一株具有蛋白降解功能的微小杆菌PT3及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有蛋白降解功能的微小杆菌pt3及其应用。

背景技术：

随着经济的发展，人们物质生活水平的提高，水产品需求量日益增大。目前，我国是世界上重要的水产品生产和出口国之一。仅2018年1-11月，全国水产品产量已高达5375.55万吨。为了提高养殖动物在单位之间内的增重量，水产饲料中蛋白含量始终维持在较高水平，而养殖动物对于饲料中蛋白的利用率普遍较低，投喂的饵料仅有25％的饲料蛋白质被养殖动物吸收利用，其余75％存在于剩余饵料或随粪便排放到养殖水体中，资源浪费十分严重，同时也给海水养殖产业造成较大的经济损失。因此，提高饲料蛋白利用率，间接提高养殖动物单位时间内的增重率是降低养殖成本、节约资源、缩短上市时间、扩大收益的有效途径。

科研工作者已通过改善水产饲料的适口性、添加适当的诱食剂、调节饲料中氨基酸平衡等手段来提高养殖动物对饲料的摄入量，但为压低成本，国内饲料中蛋白质多为植物蛋白，水产养殖动物对于这些植物蛋白的消化率低下，不能完全被水产动物的消化酶所分解转化，这也是饲料蛋白利用率低的主要限制因素。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株具有高效降解水产养殖水体中蛋白质功能的微小杆菌pt3及其在水产养殖中的应用。所述的微小杆菌pt3可胞外分泌蛋白酶，对养殖动物安全无毒，并协助养殖动物对蛋白的消化吸收，提高饲料蛋白利用率，可作为新型的水产养殖益生菌，促进养殖动物生长，稳定水质。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明是取健康强壮对虾肠道，制成悬浊液后涂布常规奶粉平板筛选出能形成透明圈的细菌，多次纯化，最终挑选出生长速度快、形成的透明圈最大的菌株；通过16srdna分子鉴定，确定为微小杆菌属(exiguobacterium)的细菌，命名为微小杆菌(exiguobacteriumsp.)pt3。

进一步地，对本发明分离得到的微小杆菌pt3进行胞外分泌蛋白酶酶活测定，结果表明，该微小杆菌pt3胞外分泌蛋白酶活性为25.21iu。将该微小杆菌pt3作为益生菌以饲料拌喂的形式投放于对虾养殖水体中，对虾生长良好，残饵粪便分散。

因此，上述的微小杆菌pt3可胞外分泌蛋白酶协助、促进养殖动物对饲料中蛋白的消化吸收，并且能提高整体饲料利用率。

一种新型微生态制剂，其包含上述的微小杆菌(exiguobacteriumsp.)pt3。

本发明的微小杆菌(exiguobacteriumsp.)pt3或含有该微小杆菌(exiguobacteriumsp.)pt3的新型微生态制剂可应用于分解或降解蛋白质。

本发明的微小杆菌(exiguobacteriumsp.)pt3或含有该微小杆菌(exiguobacteriumsp.)pt3的新型微生态制剂可应用于制备水产养殖饲料或添加剂。优选，所述的微小杆菌(exiguobacteriumsp.)pt3通过促进水产养殖动物对蛋白质的消化吸收，提高饲料或添加剂中的蛋白利用率。

一种水产养殖饲料或添加剂，其含有上述的微小杆菌(exiguobacteriumsp.)pt3或上述的新型微生态制剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

赵谋明等从深海中分离了一株具有中性蛋白酶活性的微小杆菌swjs2，详细研究了温度、培养时间等对酶活的影响，主要应用范围为工业，将该类型菌株作为益生菌应用于水产养殖，并在实际养殖中评估其安全性及作用效果的研究鲜有报道。早在2006年，avnimelech等学者就提出以益生菌来维持养殖水体环境，但调控需要较为专业的技术支持，且缺少优良的益生菌菌株，使得该技术普及困难。本发明筛选到的微小杆菌pt3分离自对虾肠道本身，且经验证该菌可胞外分泌蛋白酶，水解存活环境中的蛋白，定植于水产养殖动物肠道后可协助其对蛋白质的利用，并且能分解残饵中剩余的蛋白，合成自身菌体蛋白供给养殖动物使用，再次定植肠道，形成一个良性循环，提高饲料蛋白利用率。为了能在实际养殖中使用，评估了菌株的安全性，该菌与卤虫悉生实验表明菌株在较高浓度时也不会对养殖动物产生胁迫或毒害作用；菌株耐受性较广，盐度对细菌生长影响较小，在水产养殖中十分适用，实际的养殖实验也证明其能高效发挥功能，且效果显著；该菌可作为新型微生态制剂的优秀备选菌株，可促进养殖动物消化吸收，提高蛋白利用率，对于新型绿色水产养殖业意义重大，具有较好的应用前景。

