一种乳腺癌相关基因PIK3CA位点g.179220986A＞T突变体及其应用的制作方法

本发明涉及一种医学生物技术，尤其涉及一种乳腺癌相关基因pik3ca位点g.179220986a＞t突变体及其应用。

背景技术：

乳腺癌是全世界妇女目前面临的最为常见的恶性肿瘤，也是引起女性死亡的重要病因。自90年代以来，中国的乳腺癌发病率增长速度是全球的2倍多，每年中国乳腺癌新发数量和死亡数量分别占全世界的12.2％和9.6％。目前，乳腺癌是中国女性发病率最高的癌症，癌症死亡原因位居第六，且年轻化趋势显著。虽然早期检查及诊断技术的提高，手术及综合辅助治疗的进步，使得患者的预后有较明显改善，但是总生存率并不理想。对于特定的分子亚型，由于对药物的原发或继发耐药、甚至缺乏特定的治疗靶点，使得部分中晚期病人缺乏有效的治疗手段。因此，寻找发生有效的肿瘤标志物对于提高乳腺癌的诊断和预测发生、发展及改善预后具有重要的临床指导意义。

肿瘤标志物可以有效地作为临床诊断依据，可以监听高位人群、早期诊断、指导治疗、判断治疗疗效、检测复发及转移，是肿瘤患者的重要检查指标。乳腺癌是一种全身性疾病、其发生和发展是一个涉及多因素、多环节的复杂过程，包括癌基因的激活以及抑癌基因的失活等。因此，基因突变在乳腺癌的发生、发展过程中起着非常重要的作用。pik3ca基因是近年来被发现除p53突变和her-2扩增之外最常见和最重要的乳腺癌中的突变基因，突变比率高达40％，其突变可导致多条信号通路在不同水平发生调控异常，从而促进肿瘤细胞的增殖和存活。

磷脂酰肌醇-3-激酶(pi3k)是一种可使肌醇环第三位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，具有磷脂酰肌醇激酶和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶双重活性，调节细胞增殖、存活、迁移、凋亡和细胞周期等多种生物学功能。pik3ca基因编码ⅰ类pi3k催化亚单位p110α，其定位于3q26.3，包含21个外显子，编码1068个氨基酸。现有研究显示，应用pcr或基因测序的方法检测组织中pik3ca基因的突变情况，可提高肿瘤诊断的敏感性；pik3ca基因突变的肿瘤细胞对pi3k抑制剂更敏感，特异性地针对pik3ca突变的靶向治疗可有效降低恶性肿瘤的发病率和死亡率。尽管pik3ca突变对乳腺癌的诊治及预后的影响还需进一步研究，但从目前已有的研究数据可以看出pik3ca高频突变和突变热点区域的发现对于乳腺癌基因诊断以及靶向治疗的选择具有重要的临床意义。

技术实现要素：

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种乳腺癌相关基因pik3ca位点g.179220986a＞t突变体、检测该突变体的特异性引物以及含有特异性引物的试剂盒，以便快速方便地辅助判断乳腺癌。

技术方案：为实现上述目的，本发明的一种乳腺癌相关基因pik3ca位点g.179220986a＞t突变体，其野生型pik3ca基因序列如seqidno:1所示，其突变型pik3ca基因序列如seqidno:2所示；突变型pik3ca基因序列与野生型pik3ca基因序列具有g.179220986a＞t位点突变。

进一步地，用于检测乳腺癌相关基因pik3ca位点g.179220986a＞t突变体的特异性引物，其上游引物的序列如为seqidno:3所示，下游引物的序列如seqidno:4所示，用于检测pik3ca基因位点g.179220986a＞t突变；所述pik3ca基因位点g.179220986a＞t突变是指突变位点在seqidno:1序列的第113位碱基a突变为t。

进一步地，一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，包括用于检测基因pik3ca位点g.179220986a＞t突变体的特异性引物。

有益效果：本发明的一种乳腺癌相关基因pik3ca位点g.179220986a＞t突变体、检测该突变体的特异性引物以及含有特异性引物的试剂盒，不仅使乳腺癌的诊断更加方便易实施，便于临床医生及时精准掌握患者病情，而且可作为临床治疗效果的评价标准，并为发现有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供理论支持。

