一株具有高效降解水产养殖水体中饲料淀粉功能的贝莱斯芽孢杆菌D1及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有高效降解水产养殖水体中饲料淀粉功能的贝莱斯芽孢杆菌d1及其应用。

背景技术：

凡纳滨对虾作为深受人们喜爱的海产品，具有极高的营养价值；中国的对虾养殖业，规模巨大，对一个地区的经济发展和其他产业的带动都产生重大影响。目前，我国是世界上重要的水产品生产和出口国之一，且对虾产量还在逐年增加，根据《中国渔业统计年鉴2019》数据显示，2018年中国对虾海水养殖产量高达到5.58万吨。随着养殖规模的扩大和养殖密度的提高，疾病爆发和环境污染等问题日益严重，经济损失巨大，极大阻碍了水产养殖业的发展。现如今集约化水产养殖系统在不断普及，为追求产量和经济效益，经验不足的养殖户往往过量投喂饲料，虽然科研工作者已通过改善水产饲料的适口性、添加适当的诱食剂、调节饲料中氨基酸平衡等手段来提高养殖动物对饲料的摄入量，但养殖动物对虾肠道较短，饲料在消化道停留时间十分有限，消化效率低下，大部分的饲料未经消化完全就被排出体外，导致残饵大量聚集，池塘内源性污染严重，大体量水产养殖废水排放污染一直是制约环境友好发展的不良因素。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株具有高效降解水产养殖水体中饲料淀粉功能的贝莱斯芽孢杆菌d1及其应用。所述的贝莱斯芽孢杆菌d1可胞外分泌淀粉酶，对养殖动物安全无毒，并协助养殖动物对淀粉及其他多糖的分解，提高饲料利用率，可作为新型的水产养殖益生菌，促进养殖动物生长，稳定水质。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明是取健康强壮对虾肠道，制成悬浊液后涂布改良的淀粉培养基，待长出菌落后滴加碘液，一分钟后测量透明全大小，筛选出能形成透明圈的细菌，多次纯化，最终挑选出生长速度快、形成的透明圈最大的菌株；通过16srdna分子鉴定，确定为芽孢杆菌属(bacillus)的细菌，命名为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)d1。

进一步地，对本发明分离得到的贝莱斯芽孢杆菌d1进行常用抗生素敏感性测试，结果表明，该贝莱斯芽孢杆菌d1对28种抗生素敏感，仅对青霉素、多粘菌素b产生轻微耐药。

因此，上述的贝莱斯芽孢杆菌d1可胞外分泌淀粉酶协助、促进养殖动物对饲料中淀粉的消化吸收，并且能提高整体饲料利用率，有效降解水体中残余的饵料，将多聚糖降解为容易利用的寡糖和单糖供给水体益生菌利用。

因此，本发明提供上述的贝莱斯芽孢杆菌d1在促进水产养殖动物对淀粉的消化吸收，提高饲料利用率中的应用。

一种新型微生态制剂，其包含上述的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)d1。

本发明的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)d1或含有该贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)d1的新型微生态制剂可应用于降解淀粉。特别是，可应用于降解水产养殖水体中的淀粉。

本发明的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)d1或含有该贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)d1的新型微生态制剂可应用于制备水产养殖饲料或添加剂。

一种水产养殖饲料或添加剂，其含有上述的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)d1或上述的新型微生态制剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

芽孢杆菌属细菌是工业及食品业常用的发酵菌株，裴晓方等人自水豆豉中分离出一株具有高产蛋白酶、淀粉酶和豆豉纤溶酶能力的贝莱斯芽孢杆菌，可运用于食品发酵中，提高产品风味。相比之下，在两株贝莱斯芽孢杆菌分离自两个完全不同的生境，在彼此的进化图谱中并未出现相同菌株，两株菌亲缘关系较远，且在该贝莱斯芽孢杆菌亲缘关系最为接近的菌株cp017747的全基因组，未能找到可以匹配的16s序列。本发明筛选到的贝莱斯芽孢杆菌d1分离自健康对虾肠道，旨在挑选可作为水产养殖益生菌的本土菌株。经验证该菌可胞外分泌淀粉酶，水解生存环境中的淀粉及其他多糖，定植于水产养殖动物肠道后可协助其对摄入的淀粉饲料的利用，并且能分解残饵中剩余的淀粉，将原本要排掉并且对环境造成极大污染的养殖废水再利用，生成快速碳源供给水体中的微生物利用；此外，对于对虾来说，水体中微生物(生物絮团)本身就是一种良好的菌体蛋白，该种养殖模式整体提高了饲料利用率。该菌与卤虫悉生实验表明菌株在较高浓度时也不会对养殖动物产生胁迫或毒害作用；菌株耐受性较广，盐度对细菌生长影响较小，在水产养殖中十分适用，且能高效发挥功能；在海水养殖业中意义重大，该菌可作为新型微生态制剂的良好菌株，具有较好的应用前景。

本发明的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)d1于2020年1月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：gdmccno：60943。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌d1在淀粉平板上的降解性能，透明圈。

