1.一种烯醇还原酶突变体,其特征在于所述烯醇还原酶突变体是将seqidno.3所示氨基酸序列中第296位丝氨酸突变为苯丙氨酸,同时将第116位色氨酸突变为甘氨酸获得的。
2.一种权利要求1所述烯醇还原酶突变体编码基因,其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为seqidno.4所示。
3.一种含权利要求2所述烯醇还原酶突变体编码基因的重组载体。
4.一种权利要求3所述重组载体构建的重组基因工程菌。
5.一种权利要求1所述烯醇还原酶突变体在催化柠檬醛制备(r)-香茅醛中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述应用为:将含烯醇还原酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎,取破碎混合液分离纯化,获得纯酶液,以纯酶液为催化剂,加入底物和辅酶nadp+,以d-葡萄糖为辅助底物,以葡萄糖脱氢酶为辅助酶,以ph7.0、50mmpipes缓冲液为反应介质构成反应体系,在30℃、300rpm条件下反应,反应完全后,反应液用乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯层分离纯化,获得(r)-香茅醛;所述底物为(e)-柠檬醛、(z)-柠檬醛或(e/z)-柠檬醛,所述底物以200mm底物异丙醇溶液的形式加入。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述反应体系中,催化剂用量以纯酶计0.96u/ml,所述底物终浓度为20mm,d-葡萄糖终浓度为50mm,nadp+终浓度为0.6mm,葡萄糖脱氢酶用量为0.96u/ml。
8.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述湿菌体按如下方法制备:将含烯醇还原酶突变体编码基因的工程菌接种至含100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中,37℃培养12h,获得种子液,将种子液以体积浓度2%的接种量接种至新鲜的含100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中,37℃培养至od600为0.5~0.7,再加入终浓度为0.2mm的iptg,25℃诱导12h,获得诱导培养液,再将诱导培养液于4℃和10000rpm下离心10min,弃去上清液,收集湿菌体。
9.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述纯酶液按如下方法制备:将湿菌体以1g:20ml的比例加入ph8.0、50mm的tris-hcl缓冲液中,在125w、工作2s、间隔6s的条件下超声破碎15min,离心,取上清即为粗酶液;将粗酶液加入ni2+柱中,上样完成后,依次用含5mm、40mm、100mm、250mm咪唑的洗脱液洗脱,收集含100mm咪唑的洗脱液对应的流出液,并用截留分子量为10kda的超滤管在4℃和5000rpm下离心30min进行脱盐浓缩,取截留液即得到纯酶液;所述洗脱液组成:相应浓度的咪唑、300mm氯化钠,溶剂为50mm的tris-hcl缓冲液,ph8.0。
10.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述葡萄糖脱氢酶是将含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养的湿菌体超声破碎,破碎液分离纯化得到的纯酶液,所述葡萄糖脱氢酶基因核苷酸序列为seqidno.6所示。