一种RhD血型基因RHD993C>T等位基因及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种rhd血型基因rhd993c>t等位基因及应用。

背景技术：

rh血型是人类红细胞血型系统中最为复杂、最具多态性的系统，也是引起临床输血反应和严重新生儿溶血病的主要红细胞血型。目前已发现50多种rh血型抗原，其中rhd抗原具有很强的免疫原性，是由rhd基因编码产生，是血型研究的重点。临床上根据红细胞膜表面是否检测到d抗原，将rh血型抗原分为rhd阳性和rhd阴性两大类。

目前，rh血型d抗原的常规检测方法是采用血清学盐水法和间接抗人球蛋白试验以及吸收放散试验进行鉴定。但是血清学技术存在一定的局限性。由于疾病或其他因素的影响，某些个体的红细胞在血清学定型时结果难以判定；慢性长期输血患者血清学结果有时呈现“混合视野”的现象；当无法获得样本的红细胞或红细胞样本不足时，像胎儿血型鉴定、法医鉴定遗留物等，血清学检测也不能获得正确结果。

用免疫血清学的方法对rhd血型的检测主要依赖于抗-d抗体的特异性和抗原表达量。目前随着分子生物技术的发展，rhd突变体逐年增加，其抗原表达量和基因突变位点各有差异。这些基因突变体的检测主要通过分子生物学方法确定rh血型d抗原基因型，不仅在弥补血清学技术的不足上具有重要的临床实用意义，而且还具有广泛的科研应用价值。本研究小组最近发现了1例rhd血型rhd993c>t等位基因，并针对新发现的rhd993c>t等位基因建立了相应的检测方法。

技术实现要素：

发明目的：本发明的一种rhd血型基因rhd993c>t等位基因及应用在于提供一种rhd血型基因rhd993c>t等位基因及其检测方法，通过检测rhd993c>t等位基因进行rh血型基因型分析。

技术方案：一种rhd血型基因rhd993c>t等位基因，野生型rhd基因序列如seqidno:1所示，突变型rhd基因序列如seqidno:2所示；相比野生型rhd基因序列，突变型rhd基因具有g.25306649c>t位点突变，即野生型rhd基因序列的第281位碱基c突变为t。

一种用于检测rhd993c>t等位基因的特异性引物，所述特异性引物的上游序列如seqidno:1所示，所述特异性引物的下游序列如seqidno:1所示。

本发明的有益效果如下所述：本发明的一种rhd血型基因rhd993c>t等位基因及应用，采用分子生物学方法进行基因水平的检测，可以高灵敏且高精度检测掺杂于基因库中突变基因的有无。由于不同民族间存在rhd基因的差异，在相关研究的基础上，根据中国人的rhd基因分子背景，专门针对新发现的rhd993c>t等位基因进行设计。本发明不仅在弥补血清学技术的不足上具有重要的临床实用意义，而且还具有广泛的科研应用价值。

附图说明

附图1为实施例中rhd993c>t等位基因检测凝胶电泳图；

附图2为实施例中rhd993c>t等位基因突变的测序图。

具体实施方式

下面结合附图1至2对本发明作更进一步的说明。

本发明的一种rhd血型基因rhd993c>t等位基因位点g.25306649c>t突变。该突变发生于第1号染色体的25306649位置，该基因在ncbl参考数据库grch38.p13中的编号为nc_000001.11(25272393-25330445)。这里列出在该数据库中包含有本位点野生型的部分碱基序列供参考，如seqidno：1所示，其突变位点在seqidno:1序列的第281位由碱基c突变为t。rhd基因突变的相对应序列如seqidno：2所示。

seqidno:1

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seqidno:2

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所述rhd血型基因rhd993c>t等位基因的检测方法，通过基因扩增对包含突变基因的目标部位进行选择性地扩增，以此检测该突变基因的有无。所述检测方法如下：

(1)提取待检样本中dna；

(2)以该dna为模板，以针对rhd993c>t突变基因附近的编码区设计的pcr引物进行pcr反应，得到pcr反应产物；

(3)测出pcr反应产物的核苷酸序列组成；

(4)将核苷酸序列与rhd野生型基因的序列进行比较，确定是否有993c→t突变。所述pcr反应产物的核苷酸序列组成可以将pcr反应产物通过测序仪进行测序。

所述rhd血型基因rhd993c>t等位基因的检测。具体步骤如下：

(1)引物设计：根据美国国家生物信息中心(ncbi)genbank记录的rhd基因(序列号：nc_000001.11)，通过oligo6.0引物软件设计引物，最终确定1对特异性寡核苷酸引物序列,上游引物序列如表1中seqidno:3所示；下游引物序列如seqidno:4所示，扩增产物片段长度为176bp。

