一种快速检测创面病原菌的微流控芯片试剂盒的制作方法

本发明涉及医药生物
技术领域：
，特别涉及基因检测
技术领域：
；具体涉及一种能够快速检测创面常见致病菌的微流控芯片快速检测方法。
背景技术：
：急慢性创面因皮肤屏障的破坏加上局部血运障碍、变性坏死覆盖、蛋白渗出等给予细菌提供了良好的生存环境，有利于机会致病菌的侵入和繁殖。临床上若不能早期处理创面上定植的细菌，在良好的“生存”环境下，致病菌大量繁殖最终可进展为创面脓毒症。尤其在大面积烧伤患者中，创面感染引发的脓毒症是导致其死亡的最主要原因之一。因此如果能早期快速识别创面中致病菌种类，针对不同种类的致病菌做出及时有效的处理，会对患者的预后有重要帮助。目前临床上对创面病原学的检测鉴定的方法主要是细菌培养法。主要步骤包括创面分泌物的取样、细菌的分离和培养、细菌的鉴定、以及细菌的药敏试验。该方法目前存在以下缺陷：1.此方法对检验科实验操作环境及操作员的操作技术有较高的要求，实验室工作人员在分离培养病原菌时存在着高风险被感染的可能，在乡镇医院、社区医疗单位尚不能大规模开展。2.对于批量鉴定时，操作过程中存在交叉污染，所得到的最终结果不一定能反应出创面的真实感染情况。3.难以检出需要特殊培养条件的细菌，如军团菌、l-型细菌、肺炎链球菌等。4.整个培养法检测时间较长，至少用时2-3天，对于临床急危重患者的救治，不能及时快速的回报结果大大延误了救治。综上所述，临床上需要一种快速实验环境要求低、准确，操作简单的创面分泌物致病菌检测试剂盒。对于细菌基因学的检测，常规的q-pcr具有操作的繁琐性，对实验操作人员的技术有较高的要求，在大的临床检验中心可以运用，尚不能在基层医疗机构大量推广。恒温核酸扩增分析仪是一种集快速核酸扩增、实时荧光检测、智能数据处理和自动结果判读于一体的pcr仪，能够对特定基因靶标进行快速检测。恒温核酸扩增分析仪具有仪器小巧，质量轻便，操作简便，检测快速等优点。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的bstdna聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。lamp针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的dna聚合酶在恒定温度下不断复制扩增dna。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。lamp具有简便、快速、灵敏、特异的优势。微流控芯片技术(microfluidicchip)又称芯片实验室(lab-on-a-chip)，它将化学中所涉及的样品预处理、反应、分离、检测，生命科学中的细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成到一块几平方厘米大小的芯片上，并以微通道网络贯穿各个实验环节，从而实现对整个实验系统的灵活操控，承载传统化学或生物实验室的各项功能。微流控芯片采用微通道将多种功能单元集成一个整体，在减少样本用量和试剂消耗量的基础上能够自动化检测样品，具有经济、环保等优点。本发明所开发的创面病原菌检测的试剂盒，采用环介导等温扩增法，用微流控芯片在恒温核酸扩增分析仪上进行。使用该方法对创面病原菌中特定的核酸进行检测，其具有特异性好，灵敏度高，操作简单，检测迅速等优点，能对特定病原菌进行检测，为临床抗生素的使用提供指导性意见。技术实现要素：鉴于现有技术存在的问题，本发明的解决的技术问题是通过微流控芯片和环介导等温扩增技术快速检测创面分泌物中的致病菌,包括革兰阳性菌2种(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌)，革兰阴性菌(大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌)4种，真菌(白色念珠菌、光滑念珠菌、毛霉菌)3种，共计9种常见致病菌的快速检出。具体的，本发明通过以下技术方案实现：快速检测创面病原菌的微流控芯片试剂盒包括对如下至少两种菌的快速检出组分，所述至少两种菌选自：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、毛霉菌9种常见致病菌，快速检出组分为上述致病菌的特异性引物组；优选地，所述试剂盒包含至少3种菌的快速检出组分，更优选地，所述试剂盒9种菌的快速检出组分。所述试剂盒还包括核酸扩增反应液、阴性及阳性质控模板。所述引物组包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、毛霉菌9种病原菌检测引物组，可用于扩增靶基因特异碱基序列，所述靶基因分别为：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、毛霉菌，为所述引物与所述靶基因核酸序列的一部分或其互补连互补。