本发明的微小杆菌(exiguobacteriumsp.)pt3于2019年12月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：gdmccno：60923。

附图说明

图1为微小杆菌pt3在奶粉平板上的蛋白降解性能，透明圈。

图2为测定微小杆菌pt3蛋白酶活性的酪氨酸标准曲线。

图3为微小杆菌pt3在不同ph下的细胞数量变化图。

图4为微小杆菌pt3在不同盐度下的细胞数量变化图。

图5为微小杆菌pt3在不同温度下的细胞数量变化图。

图6为微小杆菌pt3添加与否，对虾残饵及粪便效果图(左图为添加菌株pt3，右图为空白对照，即不添加菌株pt3)。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1可胞外分泌蛋白酶的微小杆菌pt3的富集及筛选

样品来源：中国科学院南海海洋研究所智能化海水养殖房凡纳滨对虾养殖水体。

具体的实施步骤如下：在对虾养殖池中挑选个体大活力好消化道充盈的健康对虾，立即带回实验室。滤纸吸去对虾表面残余的海水，75％v/v的酒精擦拭体表进行消毒，无菌条件下解剖，取出其完整肠道。无菌的pbs(ph＝7.4)缓冲液冲洗肠道组织3～4次后放入1.5ml的无菌ep管，往无菌ep管中加入1mlpbs缓冲液，无菌研磨棒充分研磨均匀，用10倍递增稀释法制成菌悬液(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7)，取100μl菌悬液分别涂布于奶粉平板(脱脂奶粉10g/l、琼脂粉15g/l，溶剂为去离子水；配制：将脱脂奶粉和琼脂粉溶于去离子水，灭菌，即得)，置于30℃恒温培养箱中培养48h后，直接观察奶粉平板透明圈大小，挑取形成透明圈最大的单菌落再次划线培养，经3次划线纯化后得到菌株纯培养，该菌株记为pt3。菌株pt3在奶粉平板上的蛋白降解性能，透明圈见图1所示。

实施例2微小杆菌pt3菌种的鉴定

1、形态观察

将纯培养pt3菌株按平板划线法接种于2216e固体培养基表面，30℃恒温箱中培养24h后观察菌落形态特征。该菌落呈点状，白色不透明，边缘光滑，菌落湿润。

2216e固体培养基是在2216e液体培养基组分中加入质量分数为1.5％的琼脂粉，混合，灭菌制得。所述的2216e液体培养基每升含蛋白胨5g、酵母浸粉1g、柠檬酸铁0.1g、氯化钠19.45g、氯化镁5.98g、硫酸钠3.24g、氯化钙1.8g、氯化钾0.55g、碳酸钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶0.034g、硼酸0.022g、硅酸钠0.004g、氟化钠0.0024g、硝酸铵0.0016g、磷酸氢二钠0.008g，溶剂为去离子水。

配方方法：按配方量称取培养基各组分，溶于去离子水，混合均匀，121℃灭菌20分钟，即得。

2、生理生化鉴定

采用biologgeniii微孔板对pt3菌株进行生理生化鉴定。将纯化的pt3菌株，取单菌落用稀释液(nacl0.4wt％，吉冷胶0.02wt％，余量为去离子水；配制：将nacl和吉冷胶溶于去离子水，121℃灭菌20分钟，用时每20ml加100μl7.66wt％巯基乙酸钠溶液)稀释至合适浊度，透光率为90～98％，将稀释液加至biology全自动生化鉴定板中，每孔加100μl，30℃培养20h后上机读数，记录读数结果，进行菌株对95种碳源的利用分析，结果见表1，鉴定结果显示，该pt3菌株为微小杆菌(exiguobacterium)。