附图说明

附图1为基因pik3ca位点g.179220986a＞t突变体的检测凝胶电泳图；

附图2为基因pik3ca位点g.179220986a＞t突变体的基因测序图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

通过研究乳腺癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血dna中的突变，寻找与乳腺癌相关的高特异性的突变位点，为乳腺癌的筛查和诊断提供支持。具体是通过下列技术方案实现的：

如附图1和附图2所示的一种乳腺癌相关基因pik3ca位点g.179220986a＞t突变体，即pik3ca-k672n突变体，其野生型pik3ca基因序列如seqidno:1所示，其突变型pik3ca基因序列如seqidno:2所示；突变型pik3ca基因序列与野生型pik3ca基因序列具有g.179220986a＞t位点突变。

用于上述pik3ca基因的突变位点的特异性引物，进行pcr扩增，检测pik3ca基因有无该突变产物片段；并且采用sanger测序方法检测有无该位点碱基突变，其中pcr扩增引物的上游引物序列如为seqidno:3所示，下游引物序列如seqidno:4所示，用于检测pik3ca基因位点g.179220986a＞t突变；所述pik3ca基因位点g.179220986a＞t突变是指突变位点在seqidno:1序列的第113位碱基a突变为t。

基因pik3ca-k672n突变体的突变发生于第3号染色体的179220986位置。该基因在ncbl参考数据库grch38.p13中的编号为nc_000003.12(179148114～179240093)。这里列出在该数据库中基因序列包含有本位点野生型的部分碱基序列如seqidno:1所示，pik3ca基因突变相对应的序列如seqidno:2所示，其中突变位点在seqidno:1序列的第113位由碱基a突变为t。所述pik3ca基因编码序列野生型氨基酸序列如seqidno：5所示，其中氨基酸改变在seqidno：6序列中第672位由赖氨酸(k)转变为天冬酰胺(n)。

seqidno:1

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seqidno:2

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seqidno:5

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seqidno:6

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基因pik3ca位点g.179220986a>t突变体的检测方法，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位进行针对性扩增，由此检测该突变基因的有无。所述检测方法如下：

(1)提取待检样本中dna；

(2)以该dna为模板，针对pik3ca基因g.179220986a>t突变体区域的dna序列设计的pcr引物进行pcr反应，得到pcr反应产物；

(3)测出pcr反应产物的核苷酸序列组成；

(4)将核苷酸序列与pik3ca野生型基因的序列进行比较，确定是否有pik3ca位点g.179220986a>t突变。所述pcr反应产物的核苷酸序列组成可以将pcr反应产物通过测序仪进行测序。

基因pik3ca位点g.179220986a>t突变体的检测，具体步骤如下：

(1)引物设计：根据美国国家生物信息中心(ncbi)genbank记录的pik3ca基因(序列号：nc_000003.12)，通过oligo6.0引物软件设计引物，最终确定1对特异性寡核苷酸引物序列，上游引物序列如表1中seqidno:3所示；下游引物序列如seqidno:4所示，扩增产物片段长度为209bp。

表1.相关突变位点寡核苷酸引物序列

注：*f＝正向引物序列；r＝反向引物序列

(2)pik3ca基因g.179220986a>t突变体的增扩：反应体系总体积50μl；其中含pcr5×缓冲液10μl，dna模板5.0μl，1u/μl的taq聚合酶1.0μl，mgcl2终浓度为2.0mmol/l，dntp终浓度为200nmol/l，特异性正向引物和反向引物的终浓度均为200nmol/l；加消毒双蒸水至反应体系总体积50μl；将上述反应体系在pcr仪中反应，反应条件：95℃预变性5min，然后依次94℃变性30s，接着60℃退火40s，72℃延伸40s，共32个循环；

