一种高产IgG1的重组菌及构建方法

一种高产igg1的重组菌及构建方法
技术领域
1.本发明属于生物工程领域，特别是涉及一种igg1的重组菌及构建方法。


背景技术：

2.单克隆抗体在自身免疫性疾病和肿瘤的治疗中起着重要作用，在医药市场上占据很大份额。2017年，全球十大最畅销药物中有五种是单克隆抗体。目前，美国fda和欧洲emea批准的几十种单克隆抗体药物中，免疫球蛋白g(igg)占据最重要的地位。因此，提高免疫球蛋白g产量、结构稳定性和功能可靠性的研究引起了人们的广泛关注。
3.西妥昔单抗(cetuximab)是fda批准的表皮生长因子受体(egfr)抑制剂的嵌合igg1。西妥昔单抗通过抑制癌细胞增殖、血管再生和转移，并通过促进癌细胞凋亡来增强化学疗法和放射疗法，从而达到抗肿瘤的作用。西妥昔单抗的抗原结合片段通过细胞外表皮生长因子的结构域iii结合，从而阻止受体的构象变化并阻断了其信号传导。西妥昔单抗已被广泛证明，与其他药物和放疗具有协同作用。
4.目前在大肠杆菌中表达igg1的研究很少。2009年，hakim等人发表在mabs期刊上的文献“inclonals”:iggs and igg-enzyme fusion proteins produced in an e.coli expression-refolding system.公开了提取嵌合igg轻链和重链的包涵体，并将其重新折叠组装，从而获得全长的嵌合igg1。2015年robinson等人发表在nature communications期刊上的文献efficient expression of full-length antibodies in the cytoplasm of engineered bacteria.公开了大肠杆菌shuffle菌株可以产生可溶性全长抗体，最终获得1.1mg/l抗pa-63嵌合igg1。
5.但是目前缺少大肠杆菌氨基酸合成途径对全长igg1抗体表达影响的相关研究。