所述引物组由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、毛霉菌9种病原菌的各6条引物组成。所述引物组包含：一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测用引物组，由下列引物组成：正向外引物f3-ttatgtatcaggtacttat(seqidno.1)反向外引物b3-ttttgttatttaacccaatcattta(seqidno.2)正向内引物fipattcttcgttactcattacatacatgtgaattattataacttgtataac(seqidno.3)反向内引物bipaaccgaagataaaaaagaacctctgaatattttttgagttgaacctggtg(seqidno.4)正向环引物lf-aatggatagacgtcatatgaaggt(seqidno.5)反向环引物lb-ctcaacaagttccagattacaactt(seqidno.6)用于扩增耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性序列；一种金黄色葡萄球菌检测用引物组，由下列引物组成：正向外引物f3-gttactttacagatataatg(seqidno.7)反向外引物b3-gaaaaagtgtacgagttcttga(seqidno.8)正向内引物fipgtttcataaccttcataaatatttccatacagtcatttcactaa(seqidno.9)反向内引物bipgaggtcatttaatatttattacttcgatcactggacctag(seqidno.10)正向环引物lf-aactcatagtgtacaaca(seqidno.11)反向环引物lb-gtacctgttatgaaagtgttca(seqidno.12)用于扩增金黄色葡萄球菌特异性序列；一种大肠埃希菌检测用引物组，由下列引物组成：正向外引物f3-gtaatcgtggtgattgatga(seqidno.13)反向外引物b3-ggttcgttgtaaatactcca(seqidno.14)正向内引物fip-tctttcgtattgtttacctacttatgtcgtatttaacctc(seqidno.15)反向内引物biptacatagaagagtaagtcaacgttttggtttttgtcactatatatc(seqidno.16)正向环引物lf-ttcgaaaccaattactaaaga(seqidno.17)反向环引物lb-tataacttacagtagatt(seqidno.18)用于扩增大肠埃希菌特异性序列；一种肺炎克雷伯菌检测用引物组，由下列引物组成：正向外引物f3-gtctctacaataggaat(seqidno.19)反向外引物b3-atgagacctactgggaca(seqidno.20)正向内引物fip-aacctaaatgttaaaataagtcagggagacgaccgt(seqidno.21)反向内引物bip-agttaataaagtaggagtactttattttgttctagtatggaatcgg(seqidno.22)正向环引物lf-cgatgacataataaataaccg(seqidno.23)反向环引物lb-tatatataccactacca(seqidno.24)用于扩增肺炎克雷伯菌特异性序列；一种铜绿假单胞菌检测用引物组，由下列引物组成：正向外引物f3-tgttatggaaatgtccacctt(seqidno.25)反向外引物b3-tcttatgatatttctgag(seqidno.26)正向内引物fip-gtacagaacataatacagaggaacacgatgaacaacgt(seqidno.27)反向内引物bip-atatcgtctgacctatacccttcgtcatactttagat(seqidno.28)正向环引物lf-ccagataagagaatttcaga(seqidno.29)反向环引物lb-atattatcgttatcagg(seqidno.30)用于扩增铜绿假单胞菌特异性序列；一种鲍曼不动杆菌检测用引物组，由下列引物组成：正向外引物f3-tgttacaattaacttcttata(seqidno.31)反向外引物b3-cttgtaatatcgttatagtagtt(seqidno.32)正向内引物fip-agtgaattcggttatcgtaatatcgaataataaaaaaaaattagtcac(seqidno.33)反向内引物bipaatgatatgtatcaaaatatagagtattaactcatgttagatgg(seqidno.34)正向环引物lf-tataagagaggtctac(seqidno.35)反向环引物lb-ccgttaaaaattataagg(seqidno.36)用于扩增鲍曼不动杆菌特异性序列；一种白色念珠菌检测用引物组，由下列引物组成：正向外引物f3-tcaacttgtcacaccagat(seqidno.37)反向外引物b3-ctcaacaccaaacccagc(seqidno.38)正向内引物fip-tcgctgcgttcttcatcgataatagtcaaaactttcaacaacg(seqidno.39)反向内引物bip-tgcagatattcgtgaatcatcgaataaacgacgctcaaacagg(seqidno.40)正向环引物lf-gcgagaaccaagagatc(seqidno.41)反向环引物lb-ctttgaacgcacattgc(seqidno.42)可以扩增白色念珠菌特异性序列；一种光滑念珠菌检测用引物组，由下列引物组成：正向外引物f3-ccattaaaaagtgcaatggtg(seqidno.43)反向外引物b3-ctgtctttagaatccaactgc(seqidno.44)正向内引物fip-ttcttagcactgttgtcagaaacacaatgccttcctgtacca(seqidno.45)反向内引物bip-gtcggcgagggtaaattcaacgtttgattccttaagcccgata(seqidno.46)正向环引物lf-cggtggtggtatctgagacat(seqidno.47)反向环引物lb-tgatacactaactgcatctccct(seqidno.48)可以扩增光滑念珠菌特异性序列；一种毛霉菌检测用引物组，由下列引物组成：正向外引物f3-cttcatcttatttggtcttttgc(seqidno.49)反向外引物b3-tttatgcacgtggttggt(seqidno.50)正向内引物fip-cagtttcttcgtatgcattgtcactacgaacacaagatgtcact(seqidno.51)反向内引物bip-cagatccaaggatcctatggtcttggcccttgttggtattttgag(seqidno.52)正向环引物lf-gttgcacttgcaagttgatg(seqidno.53)反向环引物lb-cacatgggctttagaagataca(seqidno.54)可以扩增毛霉菌特异性序列。一种阳性质控用引物组，由下列引物组成：正向外引物f3-ttactggtcgcccatctc(seqidno.55)反向外引物b3-ctataggcacttctcctgtag(seqidno.56)正向内引物fip-acaacccgtccccatagtaataacactcatgccttccaca(seqidno.57)反向内引物bip-cgatgctatacttcgtataggaagccattcttgtgctatggaaca(seqidno.58)正向环引物lf-gacttagtcgctaagtggaa(seqidno.59)反向环引物lb-cgtttttttatgccccatcc(seqidno.60)用于扩增阳性质控特异性序列。本发明所述每组引物都经过多次筛选，均为扩增效率高，特异性好的引物序列。本发明的另一目的是提供一种创面分泌物快速检测芯片，是针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、毛霉菌特异性基因片段进行检测的微流控芯片。所述微流控芯片快速检测芯片，固定有上述9种菌的引物组及阳性质控和阴性质控阵列。具体构建样式详见附图及说明。所述检测芯片在恒温核酸扩增分析仪上工作运行。所述芯片包含阴性质控通道和阳性质控通道，阴性质控通道中不固定任何引物，阳性质控通道中固定酵母dna片段及可以扩增该片段的引物。所述阴性质控使用te作为模板扩增。所述检测方法是基于核酸等温扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、毛霉菌的检测方法。上述目的是通过如下技术实现：通过针对上述9种病原菌特定基因片段设计引物，并利用核酸等温扩增技术，以微流控芯片为载体，在恒温核酸扩增分析仪上进行扩增，并根据显色反应进行结构判读。本发明的另一个目的在于，提供基于核酸等温扩增技术和微流控芯片的试剂盒，可实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、毛霉菌的快速检测。特征在于，所述试剂盒包含有扩增反应液及固定有上述病原菌引物的基因芯片。