一种急性髓系白血病中基因突变的检测试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其涉及一种急性髓系白血病中基因突变的检测试剂盒及应用。

背景技术：

白血病是由于造血干或前体细胞基因异常，导致细胞增殖、分化或凋亡异常，是一类具有高度异质性的恶性血疾病，其诊疗需要从形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学进行综合分析。白血病中最常见的分子生物学异常主要包括：基因突变、融合基因、基因表达，而基因突变中又以点突变、基因片段插入或缺失为主。

急性髓系白血病(aml)是儿童及成人中常见的一种恶性血液肿瘤。在我国每10万人中就有1-2个人发生，主要发生在成年人中，且病情急重，预后凶险。随着分子生物学测序技术的不断发展，大量与急性髓系白血病密切相关的分子生物学标记被发掘出来。从2006版nccn指南中，flt3-itd只是作为临床医师推荐使用的检测指标，到2010版nccn指南中，c-kit、flt3-itd、npm和cebpa的明确指出，再到2018版nccn指南中新增的idh1、idh2、tp53等，基因突变所带来的临床意义，正如火如荼的被研究发现。2016年who再次修订了血液肿瘤的分类，其中急性髓系白血病(aml)中明确了aml伴cebpa双等位基因突变及aml伴npm1基因突变的亚型，新增了runx1基因突变伴aml的亚型，aml伴runx1突变代表一种生物学上的特殊亚型，相比较aml其他亚型而言，提示可能存在较差的预后。2018年的国内专家共识---《二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识》中指出基因突变的检测在血液肿瘤诊疗中的应用价值，可为临床诊断分型、预后判断、治疗指导、微小残留病灶(mrd)监测以及克隆演变提供参考。

目前，分子生物学中基因突变检测的方法主要有一代测序(sanger)、高通量测序技术(ngs)、实时荧光pcr(rq-pcr)、数字pcr等，而高通量靶向测序技术主流的又以多重pcr的靶向测序和捕获探针的靶向测序为主。与一代(sanger)测序技术相比，多重pcr的靶向测序技术具有更高的灵敏度，并且能够定量检测出基因突变负荷率；与捕获探针的靶向测序相比，多重pcr的靶向测序技术文库构建流程更加简单，能提供更经济、快速的测序方案，而实时荧光pcr(rq-pcr)及数字pcr大多数是针对基因中已知突变位点的进行检测，并且实验过程中引物探针费用较高，做多基因突变筛查可行性较差。

因此，利用多重pcr靶向高通量测序技术高准确率、高覆盖度、高检出率筛查aml中基因变异情况，给出准确、权威的医学解读报告，为aml患者的疾病诊断、预后分层和靶向治疗提供指导的问题亟待解决。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种与aml中具有明确临床意义的23种基因编码区内不同变异类型(点突变、小片段插入/缺失等突变类型)的多重pcr靶向高通量测序的检测试剂盒及检测试剂盒的应用，利用多重pcr靶向高通量测序技术高准确率、高覆盖度、高检出率筛查aml中基因变异情况，给出准确、权威的医学解读报告，为aml患者的疾病诊断、预后分层和靶向治疗提供指导。

为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种急性髓系白血病中基因突变的检测试剂盒，包括23个基因的引物工作液、多重pcr试剂、无水乙醇、纯化磁珠和nuclease-freewater，所述多重pcr试剂包括多重扩增体系中的pcr混合液、pcr反应液、消化液、接头p5和接头p7，所述pcr混合液包括tris-hcl、10×buffer、4种dntp混合物、ph为8.3的mgcl2，所述pcr反应液包括taqdna聚合酶，所述消化液包括虾碱酶和外切酶。

其中，所述23个基因的引物工作液的浓度为4.0～6.0pmol/ul，所述无水乙醇为500ml，所述纯化磁珠为60ml，所述nuclease-freewater为5ml。