图2为贝莱斯芽孢杆菌d116srrna基因序列的系统发育树分析。

图3为贝莱斯芽孢杆菌d1在不同ph下的细胞数量变化图。

图4为贝莱斯芽孢杆菌d1在不同盐度下的细胞数量变化图。

图5为贝莱斯芽孢杆菌d1在不同温度下的细胞数量变化图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1可胞外分泌淀粉酶的贝莱斯芽孢杆菌d1的富集及筛选

样品来源：中国科学院南海海洋研究所智能化海水养殖房凡纳滨对虾养殖水体。

具体的实施步骤如下：在对虾养殖池中挑选个体大活力好消化道充盈的健康对虾，立即带回实验室。滤纸吸去对虾表面残余的海水，75％v/v的酒精擦拭体表进行消毒，无菌条件下解剖，取出其完整肠道。无菌的pbs(ph＝7.4)缓冲液冲洗肠道组织3～4次后放入1.5ml的无菌ep管，往无菌ep管中加入1mlpbs缓冲液，无菌研磨棒充分研磨均匀，用10倍递增稀释法制成菌悬液(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7)，取100μl菌悬液分别涂布于淀粉平板，置于30℃恒温培养箱中培养48h后，取0.02mol/l碘液滴加在淀粉平板中菌落周围，一分钟后测量透明圈大小，阳性反应(淀粉被分解)为琼脂培养基呈深蓝色、菌落周围出现无色透明圈。根据淀粉平板透明圈大小，挑取形成透明圈最大的单菌落再次划线培养，经3次划线纯化后得到菌株纯培养，该菌株记为d1。菌株d1在淀粉平板上的降解性能，透明圈见图1所示。

淀粉平板：(nh4)2so412.5g/l、kh2po412.5g/l、淀粉12.5g/l、蛋白胨3.75g/l、牛肉膏3g/l、琼脂粉15g/l，溶剂为去离子水；配制：将(nh4)2so4、kh2po4、淀粉、蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉溶于去离子水，灭菌，即得。

实施例2贝莱斯芽孢杆菌d1菌种的鉴定

1、形态观察

将纯培养d1菌株按平板划线法接种于2216e固体培养基表面，30℃恒温箱中培养24h后观察菌落形态特征。该菌菌落较小，在2216e固体培养基上生长缓慢，菌落呈点状，白色不透明，边缘不光滑，菌落较为干燥。

2216e固体培养基是在2216e液体培养基组分中加入质量分数为1.5％的琼脂粉，混合，灭菌制得。所述的2216e液体培养基每升含蛋白胨5g、酵母浸粉1g、柠檬酸铁0.1g、氯化钠19.45g、氯化镁5.98g、硫酸钠3.24g、氯化钙1.8g、氯化钾0.55g、碳酸钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶0.034g、硼酸0.022g、硅酸钠0.004g、氟化钠0.0024g、硝酸铵0.0016g、磷酸氢二钠0.008g，溶剂为去离子水。

配方方法：按配方量称取培养基各组分，溶于去离子水，混合均匀，121℃灭菌20分钟，即得。

2、生理生化鉴定

采用biologgeniii微孔板对d1菌株进行生理生化鉴定。将纯化的d1菌株，取单菌落用稀释液(nacl0.4wt％，吉冷胶0.02wt％，余量为去离子水；配制：将nacl和吉冷胶溶于去离子水，121℃灭菌20分钟，用时每20ml加100μl7.66wt％巯基乙酸钠溶液)稀释至合适浊度，透光率为90～98％，将稀释液加至biology全自动生化鉴定板中，每孔加100μl，30℃培养20h后上机读数，记录读数结果，进行菌株对95种碳源的利用分析，结果见表1，鉴定结果显示，该d1菌株为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)。

表1d1菌株生理生化鉴定项目及结果

注：“+”表示生长或阳性反应，“-”表示不生长或阴性反应。

3、分子鉴定

取d1菌株纯培养菌液离心，去上清，以菌体沉淀提取基因组dna，以基因组dna为模板，利用通用引物27f/1492r(27f:5'-agagtttgatcctggctcag-3'，1492r:5'-ggttaccttgttacgactt-3')进行16srdna扩增并测序，其序列如seqidno.1所示，将测序所得到的基因组序列经blast搜索比对，该d1菌株与bacillusvelezensis有较高同源性，鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)。结合形态、生理生化特征(如表1所示)及16srdna序列分析，鉴定为bacillusvelezensis.，将其命名为：贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)d1。菌株d116srrna基因序列的系统发育树分析见图2。

该贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)d1于2020年1月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为：gdmccno：60943。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌d1最适生长条件的探究

分别研究不同ph、温度、nacl质量分数(盐度)对贝莱斯芽孢杆菌d1生长的影响。其中，不同的温度为：20℃、25℃、30℃、37℃、43℃；不同的ph值为：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；不同的nacl质量分数为：0％、1％、2％、3％、4％、5％。