扩增反应液具体组分及浓度如下：序号组分终浓度110×thermopolbuffer1×2mgso42-7mmol/l3bsa0.2-2mg/ml4datp0.2-3mmol/l5dgtp0.2-3mmol/l6dctp0.2-1.5mmol/l7dttp0.2-1.5mmol/l8betaine0.2-1mol/l9dutp0.01-0.5mmol/l10evagreen1×11ung0.001u/μl12bstpolymerase0.25-0.5u/μl所述酶为每微升含8-16个活性单位的bstdna聚合酶本发明另一个目的是提供一种前述试剂盒的使用方法，具体步骤如下：(1)样品处理和模板提取：样品范围为于创面分泌物样品标本，取1ml待检样品加入1.5ml离心管中，12000rpm离心2min后，弃上清，加入600μl超纯水，12000rpm离心2min后，弃上清对菌液进行清洗，在离心管中加入200ul超纯水充分混匀后加至装有玻璃珠的离心管中，震荡5min后，恒温金属浴100℃加热5min，12000rpm离心2min，取上清做待检模板；(2)取试剂盒中的分别的至少两种菌的24μl内引物fip/bip，3μl外引物f3/b,10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.159μl及0.545μl0.1％琼脂糖混合，点在相应位置；(3)取0.159μl1×105酵母dna，0.545μll0.1％琼脂糖和0.296μl引物混合之后，点在相应位置；(4)取扩增反应液，加入待检模板，形成如下的反应体系，振荡混匀后离心，将离心后的液体注入芯片，将芯片放入芯片恒温扩增核酸分析仪中，温度65℃进行反应，时间50min～60min，反应体系组分及浓度如下，反应总体积70μl；(5)检测：检测有s形曲线判定为阳性，未见s形曲线为阴性。其中，反应体系中具体组分及浓度如下表本发明的有益效果是：本方案提供的9种创面常见病原菌微流控芯片快速检测技术及试剂盒具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，可解决创面病原菌的现场快速检测和基层普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，还拥有试剂消耗量小、污染小、成本低、且便携等诸多优点。附图说明图1a为本发明微流控芯片一实施例的剖面示意图；图1b为本发明微流控芯片一实施例的外观示意图，其中，1为进样孔，12为进样孔卡扣，2为出气孔，21为出气孔卡扣，3为反应孔，n，n’为反应孔序号。图2为用图1所示的基因芯片对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行实际检测的结果；图3为用图1所示的基因芯片对金黄色葡萄球菌进行实际检测的结果；图4为用图1所示的基因芯片对大肠埃希菌进行实际检测的结果；图5为用图1所示的基因芯片对肺炎克雷伯菌进行实际检测的结果；图6为用图1所示的基因芯片对铜绿假单胞菌进行实际检测的结果；图7为用图1所示的基因芯片对鲍曼不动杆菌进行实际检测的结果；图8为用图1所示的基因芯片对白色念珠菌进行实际检测的结果；图9为用图1所示的基因芯片对光滑念珠菌进行实际检测的结果；图10为用图1所示的基因芯片对毛霉菌进行实际检测的结果；图中横坐标单位是分钟(min)，纵坐标没有单位；1-12通道分别为：1为阳性质控，2为阴性质控，3为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，4为金黄色葡萄球菌，5为大肠埃希氏菌，6为肺炎克雷伯菌，7为铜绿假单胞菌，8为鲍曼不动杆菌，9为白色念珠菌，10为光滑念珠菌，11为毛霉菌，12为阴性质控；图中有s形曲线判定为阳性，未见s形曲线为阴性。具体实施方式为进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明优选方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。下面通过具体的实施例和附图对本发明进行说明，以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、毛霉菌检测过程通过基因芯片来对本发明进行说明，如无特别说明，均为常规方法。1.引物制备，以上述的核酸序列合成,得到引物组，由上海生工合成。2.基因芯片制备，芯片是由上述seqidno.1～seqidno.54引物、阳性质控品seqidno.55-seqidno.60引物、阴性质控品组成的阵列；具体方法为：取24μl耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的内引物fip/bip，3μl外引物f3/b，10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.159μl及0.545μl0.1％琼脂糖混合，得到反应混和物，然后点在相应位置，自然晾干；取24μl金黄色葡萄球菌的内引物fip/bip，3μl外引物f3/b，10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.159μl及0.545μl0.1％琼脂糖混合，得到反应混和