其中，所述tris-hcl为100mm，所述taqdna聚合酶为3000u/ml，所述虾碱酶和外切酶为5000u/ml。

其中，所述接头p5为通用型引物序列；所述接头p7为识别样本的碱基序列。

第二方面，本发明提供一种急性髓系白血病中基因突变的检测试剂盒的应用，包括：

利用dna提取试剂盒对待测样本进行抽提dna，抽提的dna浓度大于或等于10ng/ul；

利用检测试剂盒对抽提的dna进行多重pcr反应，得到多个目标核苷酸的扩增子产物；

对多个目标核苷酸的扩增子产物进行纯化，得到纯净的扩增子产物；

以纯化后的扩增子产物作为模板，加入接头p5、接头p7、pcr混合液、pcr反应液进行pcr反应，得到新的扩增子文库；

加入纯化磁珠结合目标片段回收扩增子产物，洗涤去除反应杂质，得到纯净的扩增子文库；

对纯净的扩增子文库进行高通量测序和生信流程分析获取目标区域的序列信息，得出基因突变结果。

在一实施方式中，利用dna提取试剂盒对待测样本进行抽提dna，抽提的dna浓度大于或等于10ng/ul，具体包括：

将25ng的dna、5ul的pcr混合液、1ul的pcr反应液、1ul的上游引物和1ul下游引物，用nuclease-freewater补足体系至10ul，通过运行pcr程序预变性95℃15min，再进行95℃30s，60℃90s，72℃90s共24个循环，72℃10min，4℃暂存，得到多个目标核苷酸的扩增子产物。

在一实施方式中，对多个目标核苷酸的扩增子产物进行纯化，得到纯净的扩增子产物，具体包括：

加入消化液，pcr仪上运行程序37℃30min，80℃10min，加入纯化磁珠结合目标片段回收扩增子产物，洗涤去除反应杂质，得到纯净的扩增子产物。

本发明的一种急性髓系白血病中基因突变的检测试剂盒及应用，通过在同一pcr反应体系里加上多对引物，各对引物分别结合在模板的相应位置，同时扩增出多个核酸片段，再通过pcr反应将高通量测序所用的接头序列(index)引入到核酸片段的两侧，最终得到核酸文库进行高通量测序和生信流程分析来获取目标区域的序列信息，特异性强、实验周期短及dna低起始量等优势，可用于血液、口腔拭子及ffpe等多种复杂样本。利用多重pcr靶向高通量测序技术高准确率、高覆盖度、高检出率筛查aml中基因变异情况，给出准确、权威的医学解读报告，为aml患者的疾病诊断、预后分层和靶向治疗提供指导。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明中多重pcr靶向测序检测技术原理图；

图2是本发明中多重pcr检测技术的文库检测结果图；

图3是本发明所涉及的突变位点一代测序验证峰图，具体的基因位点为：npm1(nm_001355006)c.863_864instctgp.w288fs*12(杂合)；

图4是本发明急性髓系白血病中基因突变的检测试剂盒的应用的流程示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

第一方面，本发明提供一种急性髓系白血病中基因突变的检测试剂盒，包括23个基因的引物工作液、多重pcr试剂、无水乙醇、纯化磁珠和nuclease-freewater，所述多重pcr试剂包括多重扩增体系中的pcr混合液、pcr反应液、消化液、接头p5和接头p7，所述pcr混合液包括tris-hcl、10×buffer、4种dntp混合物、ph为8.3的mgcl2，所述pcr反应液包括taqdna聚合酶，所述消化液包括虾碱酶和外切酶。23个基因为：asxl1、bcor、cebpa、dnmt3a、ezh2、flt3、idh1、idh2、kit、kmt2a、kras、npm1、nras、phf6、runx1、sf3b1、srsf2、stag2、tet2、tp53、u2af1、wt1、zrsr2。所述23个基因的引物工作液的浓度为4.0～6.0pmol/ul，所述无水乙醇为500ml，所述纯化磁珠为60ml，所述nuclease-freewater为5ml。所述tris-hcl为100mm，所述taqdna聚合酶为3000u/ml，所述虾碱酶和外切酶为5000u/ml。所述接头p5为通用型引物序列；所述接头p7为识别样本的碱基序列。所述多重pcr试剂为96人份。

本发明针对现有基因突变检测技术中存在的缺点，基于最新版who2016版指南、nccn2019版指南、血液肿瘤中国专家共识以及血液肿瘤相关基因数据库，设计了用于检测急性髓系白血病(aml)23种基因多个外显子的引物序列。此应用具有高准确性、高灵敏度及高通量的优势，能快速高效对23种急性髓系白血病(aml)基因进行标准化的定量检测。

