细胞病变，中和组和细胞阴性对照应不出现细胞病变。3.6纯净：按现行《中国兽药典》附录进行纯净检验。无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。实施例3i群4型禽腺病毒dn株最佳培养条件筛选试验1最佳接毒剂量的确定：分别以0.001％，0.01％，0.1％、1％、4个不同剂量的dn株病毒液接种鸡肝细胞，观察并记录出现细胞病变的时间及病变程度，当80％以上的细胞出现细胞病变收获病毒液，反复冻融2次后，分别测定其病毒含量(tcid50)，以tcid50最高者的接毒剂量为最佳接毒剂量。试验结果表明，种毒接种以0.01％接种，收获的病毒液病毒含量最高。见表3。表3最佳接毒剂量的确定(病毒量单位：tcid50/0.1ml)2最佳接毒时间的确定：以细胞在三种生长状态下繁殖dn株病毒液，当鸡肝细胞传代24h(细胞长成60～70％单层)、36h(长成70～80％单层)和48h(长成90％以上单层)接种病毒，按0.01％的量接毒，37℃、5％co2培养箱培养，当80％以上的细胞出现cpe时，收获病毒液，反复冻融2次后，分别测定其tcid50，以tcid50最高者的接毒时间为最佳接毒时间。结果表明采用细胞生长48h长成良好单层时接种培养i群4型禽腺病毒dn株病毒含量最高。详见表4。表4最佳接毒时间的确定(病毒含量单位：tcid50/0.1ml)3最佳培养温度的确定：将i群4型禽腺病毒dn株病毒液按0.01％的量接种长成良好单层的鸡肝细胞，分别置于34℃、36℃、37℃、38℃培养，观察细胞病变出现的时间及病变程度，当80％细胞出现cpe时收获细胞毒液，反复冻融2次后分别测定其tcid50，以tcid50最高者的培养温度为最佳培养温度。病毒接种细胞后，置37℃、5％co2培养箱培养病毒含量最高，在108.50～108.68tcid50/0.1ml。详见表5。表5最佳培养温度的确定(病毒含量单位：tcid50/0.1ml)4最佳收毒时间的确定：将i群4型禽腺病毒dn株病毒液按0.01％的量接种长成良好单层的鸡肝细胞，分别于37℃、5％co2培养箱培养，当细胞出现70％、80％、90％左右cpe时收获病毒液，反复冻融2次后，分别测定其tcid50，以tcid50最高者的收毒时间为最佳收毒时间。结果表明，接毒后48h收毒，cpe不到50％时，病毒含量较低；接毒54h～60h，cpe达70％左右，病毒含量均≥108.38tcid50/0.1ml：72h收毒，cpe在90％，病毒含量最高，在96小时收毒，细胞基本圆缩脱落，病毒含量降低。详见表6。表6最佳收毒时间的确定(病毒含量单位：tcid50/0.1ml)5最佳维持液血清含量确定：将i群4型禽腺病毒dn株病毒液按0.01％的量接种长成良好单层的鸡肝细胞，维持液中新生牛血清含量分别为1％、2％、3％，分别于37℃、5％co2培养箱培养，观察细胞病变出现的时间，当80％细胞出现cpe时收获细胞毒液，反复冻融2次后分别测定其tcid50，以tcid50最高者的培养基为最佳维持液血清含量。结果表明，含1％、2％新生牛血清的细胞维持液，在收毒时间和病毒含量差异不显著，1％较2％的维持液在培养后期形态稍差，死细胞稍多；含3％新生牛血清的dmem细胞维持液与2％血清的差异不大，考虑到生产成本，选择2％新生牛血清的dmem作为培养i群4型禽腺病毒dn株的最佳维持液。详见表7。表7维持液血清最佳含量确定(病毒含量单位：tcid50/0.1ml)6验证试验：根据上述的试验结果，确定最佳培养方式，当鸡肝细胞生长48h形成90％以上的细胞单层时，弃去生长液，按0.01％接种病毒，加入含2％新生牛血清的维持液，37℃、5％co2培养箱培养72小时收毒，反复冻融2次，测定病毒含量。结果表明，制备的3批病毒液病毒含量差异不显著，为108.50～108.83tcid50/0.1ml。详见表8。表8验证试验结果实施例4i群4型禽腺病毒dn株灭活疫苗的制备1鸡肝癌细胞(lmh细胞)制备：从液氮罐中取出冻存管置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10ml培养液的离心管中，1000r/min离心5分钟。用含10％新生牛血清的培养液悬浮细胞，置于37℃，5％co2培养箱培养，当长成良好单层时，用0.25％胰蛋白酶-edta消化细胞，传代培养。2病毒培养：用细胞培养液将扩大培养的种子细胞稀释成每毫升含40～100万活细胞，接种到转瓶中，37℃培养60～72h小时，当90％以形成上的细胞单层时，弃去细胞培养液，加入含0.1％毒种的细胞维持液，置于37℃培养，转速为每小时9～11转。3观察与收获：接毒后，培养72h，当细胞病变达到90％以上时收获，反复冻融2次收获抗原液。4灭活：将病毒液导入灭活罐内，计量加入10％的甲醛溶液，充分混合，甲醛的终浓度为0.2％，37℃条件下灭活16小时(罐内抗原温度达到37℃开始计时)。5半成品检验5.1病毒含量：将灭活前的病毒液用dmem作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-83个稀释度，分别接种48孔细胞板，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml。同时设病毒阳性对照孔和细胞阴性对照孔。每孔补加0.4ml含5％血清的鸡肝癌细胞(lmh细胞)悬液，置37℃、5％co2培养箱中培养144小时。每日观察，记录cpe情况，计算tcid50。每0.1ml病毒含量应不低于108.0tcid50。5.2无菌检验：取灭活的抗原液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。5.3灭活检验：将灭活后的病毒液作10倍稀释，接种长势良好的鸡胚肝细胞(24孔细胞板)4孔，每孔0.2ml，补充维持液至1ml，同时设鸡肝癌细胞(lmh细胞)作空白对照，置37℃、co2培养箱中培养120小时。细胞对照孔及样品孔均不出现细胞病变。将培养物收获反复冻融后盲传1代，按上述方法继续培养120小时，样品孔仍不出现细胞病变时，判定为灭活完全。