表1pt3菌株生理生化鉴定项目及结果

注：“+”表示生长或阳性反应，“-”表示不生长或阴性反应。

3、分子鉴定

取pt3菌株纯培养菌液离心，去上清，以菌体沉淀提取基因组dna，以基因组dna为模板，利用通用引物27f/1492r(27f:5'-agagtttgatcctggctcag-3'，1492r:5'-ggttaccttgttacgactt-3')进行16srdna扩增并测序，其序列如seqidno.1所示，将测序所得到的基因组序列经blast搜索比对，该pt3菌株与exiguobacteriumsp.有较高同源性，鉴定为微小杆菌(exiguobacteriumsp.)。结合形态、生理生化特征(如表1所示)及16srdna序列分析，鉴定为exiguobacteriumsp.，将其命名为：微小杆菌(exiguobacteriumsp.)pt3。

该微小杆菌(exiguobacteriumsp.)pt3于2019年12月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：gdmccno：60923。

实施例3微小杆菌pt3最适生长条件的探究

分别研究不同ph、温度、nacl质量分数(盐度)对微小杆菌pt3生长的影响。其中，不同的温度为：20℃、25℃、30℃、37℃、43℃；不同的ph值为：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；不同的nacl质量分数为：0％、1％、2％、3％、4％、5％。

以上实验除了考察因素外，发酵条件都是将微小杆菌pt3培养液以1％(v/v)的接种量接种于lb发酵培养基中，在30℃、200rpm下培养24h后，取样测定各条件的od600值，以不接菌的lb发酵培养基作空白对照。以培养温度、ph值、nacl质量分数为横坐标，od600值为纵坐标绘制各自曲线。结果见图3-5，由图3-5可知，微小杆菌pt3能在0～5wt％的盐度下生长，为广盐性细菌，最适生长温度为25℃，最适生长ph值为8，在ph为6的情况下，该菌生长也较为迅速。其在盐度为3wt％，温度25℃，ph为8的条件下生长最好。

lb发酵培养基每升含胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，溶剂为去离子水；配制方法为：按配方量称取培养基各组分，溶于去离子水，混合均匀，121℃灭菌20分钟，即得。

实施例4微小杆菌pt3胞外分泌蛋白酶酶活测定

使用福林酚法测定蛋白酶酶活。

制作酪氨酸标准曲线：(1)以50mmol/ltris-hcl(ph8.0)为溶剂配制终浓度为1mg/ml的酪氨酸标准溶液，并稀释成10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/ml的酪氨酸溶液；(2)取各浓度液体100μl，分别加入500μl0.4mol/lna2co3溶液和100μlfolin-phenol，40℃显色10min后于660nm测吸光度，记录数据，以酪氨酸溶液浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，制作标准曲线(图2)。

细菌胞外分泌蛋白酶酶活测定：

(1)将待测菌株pt3接入蛋白酶发酵培养基，置于30℃200r/min恒温摇床振荡培养24h，得到发酵液；蛋白酶发酵培养基配制方法：称取0.3g酪素，用少许1mnaoh没润，加少许去离子水，加热至溶解；称取0.5g明胶加少许去离子水，加热至溶解；将溶化的酪素和明胶混合，用去离子水定容至20ml，调ph为8.0；在80ml人工海水中加入0.2g酵母粉，调ph为8.0，分装至每瓶40ml，分别灭菌，121℃，20min，得到培养基。接种吋，每瓶培养基中加入10ml的酪蛋白明胶混合物。

(2)分别取1ml发酵液及无菌蛋白酶发酵培养基(空白培养基)，11000r/min离心2min弃沉淀，上清即为粗酶液；

(3)分别取100μl粗酶液及处理后的空白培养基加入40℃预热的100μl2wt％的酪素溶液，40℃水浴10min；

(3)加入200μl0.4mol/l三氯乙酸(tca)终止反应，40℃保温10min；

(4)13000r/min离心3min，取100μl上清，加入500μl0.4mol/lna2co3，加入100μlfolin-phenol，40℃显色10min；