(3)pik3ca基因g.179220986a>t突变体的检测：用琼脂糖凝胶对将步骤(2)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。

dna模板的制备：

采用购置的试剂盒提取全血基因组dna，具体步骤如下：

(1)取无菌2.0ml离心管一只，加入1ml细胞裂解液。

(2)轻轻震荡然经edta抗凝的全血样本，直到彻底混匀；然后吸取500μl血样加入上述含有细胞裂解液的离心管中，轻轻倾倒离心管5～6次混匀。

(3)室温孵育10分钟(期间颠倒离心管2～3次混匀)。

(4)12000rpm室温离心5分钟。

(5)用移液器缓慢的尽可能将上清液移弃干净，注意勿将两相交界处的白色物质吸出。

(6)使用涡旋振荡器(votex)剧烈混匀，直至白细胞重悬(10～15秒)。

(7)向重悬细胞溶液中加入核裂解液300μl。用移液枪头吸放溶液5～6次裂解白细胞。此时溶液应变得很粘稠。若混合后可见细胞团块，则将溶液置于37℃孵育直至团块消散。若孵育1小时后仍可见细胞团块，则另加核裂解液100μl并重复置于37℃孵育。

(8)向核裂解物中加入蛋白沉淀液100μl，用涡旋振荡器剧烈震荡10～20秒。

(9)12000rpm室温离心5分钟。

(10)将其上清液转至对应编号的已加入300μl室温异丙醇的2.0ml离心管中。

(11)轻轻颠倒以混匀溶液，直至白色线状dna形成沉淀。

(12)12000rpm室温离心1分钟。

(13)弃去上清液，加入与样本量等体积的室温70％乙醇，轻轻颠倒离心管数次。

(14)用移液器缓慢的尽可能将乙醇液移弃干净。将离心管置于50℃烘烤5～10分钟，尽量让残余的乙醇液挥发干净。

(15)向离心管中加入50～100μl的dna溶解液，轻轻混匀。

(16)用1％琼脂糖凝胶电泳来评估dna提取效果，nanodrop核酸仪检测含量，定量到20～50ng/μl，-20℃保存。

pik3ca基因g.179220986a>t突变基因检测技术方案：

仪器：veriti96型pcr仪、bio-radgeldocxr+型凝胶成像仪(美国伯乐公司)、凝胶电泳仪(北京六一公司)。

试剂：qiaampdna提取试剂盒(德国qiagen公司)；dnaisolationkit提取试剂盒(北京pelfreez公司)；pcr缓冲液、dntp、taq酶(美国abi公司)；引物由上海生工生物有限公司合成。

(1)pik3ca基因g.179220986a>t突变体的扩增：反应总体积：50μl，含pcr5×缓冲液10μl，dna模板5.0μl，taq聚合酶(1u/μl)1.0μl，mgcl2终浓度2.0mmol/l，dntp终浓度200nmol/l，以及特异性上、下引物终浓度200nmol/l，并加消毒双蒸水至总体积50μl。

反应条件：95℃预变性5分钟，然后依次94℃变性30秒，接着60℃退火40秒，72℃延伸40秒，共32个循环。

(2)pik3ca基因g.179220986a>t突变基因检测：用1.5％琼脂糖凝胶对将步骤(1)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。通过凝胶成像仪观察结果并拍照，pcr产物经电泳后显示为单一条带，无杂带，则提示pcr产物单一，无非特异扩增。若条带位置位于适当大小的位置，则为目的片段。如图1所示，m：50bp梯度分子量标记物，1：空白对照，2：野生型对照，3：pik3ca基因g.179220986a>t突变样本。

(3)扩增产物纯化：本研究采用takara公司的agarosegeldnapurificationkit试剂盒，将琼脂糖凝胶电泳后的pcr产物进行纯化回收，准备测序。

(4)sanger测序与结果判断：纯化后的pcr产物在abi3730型全自动dna测序仪上进行测序。将测序结果与pik3ca野生型参考序列(ncbireferencesequence:nc_000003.12)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。检测所得基因突变如图2所示，图中箭头所示为pik3ca基因g.179220986a>t突变。

该突变位点为本研究首次在中国汉族女性乳腺癌患者中发现，该突变位点在乳腺癌筛查和基因诊断中具有潜在的应用前景。通过突变位点序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>无锡市第五人民医院

<120>一种乳腺癌相关基因pik3ca位点g.179220986a＞t突变体及其应用

<130>6

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

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<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

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<211>686

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