6疫苗制备6.1油相制备：取注射用白油94份，加硬脂酸铝1份，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-806份，混合后，高压灭菌备用。6.2水相制备：将灭活后的抗原液95份，加入灭菌的吐温-805份，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解。6.3乳化：取油相2份放入乳化罐内，慢速搅拌同时缓缓加入1份水相，乳化30min。7成品检验7.1性状外观均匀乳剂。剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出水相应不超过0.5ml。黏度按现行的《中国兽药典》附录进行，应符合规定。7.2装量检查：按现行的《中国兽药典》附录进行，应符合规定。7.3无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。7.4安全检验：用7～14日龄spf鸡10只，每只颈部皮下分点注射疫苗0.4m1，观察14日，应不出现因注射疫苗而引起的任何局部和全身不良反应。7.5效力检验7.5.1血清学方法：取21～28日龄spf鸡20只，其中10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2m1，另10只作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，用琼扩试验检测i群4型禽腺病毒抗体，免疫组至少8只阳性，对照组应全部阴性。7.5.2免疫攻毒法取21～28日龄spf鸡20只，其中10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2m1，另10只作对照。接种后21～28日，所有免疫鸡和对照鸡，肌肉注射i群4型禽腺病毒dn株病毒液(病毒含量不低于105.0tcid50/0.1ml)，每只0.2ml，对照鸡攻毒后7日内，应至少发病8只，免疫鸡攻毒后观察14日，应至少保护8只。7.6甲醛残留量测定：按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。按照上述方法，分别制备了三批i群4型禽腺病毒灭活疫苗，批号为201901，201902，201903，成品检验符合标准。试验例1i群4型禽腺病毒灭活疫苗的安全性以及免疫持续期试验1、i群4型禽腺病毒灭活疫苗安全性试验制备的三批i群4型禽腺病毒灭活疫苗，批号为201901，201902，201903，分别以单剂量、单剂量重复及超剂量，经皮下和肌肉两种途径免疫不同日龄(7日龄和14日龄)的spf鸡。接种后观察28日，接种鸡精神和饮食状况均未见异常；试验鸡注射部位无结节形成，无脓肿和溃烂发生。此外，对一次超剂量接种鸡的增重监测结果显示，接种鸡的相对增重率与对照鸡相比无明显差异，表明疫苗对接种鸡的生长性能未产生不良影响。确定该疫苗安全检验的标准为：用7～14日龄spf鸡10只，各颈背部皮下或腿部肌肉注射疫苗0.6ml，连续观察14日。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。结果见表9～12。表9对7日龄和14日龄spf鸡单剂量接种后观察结果表10对7日龄和14日龄spf鸡单剂量重复接种后观察结果表11对7日龄和14日龄spf鸡超剂量接种后观察结果表12超剂量注射对spf鸡生长性能影响的试验结果注：平均增重＝末期平均体重-初始平均体重；相对增重率(％)＝(疫苗组平均增重/对照组平均增重)×100。2、免疫持续期试验制备的三批i群4型禽腺病毒灭活疫苗，批号为201901，201902，201903，分别免疫7日龄spf鸡及22日龄spf鸡，7日龄spf鸡颈部皮下免疫0.1ml，免疫后7日、14日、21日、28日、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月和7个月，22日龄spf鸡颈部皮下免疫0.2ml，免疫后7日、14日、21日、28日、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月和7个月，分别从各免疫组随机抽10只，连同条件对照鸡10只，于免后定期采血监测抗体变化，以研究疫苗的免疫期。结果显示，7日龄和22日龄spf鸡免疫后7日即可产生抗体，免疫后14日对i群4型禽腺病毒达到100％的保护率，免疫保护期达7个月；具体试验结果见表15～16。表157日龄spf鸡免疫后的抗体监测表1622日龄spf鸡免疫后的抗体监测sequencelisting<110>哈尔滨科欣农业科技有限公司<120>i群4型禽腺病毒dn株、灭活疫苗及其制备方法和应用<130>hlj-3011-180923a<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>2833<212>dna<213>adenovirus<400>1cgtctaggttcgcaccgccatggcggccctcacgcccgacctgactaccgcgactccgcg60gctccagtattttcacatcgcgggccccgggacgcgcgaatacctctctgaggacctcca120acagttcatttccgccaccggaagctactttgacttgaaaaacaagttcagacagacggt180cgtggcgcccacccgaaatgtcacgacagaaaaggctcaacggctgcaaatccgctttta240ccccatccaaaccgacgacacgtcgacgggctaccgcgtgcggtacaacatcaatgtggg300cgacggttgggtcctggacatggggtcgacctatttcgacatcaagggaatcctagaccg360agggccgtccttcaagccctactgcggcacggcttacaacccgctggctcccaaggagtc420catgtttaacaactggtcggagacggcacccgggcagaacgtgtccgcctccggtcagct480gtccaacgtctataccaacacgagcacctccaaagacacgacggcggcgcaggtgacgaa540gatttccggcgtcttccccaatcccaaccagggacccggaagaaatcctctgcgacgggt600acaaaacgccaacaccggcgtgctcggtcgcttcgccaagtctcagtacaattacgctta660cggtgcctacgtcaagcccgtcgccgccgacggttcccagtccctcacgcagacccccta720ctggatcatggataacacgggcaccaattacctgggagcggtggccgtcgaggactacac780caacagcctctcgtacccagataccatagtcgtgccgcctcccgaggactacgacgatta840taacataggcaccacgcgtgcgctcaggcccaactacatcgggttcagggataacttcat900taacctgctgtatcacgactccggcgtgtgctcgggcaccctcaactcggagcgttcggg960catgaacgtggtggtcgagctgcccgaccggaataccgagctcagctaccagtacatgct1020ggccgacatgatgtcccgccatcactatttcgccctgtggaaccaggccgtggaccagta1080cgaccccgaggtgcgagtcttctccaatgacggttacgaagaaggcgcgcccagctacgc1140cttcaaccccgaagcggtaggcgcgggagaaggctacggccccgatctcagtcaaattaa1200actctacaccaacaacaccgccgcgaacgacaaaaacaccgccgtggctaacgccactac1260caacttctacttcggcacggtaccctcctacgaaatcgatatcagcgctacccagaggcg1320caactttatcatggccaacatcgccgagtatctgcccgaccgttacaagtttagcatctc1380cggcttcgacgccaccagcgtcgcgcctaccacctacgagtacatgaacaagcgcgtccc1440cctcaccaacgtcgtcgacatgttcacgaacgtgggtgcgcgttggtccatcgaccagat1500ggacaacgtcaaccccttcaaccacaggagaaactgggggctgaaataccgctcccagct1560gctgggaaacagtcgctacgtcaacttccacatccaagtgccccaaaaattcttcgccat1620caaaaacctgctgctgctctccggctcgtacacctacgagtgggtgctgcgcaaagaccc1680caacatgatcctccaatccagtctgggcaacgacctgcgcgccgacggcgccagcatcat1740ctacaacgaggtgaacctcatggccaacttcatgcccatggatcacaacaccagtaacca1800gctcgagctgatgctgagaaacgccaccaacgatcagaccttcgtggactacctgggagc1860caaaaacgctctatactcggtgcccgcgggctccaccgccctcaccatcaacattcccgc1920tcgcacctgggaggggatgcgcgggtggtccttcactcgcatcaaggcggccgagacgcc1980tcagctgggcgcccagtacgacgtcaacttcaagtactcgggcagcatcgcctactcaga2040tggaggcttctacctctcgcacaccttccgtaacatgagcatcctcttcgacacgtccat2100caactggccgggcaacgaccggttgctcacgcctaacatgttcgagatcaagcgctcggt2160ggcgctcgacaccgagggcttcaccatgagccagtgcgacatcaccaaggactggtacct2220gatccagatggccacgaactacaacttcgtctataacggctatcgattctggcccgatcg2280tcagtacttccactacgacttcctgcgaaatttcgaccccatgacgcgccagggacccaa2340cttcgcattgcccggcctcttcgacctcgtgtcttacacccctaccacggacaacagcgg2400acagcagcctagtcaggaagccgtgcgcaacaactctgggtttatcgccccccgctcctg2460gcccgtctggagcgctcaccagggcgagagctggcccgccaactggccgtacccgctctg2520cggtcagcaggccatccaacccgcacaggtcctcagctacaagaagttcctctgcgacaa2580ctacctgtggaccatcccgttcagttccgactttatgtacatgggcgaactgacagatct2640gggccagaaccccatgtacaccaacaactcgcacagcatggtcatcaacttcgagctcga2700ccccatggatgatcccacttacgtgtacatgctctatggcgtgttcgacaccgttagggt2760caaccagcccgaacgtaacgtgctagctatggcttacttccgtacgcctttcgccacagg2820caacgccgtgtaa2833当前第1页12