(5)以空白培养基处理管作为空白对照，于660nm测吸光度。

酶活力单位iu定义为：在以上条件下，每毫升液体酶水解酪蛋白时每分钟释放1μg酪氨酸所需要的酶量。

结果表明，本发明分离得到的微小杆菌pt3胞外分泌蛋白酶活性为25.21iu。

实施例5菌株安全性测定

以卤虫(artemiasalina)为动物模型，检测分离菌株pt3对卤虫的安全性。称取1g卤虫卵，75％v/v无水乙醇消毒处理12h，放入1000ml灭菌海水，于25℃连续充氧曝气孵化20h。取12孔板每孔随机取30尾孵化出的卤虫于2ml无菌海水中，并在室温下适应6h，每孔加入pt3菌株至终浓度1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸cfu/ml，以不加菌株的孔作为阴性对照，以加了相同浓度致病菌哈氏弧菌ncimb1280的孔作为阳性对照，所有处理设置3个重复，每隔12h，置于体表显微镜下挑出死亡的卤虫，连续观察2d，计算卤虫存活率以及其对应的半致死浓度，死亡率计算公式如下：

死亡率/％＝(每隔12h挑出的死亡数)/总卤虫数×100％

当死亡率为50％时，计算出对应的细菌浓度即为半致死计量浓度。结果见表2。

表2不同浓度筛选菌株pt3和哈氏弧菌ncimb1280感染48h卤虫存活率及半致死浓度

卤虫保护性实验结果表明，在接种感染后的48h，阴性对照组存活率为69％，试验组菌株pt3存活率最高为78％，阳性对照组哈氏弧菌ncimb1280存活率仅为2％，菌株pt3半致死浓度为1.2×10⁷cfu/ml，证实菌株pt3对养殖动物无毒。

实施例6实际养殖中，添加微小杆菌pt3后的效果

为方便观察与记录水体、对虾状态，取6个10l透明玻璃缸，每个缸配备温度计、气石、加热棒，所用物品使用前均用0.3wt％高锰酸钾溶液浸泡过夜消毒，并用干净自来水反复冲洗3遍。养殖所用海水使用海盐配制，盐度10g/l，并充分曝气分曝气2-3d。为减少对虾应激反应，将暂养海水与新配海水按1:1体积比混合作为实验起始时添加的养殖水，每个缸加入养殖海水8l，养殖过程中全天24h持续曝气，养殖水体溶解氧维持在6.10-6.40mg/l，当水体温度低于26℃时开启加热棒，保持养殖水体温度维持在26-29℃，ph7.80-8.35，每个缸放入随机捞取的10尾健康对虾个体(体长约8-9cm)。每日投喂对虾体重10％的统一对虾配合饲料。期间补充蒸发水分以保持养殖水体体积和盐度维持稳定，每天添加50％饲料重量的蔗糖作为细菌利用的碳源。

其中3个缸为对照组，正常投喂养殖；剩余3个缸为实验组，每天添加分离到的微小杆菌pt3至终浓度1×10⁶cfu/ml。准备及投喂方法如下：应在释放前3天开始准备。将冻存菌株以划线方式接种于2216e固体培养基表面，置于30℃恒温培养箱静置培养，待平板上出现单一清晰的菌落后，挑取单菌落再次划线进行活化，同样置于30℃恒温培养箱静置培养，待长出单菌落后挑取单菌落于2216e液体培养基中，30℃、200r/min摇床中培养。施放菌剂当天取样测od600，根据细菌浓度计算所需发酵液体积。取相应体积的发酵液离心去上清，施放时用养殖水将菌体重悬，与当天饲料搅拌均匀后一同投喂。养殖期间观察对虾进食及残饵及粪便情况。

结果显示：对虾进食正常，食欲旺盛。养殖第七天时，对照组与实验组养殖缸底部的残饵及粪便形态有十分显著的区别，见图6。对照组中残饵及粪便呈块颗粒状，实验组中的残饵及粪便为粉末状。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国科学院南海海洋研究所

<120>一株具有蛋白降解功能的微小杆菌pt3及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1460

<212>dna

<213>微小杆菌pt3(exiguobacteriumsp.pt3)

<400>1

aatctgccccttcgacggctggctccttgcggttacctcaccggcttcgggtgttgcaaa60

ctctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaagacccgggaacgtattcaccgcagtatgct120

gacctgcgattactagcgattccgacttcatgcaggcgagttgcagcctgcaatccgaac180

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