技术实现要素：

6.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高产igg1的重组菌。
7.本发明的第二个目的是提供一种高产igg1的重组菌的构建方法。
8.本发明的技术方案概述如下：
9.一种高产igg1的重组菌的构建方法，包括如下步骤：
10.(1)基因的体外合成和扩增
11.从ncbi数据库获得来源于人源的西妥昔单抗轻链的氨基酸序列和西妥昔单抗重链的氨基酸序列，将所述西妥昔单抗轻链简称lc，将所述西妥昔单抗重链简称hc；
12.将所述lc的氨基酸序列在jcat网站，通过输入：避免xbai，ndei，spei和hindiii限制性酶切位点为条件，得到优化后的lc；在优化后的lc的核苷酸序列5'、3'端分别加入ndei限制性酶切位点和spei限制性酶切位点，得到加酶切位点的lc，在体外合成和扩增；
13.将所hc的氨基酸序列在jcat网站，通过输入：避免xbai，ndei，spei和hindiii限制性酶切位点为条件，得到优化后的hc，在优化后的hc的核苷酸序列5'、3'端分别加入ndei限制性酶切位点和spei限制性酶切位点，得到加酶切位点的hc，在体外合成和扩增；
alaa；
29.将步骤(2)获得的所述gdha的核苷酸序列连接到p3c5bad载体中得到p3c5bad-gdha；
30.将步骤(2)获得的所述serb的核苷酸序列连接到p3c5bad载体中得到p3c5bad-serb；
31.将步骤(2)获得的所述phea的核苷酸序列连接到p3c5bad载体中得到p3c5bad-phea；
32.所述p2a4uv5载体的核苷酸序列如seq id no.19所示；所述p3c5bad载体的核苷酸序列如seq id no.20所示；
33.(4)将p2a4uv5-ab和p3c5bad-ilve导入大肠杆菌中，得到重组菌2；将p2a4uv5-ab和p3c5bad-aspc导入大肠杆菌中，得到重组菌3；将p2a4uv5-ab和p3c5bad-alaa导入大肠杆菌中，得到重组菌4；将p2a4uv5-ab和p3c5bad-gdha导入大肠杆菌中，得到重组菌5；将p2a4uv5-ab和p3c5bad-serb导入大肠杆菌中，得到重组菌6；将p2a4uv5-ab和p3c5bad-phea导入大肠杆菌中，得到重组菌7。
34.上述方法构建的一种高产igg1的重组菌。
35.本发明的优点：
36.本发明的重组菌可以提高igg1的表达量；本发明的重组菌的构建方法可以快速筛选出高表达igg1的重组菌。
附图说明
37.图1为重组菌的igg1表达量。
具体实施方式
38.下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
39.实施例1
40.一种高产igg1的重组菌的构建方法，包括如下步骤：
41.(1)基因的体外合成和扩增
42.从ncbi数据库获得来源于人源的西妥昔单抗轻链的氨基酸序列和西妥昔单抗重链的氨基酸序列，将西妥昔单抗轻链简称lc，将西妥昔单抗重链简称hc；
43.将lc的氨基酸序列在jcat网站，通过输入：避免xbai，ndei，spei和hindiii限制性酶切位点为条件，得到优化后的lc；在优化后的lc的核苷酸序列5'、3'端分别加入ndei限制性酶切位点和spei限制性酶切位点，得到加酶切位点的lc，在体外合成和扩增；
44.将hc的氨基酸序列在jcat网站，通过输入：避免xbai，ndei，spei和hindiii限制性酶切位点为条件，得到优化后的hc，在优化后的hc的核苷酸序列5'、3'端分别加入ndei限制性酶切位点和spei限制性酶切位点，得到加酶切位点的hc，在体外合成和扩增；
45.lc的氨基酸序列如seq id no.1所示；
46.hc的氨基酸序列如seq id no.2所示；
47.加酶切位点的lc的核苷酸序列如seq id no.3所示；
48.加酶切位点的hc的核苷酸序列如seq id no.4所示；
phea；
63.所述p2a4uv5载体的核苷酸序列如seq id no.19所示；
64.所述p3c5bad载体的核苷酸序列如seq id no.20所示；
65.(4)将p2a4uv5-ab和p3c5bad导入大肠杆菌中，得到重组菌1(对照)；将p2a4uv5-ab和p3c5bad-ilve导入大肠杆菌中，得到重组菌2；将p2a4uv5-ab和p3c5bad-aspc导入大肠杆菌中，得到重组菌3；将p2a4uv5-ab和p3c5bad-alaa导入大肠杆菌中，得到重组菌4；将p2a4uv5-ab和p3c5bad-gdha导入大肠杆菌中，得到重组菌5；将p2a4uv5-ab和p3c5bad-serb导入大肠杆菌中，得到重组菌6；将p2a4uv5-ab和p3c5bad-phea导入大肠杆菌中，得到重组菌7。
66.实施例2
67.实施例1制备的重组菌1、重组菌2、重组菌3、重组菌4、重组菌5、重组菌6、重组菌7发酵：
68.(1)将重组菌1(对照)、重组菌2、重组菌3、重组菌4、重组菌5、重组菌6、重组菌7分别发酵，得到发酵液wt、ilve、aspc、alaa、gdha、serb、phea；
69.发酵过程：将重组菌1(对照)、重组菌2、重组菌3、重组菌4、重组菌5、重组菌6、重组菌7，分别在含有(100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素)的改进的m9培养基中培养，37℃和220rpm下培养16小时；将培养物以1:100比例转接入含有50ml改进的m9培养基的250ml摇瓶中，并在37℃下生长。当600nm处的光密度(od600)达到约0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)和阿拉伯糖(l-arabinose)，使其终浓度分别为1mm和0.2mm，并在25℃和200rpm下生长16小时；
70.改进的m9培养基：6.8g/lna2hpo4，3g/lkh2po4，0.5g/lnacl，2g/lnh4cl，0.25g/l mgso4·
7h2o，11.1mg/lcacl2，10mg/l硫胺素，2g/l酵母提取，3％(v/v)甘油和1ml/l的金属痕量储备液；
71.金属痕量储备液：27g/lfecl3·
6h2o，2g/lzncl2，2g/lna2moo4·
2h2o，1.9g/l cuso4·
5h2o，0.5g/lh3bo3和100ml/l浓hcl；通过tris将ph调节至7.25。
72.(2)粗蛋白液的提取；
73.将得到的wt、ilve、aspc、alaa、gdha、serb、phea发酵液在4℃和6500rpm下离心收集沉淀。细胞用0.01m pbs(ph＝7.0)洗涤。wt、ilve、aspc、alaa、gdha、serb、phea沉淀用0.01mpbs(ph＝7.0)重悬细胞并进行超声破碎处理，5s脉冲，10s间歇，总工作时间为20分钟。然后，将细胞裂解物在10,000rpm和4℃下离心10分钟，收集上清液。然后使用0.45μm滤膜进行过滤。得到粗蛋白液wt、ilve、aspc、alaa、gdha、serb、phea。
74.(3)elisa(酶联免疫吸附剂测定，采用matriks biotek cetuximab elisa shikari q-cet试剂盒)；
75.第一步：96孔板，每孔加入100μlassaybuffer，分别将10μl步骤(2)获得的粗蛋白液放入孔中，3个平行；再将10μl浓度分别是0μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml、300μg/ml西妥昔单抗标准品加入孔中，3个平行；轻轻摇板进行简单混合，用封板膜封住反应孔，室温下孵化30min。
76.第二步：揭掉封板膜，吸弃孔内液体。用300μl稀释的washbuffer洗涤3次，在干净的纸上拍干。
77.第三步：每孔加入100μl准备好的hrpconjugate。
78.第四步：用新的封板膜密封。室温孵化30min。
79.第五步：重复第二步。
80.第六步：每孔加入100μltmbsubstratesolution。
81.第七步：黑暗条件下室温孵化10min(不封膜)。
82.第八步：加入100μlstopsolution停止反应。轻轻摇板进行简单混合，孔内颜色由蓝变黄。
83.第九步：以空白孔调零，30min内使用酶标仪在450nm测定每孔的吸光度，见图1。