本发明基于2016年版更新的who血液肿瘤分类标准、nccn2019版指南、2018年血液肿瘤中国专家共识及相关权威文献整理出与急性髓系白血病(aml)相关的23种基因，并在数据库genbank中对23种基因进行序列对比分析设计了多重引物。本发明涉及急性髓系白血病(aml)相关的23种基因经典转录本如下：asxl1(nm_015338.5)、bcor(nm_017745.5)、cebpa(nm_004364.4)、dnmt3a(nm_022552.4)、ezh2(nm_004456.4)、flt3(nm_004119.2)、idh1(nm_005896.3)、idh2(nm_002168.3)、kit(nm_000222.2)、kmt2a(nm_001197104.1)、kras(nm_033360.3)、npm1(nm_001355006.1)、nras(nm_002524.4)、phf6(nm_032458.2)、runx1(nm_001754.4)、sf3b1(nm_012433.2)、srsf2(nm_001195427.1)、stag2(nm_001042749.2)、tet2(nm_001127208.2)、tp53(nm_000546.5)、u2af1(nm_006758.2)、wt1(nm_024426.4)、zrsr2(nm_005089.3)。所设计的引物tm值在60±2℃，对所设计的引物进行优化测试后合理的分配到试管中，保证引物的特异性以及扩增片段的均一性，降低非目的片段的比例。

基于上述引物设计原则，本发明设计的与急性髓系白血病(aml)相关的23种基因外显子，尤其重点关注以下热点区域的变异情况，相应的的扩增子如下：

基于上述热点扩增子区域，本发明试剂盒重点关注的热点突变位点有76个，所述的76个热点突变及23个基因的对应关系如下表所示：

根据以上基因外显子设计扩增子引物，由于选用的是高通量测序illumina平台的novaseq6000进行测序，采用的测序策略为pe150，故目标区域大小均约为300bp的核苷酸片段。

基于引物设计原则，利用相关引物设计软件本发明设计了与急性髓系白血病(aml)相关的23种基因外显子引物，相应的的引物序列如下：

本发明中影响多重pcr引物的关键因素有以下几方面：

特异性：特异性若处理不当，可能会导致非目标片段的扩增，严重可影响目标片段扩增失败。一个反应体系里面，引物数量越多，发生非特异扩增的可能性越大。而多重pcr实验中过程中需要确保的是，只有目标片段发生扩增，其它核苷酸片段的不要扩增。

二聚体：扩增过程中二聚体的产生会抑制引物扩增目标片段，导致目标片段扩增产量减少甚至扩增失败。在同一反应体系里，引物数量越多，出现二聚体的概率也就越大。

均一性：即体现的是引物性质均一情况，除以上因素外，多重pcr体系需要尽量保证引物性质均一，在同一个体系下，所有的引物都具有相同或者相似的热力学稳定性等。

因此，为了保证反应体系中的引物都能在同一个反应环境下有效扩增进行了多轮测试调整，最终形成本发明。

本发明试剂盒进行多重pcr靶向测序的时候，会同时做nuclease-freewater的阴性对照，保证实验过程不被污染，确保数据结果的准确可靠。

本发明试剂盒检测使用illumia平台的novaseq6000仪器上运行，而一代测序的对比验证实验使用的仪器是abi3730xl，以上两种检测技术的pcr反应均在bio-radt100上运行。

第二方面，本发明提供一种急性髓系白血病中基因突变的检测试剂盒的应用，请参阅图4，所述急性髓系白血病中基因突变的检测试剂盒的应用可以包括以下步骤：

s101、利用dna提取试剂盒对待测样本进行抽提dna；

本发明实施例中，图2是本发明中多重pcr检测技术的文库检测结果图；图3是本发明所涉及的突变位点一代测序验证峰图，具体的基因位点为：npm1(nm_001355006)c.863_864instctgp.w288fs*12(杂合)；利用dna提取试剂盒对待测样本进行抽提dna，通过质检确保dna浓度达10ng/ul以上，电泳条带无明显拖尾以确保dna的完整性。

s102、利用检测试剂盒对抽提的dna进行多重pcr反应，得到多个目标核苷酸的扩增子产物；

本发明实施例中，图1是本发明中多重pcr靶向测序检测技术原理图；将25ng的dna、5ul的pcr混合液、1ul的pcr反应液、1ul的上游引物和1ul下游引物，用nuclease-freewater补足体系至10ul，通过运行pcr程序预变性95℃15min，再进行95℃30s，60℃90s，72℃90s共24个循环，72℃10min，4℃暂存，所有扩增子引物中上游5’端均带上一段相同的通用序列t1；下游引物的5’端均带上另外一种相同的通用序列t2。t1序列通常为p5接头序列3’端的一部分；t2序列为p7接头序列3’端的一部分。故通过本轮多重pcr反应，不仅得到多个目标核苷酸的扩增子产物，同时将通用序列t1和t2分别成功引入到扩增子产物的两侧，为后续pcr反应引入完整的接头序列做好准备，即第1轮多重pcr反应。

s103、对多个目标核苷酸的扩增子产物进行纯化，得到纯净的扩增子产物；

本发明实施例中，pcr反应过程中除了会产生扩增子产物还会有残存的少量酶、引物、dntp、盐离子、副产物等多种杂质，加入消化液，pcr仪上运行程序37℃30min，80℃10min，可以去除部分扩增杂质，但是消化液不能够完全去除扩增引起的双链副产物，加入纯化磁珠结合目标片段回收扩增子产物，洗涤去除反应中的其他成分质，得到纯净的扩增子产物，即第1轮磁珠纯化。

s104、以纯化后的扩增子产物作为模板，加入接头p5、接头p7、pcr混合液、pcr反应液进行pcr反应，得到新的扩增子文库；

本发明实施例中，将纯化后的扩增子产物作为模板，加入高通量测序所需的接头引物p5和p7，p5为通用性接头，p7为识别样本的一段特殊序列，通过加入pcr混合液以及pcr反应液进行pcr反应。p5和p7接头引物分别与扩增子产物两侧t1序列和t2序列互补配对。因此本轮pcr反应结束后，接头序列p5和p7分别被引入到扩增子产物的两侧，得到新的扩增子文库，即第2轮接头序列pcr反应。

s105、加入纯化磁珠结合目标片段回收扩增子产物，洗涤去除反应杂质，得到纯净的扩增子文库；

本发明实施例中，通过磁珠结合目标片段来回收扩增子产物，洗涤去除反应中的其他成分，得到纯净的扩增子文库，即第2轮磁珠纯化，经过对文库定量和质检后，便可以上机测序，即浓度测量与质检。

s106、对纯净的扩增子文库进行高通量测序和生信流程分析获取目标区域的序列信息，得出基因突变结果。

实施案例：本发明所述的试剂盒通过18例临床样本来特异性检测aml中23种基因突变。

对18例(编号a1～a18)初诊、难治及复发的髓系白血患者样本进行了筛查检测，严格执行上述流程，运用自建的生信流程进行分析以及专业遗传咨询解读人员进行解读，同时对这18例白血病患者样本进行了一代测序(sanger)的验证，目前一代测序(sanger)还是作为基因突变检测的金标准，采用两种方法检测的结果对比如下：

编号a1～a9的患者多重pcr检测方法结果汇总表(一)

编号a10～a18的患者多重pcr检测方法结果汇总表(二)

编号a1～a9的患者一代检测方法结果汇总表(一)

编号a10～a18的患者一代测序检测方法结果汇总表(二)

18例(编号a1～a18)初诊、难治及复发的急性髓系白血患者用多重pcr靶向测序检测23个基因阳性率如下表所示：

多重pcr靶向测序检测23个基因阳性率

18例(编号a1～a18)初诊、难治及复发的急性髓系白血患者用一代测序检测23个基因阳性率如下表所示：

一代测序检测23个基因阳性率

通过两种检测方法的结果汇总比较，采用多重pcr靶向检测技术具有更高的检出率，一代测序因受灵敏度(10％～15％)及方法学的限制，低于10％～15％的基因变异情况直接判读为阴性，并且所检出样本的结果无法对基因突变负荷率进行定量，多重pcr灵敏度可达1％以上，对所有检出的基因突变均能给出定量结果。