以上实验除了考察因素外，发酵条件都是将贝莱斯芽孢杆菌d1培养液以1％(v/v)的接种量接种于lb发酵培养基中，在30℃、200rpm下培养24h后，取样测定各条件的od600值，以不接菌的lb发酵培养基作空白对照。以培养温度、ph值、nacl质量分数为横坐标，od600值为纵坐标绘制各自曲线。结果见图3-5，由图3-5可知，贝莱斯芽孢杆菌d1可生长温度范围为25～37℃，最适生长温度为25℃，当温度低于20℃或过高于45℃时，培养液的od600为0，几乎不生长；贝莱斯芽孢杆菌d1在初始ph4～7的培养基中可以生长，最适ph为5，在ph为8时生长较为缓慢，当环境过碱(ph＞9)时几乎不生长；贝莱斯芽孢杆菌d1在nacl质量分数为1～5％时，均能生长，最适生长nacl质量分数为2％，该菌株盐度耐受较广，为广盐性细菌，由于该菌株分离自对虾肠道，最适ph偏酸。贝莱斯芽孢杆菌d1在温度25℃、初始ph为5.0、盐度为2wt％时生长最佳。

lb发酵培养基每升含胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，溶剂为去离子水；配制方法为：按配方量称取培养基各组分，溶于去离子水，混合均匀，121℃灭菌20分钟，即得。

实施例4贝莱斯芽孢杆菌d1抗生素药敏实验

用常规的琼脂扩散法，对贝莱斯芽孢杆菌d1进行30种常用抗生素的敏感性测试。方法如下：将培养过夜的菌液稀释20倍，取600μl稀释液均匀涂布2216e平板，晾干后中心对称放置3片药敏纸片，30℃培养20h后测量抑菌圈直径，以抑菌圈直径大小作为敏感与耐药的判定指标。结果见表2。

表2d1菌株抗生素药敏实验结果

注：“s”(抑菌圈直径＞8mm)为敏感，“r”(抑菌圈直径≤8mm)为耐药.

实施例5菌株安全性测定

以卤虫(artemiasalina)为动物模型，检测分离菌株d1对卤虫的安全性。称取1g卤虫卵，75％v/v无水乙醇消毒处理12h，放入1000ml灭菌海水，于25℃连续充氧曝气孵化20h。取12孔板每孔随机取30尾孵化出的卤虫于2ml无菌海水中，并在室温下适应6h，每孔加入pt3菌株至终浓度1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸cfu/ml，以不加菌株的孔作为阴性对照，以加了相同浓度致病菌哈氏弧菌ncimb1280的孔作为阳性对照，所有处理设置3个重复，每隔12h，置于体表显微镜下挑出死亡的卤虫，连续观察2d，计算卤虫存活率以及其对应的半致死浓度，死亡率计算公式如下：

死亡率/％＝(每隔12h挑出的死亡数)/总卤虫数×100％

当死亡率为50％时，计算出对应的细菌浓度即为半致死计量浓度。结果见表3。

表3不同浓度筛选菌株d1和哈氏弧菌ncimb1280感染48h卤虫死亡率

卤虫保护性实验结果表明，在接种感染后的48h，阴性对照组存活率为69％，试验组菌株d1存活率最高为61％，阳性对照组哈氏弧菌ncimb1280存活率仅为2％，菌株d1半致死浓度为1.5×10⁷cfu/ml，证实贝莱斯芽孢杆菌d1对养殖动物无毒。

实施例6贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)d1降解水产养殖水体中饲料淀粉的应用

用0.3wt％高锰酸钾溶液浸泡过夜消毒6个10l透明玻璃缸以及相关配件(温度计、气石、加热棒、小型捞网)，并用干净自来水反复冲洗3遍备用。使用海盐配制养殖所用海水，盐度10g/l，并充分曝气2-3d，每个缸加入养殖海水8l，养殖过程中全天24h持续曝气，养殖水体溶解氧不低于6-10mg/l，设置水体温度为26℃，ph7.80-8.35。每个缸放入随机捞取的10尾健康对虾个体(体长约8-9cm)。每日投喂对虾体重10％的统一对虾配合饲料。期间补充蒸发水分以保持养殖水体体积和盐度维持稳定，每天随饲料添加50％饲料重量的蔗糖作为细菌起始碳源。

其中3个缸为对照组，正常投喂养殖；剩余3个缸为实验组，每天添加分离到的贝莱斯芽孢杆菌d1至终浓度1×10⁶cfu/ml。接种方法：发酵收集新鲜菌体，施放时用养殖水将菌体重悬，与当天饲料混合均匀后一同投喂。养殖期间观察对虾进食及残饵及粪便情况。

结果显示：对虾进食正常，食欲旺盛。实验组中残饵及粪便呈分散状，养殖水体不通透，生物量较大。相比于对照组，实验组对虾个体更早出现了褪壳生长现象，且时间较为集中。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国科学院南海海洋研究所

<120>一株具有高效降解水产养殖水体中饲料淀粉功能的贝莱斯芽孢杆菌d1及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1450

<212>dna

<213>贝莱斯芽孢杆菌d1(bacillusvelezensisd1)

<400>1

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