物，然后点在相应位置，自然晾干；取24μl大肠埃希菌的内引物fip/bip，3μl外引物f3/b，10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.159μl及0.545μl0.1％琼脂糖混合，得到反应混和物，然后点在相应位置，自然晾干；取24μl肺炎克雷伯菌的内引物fip/bip，3μl外引物f3/b，10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.159μl及0.545μl0.1％琼脂糖混合，得到反应混和物，然后点在相应位置，自然晾干；取24μl铜绿假单胞菌的内引物fip/bip，3μl外引物f3/b，10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.159μl及0.545μl0.1％琼脂糖混合，得到反应混和物，然后点在相应位置，自然晾干；取24μl鲍曼不动杆菌的内引物fip/bip，3μl外引物f3/b，10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.159μl及0.545μl0.1％琼脂糖混合，得到反应混和物，然后点在相应位置，自然晾干；取24μl白色念珠菌的内引物fip/bip，3μl外引物f3/b，10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.159μl及0.545μl0.1％琼脂糖混合，得到反应混和物，然后点在相应位置，自然晾干；取24μl光滑念珠菌的内引物fip/bip，3μl外引物f3/b，10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.159μl及0.545μl0.1％琼脂糖混合，得到反应混和物，然后点在相应位置，自然晾干；取24μl毛霉菌菌株的内引物fip/bip，3μl外引物f3/b，10μl环引物lf/lb三对引物混合，取0.296μl混合引物和超纯水0.159μl及0.545μl0.1％琼脂糖混合，得到反应混和物，然后点在相应位置，自然晾干；取0.159μl1×105酵母dna，0.545μl0.1％琼脂糖和0.296μl引物混合之后，点在相应位置，自然晾干。3.分别提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、毛霉菌菌株基因dna：取1ml菌液加入1.5ml离心管中，12000rpm，离心2min后弃上清，加入600μl超纯水，再次12000rpm，离心2min后弃上清对菌液进行清洗，在离心管中加入200μl超纯水充分混匀后加至装有玻璃珠的离心管中，震荡5min后，恒温金属浴加热5min，12000rpm离心2min取上清。4.基于核酸扩增法的基因扩增。取扩增反应液28μl，加入35μl待检模板及7μl水，形成如下表总体积为70μl的反应体系，反应体系如下：(反应总体积为70μl)。在温度为65℃的ichip-400上反应50分钟，反应体系中各组分及浓度如下表。扩增产物检测：与阴性对照孔比较，检测孔在ichip-400设备上有s形曲线，判定lamp测试结果为阳性。在ichip-400设备上未见s形曲线，判定lamp测试结果为阴性。以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超过权利要求所记载的技术方案前提下，还有其他变体或改型。本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。序列表<110>上海蕴箬生物科技有限公司<120>一种快速检测创面病原菌的微流控芯片试剂盒<160>60<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ttatgtatcaggtacttat19<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ttttgttatttaacccaatcattta25<210>3<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3attcttcgttactcattacatacatgtgaattattataacttgtataac49<210>4<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aaccgaagataaaaaagaacctctgaatattttttgagttgaacctggtg50<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aat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