本实施案例检测到的部分重要突变基因，经过cosmic数据库、clinvar数据库、nccn指南及血液肿瘤国内专家共识等的医学解读，具体的临床意义如下所示：

asxl1的突变可见于cmml、mpn、mds、aml等多种髓系肿瘤。2019年nccn《急性髓细胞白血病临床实践指南》中指出aml患者中asxl1突变提示预后不良。

bcor的突变主要见于mds、aml中。2019年nccn《骨髓增生异常综合征临床实践指南》中指出bcor基因的无义突变、移码突变、剪接突变和密码子n1425的非同义突变，在mds患者中的突变率为小于5％。与预后不良相关。

cebpa的突变主要见于aml中，在aml患者中的突变率约为7％-11％，在nk-aml患者中的突变率为13％-15％，主要见于m1、m2和部分m4型患者。2019年nccn《急性髓细胞白血病临床实践指南》中指出，在正常核型aml患者中单独伴cebpa双等位基因突变提示预后良好。伴cebpa单等位基因突变较cebpa双等位基因突变预后差。且cebpa胚系突变与髓系肿瘤易感相关。

dnmt3a基因突变可以出现在aml、mds及其他恶性血液肿瘤患者中。在aml患者中的突变率可达18％-22％，在nk-aml患者中的突变率为29％-34％，以m5型居多。其热点突变时发生于编码第882位精氨酸的错义变异，此变异在aml患者中会合并npm1和flt3突变。r882h突变导致。在染色体核型中危的aml和mds患者中，或eln高危组aml患者中，dnmt3a突变是预后更差的因素。dnmt3a突变对预后的影响与突变位点有关，r882突变aml患者治疗效果差，完全缓解率低，预后不良，其它突变对预后影响余突变位点有关。

flt3基因突变在血液疾病中研究较多，在多种髓系肿瘤中都有发生，在all中约占1％。mds中约占5-10％，aml中约占15-35％。最常见的突变就是itd(内部串联重复)和tkd(活化环中的点突变),两种突变均可活化酪氨酸激酶。flt3-itd在aml患者中的突变率为20％，在nk-aml患者中的突变率可高达28％-34％。flt3-itd提示aml预后不良，且插入序列越长预后越差，双等位基因突变预后更差，突变比例越高预后越差。flt3-tkd见于约7％的aml，多见于apl和cbfb-myh11阳性的aml患者，主要的突变位点有d835、r834、i836、d839、y842等。

idh1突变主要见于aml、all及mpn中。idh1在aml患者中的突变率约为6％-9％，在nk-aml中的发生率高达8％-16％，r132是idh1在aml中最常见的突变。

idh2突变主要见于染色体核型正常的aml，也见于mds、mpn和mds/mpn急变期。idh2在aml患者中的突变率约为8％-12％，在nk-aml中的发生率高达19％，集中发生于r140和r172位点。

kit基因突变可见于多种类型的肿瘤，在血液系统肿瘤中主要见于aml、肥大细胞增多症和nk/t细胞淋巴瘤中。其在染色体t(8；21)(q22；q22)或inv(16)(p13.1q22)异常为特征的cbf-aml患者中的突变率约为20％。kit突变常发生于exon8、11、17，kitd816v位点突变是cbf-aml预后不良指标，突变患者无病生存期短。该突变位点对伊马替尼耐药，对达沙替尼有效。

npm1突变主要见于原发性aml中，在aml患者中其发生率为28％-35％，在nk-aml患者中的突变率可高达48％-53％。npm1突变常见于12号外显子，以6种变异体为主(命名为mutationa-f)。其中最常见的是a型，占75％-80％。npm1突变单独出现常是预后好的指标，并且常见的突变型可作为mrd监测的标志。

nras基因突变可见于aml、all、mds、jmml、cmml等多种髓系和淋系血液肿瘤中。在aml中报道ras突变的患者对高剂量阿糖胞苷反应较好，总生存期和无疾病进展期延长。nras胚系突变可导致常染色显性遗传的noonan综合征，对髓系肿瘤易感。

tet2基因突变见于多种髓系肿瘤，此外在部分健康老年个体或非恶性血液肿瘤患者(如aa)中存在tet2克隆性造血。在2019年nccn《急性髓细胞白血病临床实践指南》中指出tet2基因突变可作为评估aml预后的备选基因。正常核型或中低危核型aml中tet2突变提示预后不良。在临床研究中报道去甲基化药物(如地西他滨、阿扎胞苷)治疗有效。

因此，采用多重pcr靶向测序技术检测能弥补一代测序的缺陷，可为临床提供经济快速的、高灵敏度的、高特异性的基因突变检测，具有广泛的临床应用价值。

以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。