表1.rhd993c>t等位基因检测引物序列及反应特异性

注：*寡核苷酸引物序列所涉及的外显子碱基序列的位置是指由atg起始编码子开始的10个外显子整个排列顺序；所涉及的内含子碱基序列的位置是指每个内含子单个排列顺序。

(2)rhd993c>t等位基因增扩：反应体系总体积50μl；其中含pcr5×缓冲液10μl，dna模板5.0μl，1u/μl的taq聚合酶1.0μl，mgcl2终浓度为2.0mmol/l，dntp终浓度为200nmol/l，特异性正向引物和反向引物的终浓度均为200nmol/l；加消毒双蒸水至反应体系总体积50μl；将上述反应体系在pcr仪中反应。反应条件：95℃预变性5min，然后依次94℃变性30s，接着62℃退火40s，72℃延伸1min，共35个循环；

(3)rhd993c>t等位基因检测：用琼脂糖凝胶对将步骤(2)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。

dna模板的制备方法：

采用购置的试剂盒提取全血基因组dna，具体步骤如下：

(1)取无菌2.0ml离心管一只，加入1ml细胞裂解液；

(2)轻轻震荡然经edta抗凝的全血样本，直到彻底混匀；然后吸取500μl血样加入上述含有细胞裂解液的离心管中，轻轻倾倒离心管5-6次混匀；

(3)室温孵育10分钟(期间颠倒离心管2-3次混匀)；

(4)12000rpm室温离心5分钟；

(5)用移液器缓慢的尽可能将上清液移弃干净，注意勿将两相交界处的白色物质吸出；

(6)使用涡旋振荡器(votex)剧烈混匀，直至白细胞重悬(10-15秒)；

(7)向重悬细胞溶液中加入核裂解液300μl。用移液枪头吸放溶液5-6次裂解白细胞；此时溶液应变得很粘稠。若混合后可见细胞团块，则将溶液置于37℃孵育直至团块消散；若孵育1小时后仍可见细胞团块，则另加核裂解液100μl并重复置于37℃孵育；

(8)向核裂解物中加入蛋白沉淀液100μl，用涡旋振荡器剧烈震荡10-20秒；

(9)12000rpm室温离心5分钟；

(10)将其上清液转至对应编号的已加入300μl室温异丙醇的2.0ml离心管中；

(11)轻轻颠倒以混匀溶液，直至白色线状dna形成沉淀；

(12)12000rpm室温离心1分钟；

(13)弃去上清液，加入与样本量等体积的室温70％乙醇，轻轻颠倒离心管数次；

(14)用移液器缓慢的尽可能将乙醇液移弃干净。将离心管置于50℃烘烤5-10分钟，尽量让残余的乙醇液挥发干净；

(15)向离心管中加入50-100μl的dna溶解液，轻轻混匀；

(16)用1％琼脂糖凝胶电泳来评估dna提取效果，nanodrop核酸仪检测含量，定量到20ng/μl，-20℃保存。

rhd993c>t等位基因检测技术方案具体步骤如下：

仪器：veriti96型pcr仪、bio-radgeldocxr+型凝胶成像仪(美国伯乐公司)、凝胶电泳仪(北京六一公司)。

试剂：qiaampdna提取试剂盒(德国qiagen公司)；dnaisolationkit提取试剂盒(北京pelfreez公司)；pcr缓冲液、dntp、taq酶(美国abi公司)；引物和探针由上海生工生物有限公司合成。

(1)rhd993c>t等位基因增扩：反应总体积：50μl，含pcr5×缓冲液10μl，dna模板5.0μl，taq聚合酶(1u/μl)1.0μl，mgcl2终浓度2.0mmol/l，dntp终浓度200nmol/l，以及特异性上、下引物终浓度200nmol/l，并加消毒双蒸水至总体积50μl。反应条件：95℃预变性5分钟，然后依次94℃变性30秒，接着62℃退火40秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；

(2)rhd993c>t等位基因检测：用1.5％琼脂糖凝胶对将步骤(1)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。通过凝胶成像仪观察结果并拍照，pcr产物经电泳后显示为单一条带，无杂带，则提示pcr产物单一，无非特异扩增。若条带位置位于适当大小的位置，则为目的片段。如图1所示，m：50bp梯度分子量标记物，1：空白对照，2：野生型对照，3：rhd993c>t突变型样本。

(3)扩增产物纯化：本研究采用takara公司的agarosegeldnapurificationkit试剂盒，将琼脂糖凝胶电泳后的pcr产物进行纯化回收，准备测序。

(4)sanger测序与结果判断：纯化后pcr产物在abi3730型全自动dna测序仪上进行测序。将测序结果与rhd野生型参考序列(ncbireferencesequence:nc_000001.11)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。检测所得基因突变图如图2所示，图中箭头所示为rhd基因显示g.25306649c>t突变。

序列表

<110>无锡市第五人民医院

<120>一种rhd血型基因rhd993c>t等位基因及应用

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