一种戈舍瑞林的片段法合成方法与流程

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，具体涉及一种戈舍瑞林的片段法合成方法。

背景技术：

戈舍瑞林(goserlin)是一种合成的十肽促性腺素释放激素(gnrh)强效类似物。可促使脑垂体释放黄体生成素(lh)和卵泡刺激素(fsh)，其作用比天然激素强40-200倍。戈舍瑞林由英国阿斯利康公司公司研制，于1987年在法国上市，1989年12月获fda批准上市。

戈舍瑞林的结构式为：

h-pyr⁹-his⁸-trp⁷-ser⁶-tyr⁵-d-ser⁴(tbu)-leu³-arg²-pro¹-nhnhconh2¹⁰

戈舍瑞林为缓释植入剂，是一种合成的、促黄体生成素释放激素的类似物。长期使用可抑制垂体的促黄体生成激素的分泌，从而引起男性血清睾酮和女性血清雌二醇的下降，停药后可逆。戈舍瑞林经腹部皮下注射，每次3.6mg。每28天一次，适用于激素治疗的前列腺癌、绝经前期及围绝经期的乳腺癌、子宫内膜异位症。戈舍瑞林具有几乎完全的生物利用度。每4周使用一注射埋植剂，可保持有效血药浓度，而无组织蓄积。

采用液相法合成戈舍瑞林由于操作繁杂、合成周期长而暂时未见报道。目前戈舍瑞林合成的有关专利如下：

1)片段固相法合成。专利cn201810547594a公开了3+7片段合成法，采用固相法合成两个片段，即三肽的第一片段h-arg-pro-azagly-nh2和七肽的第二片段pyr-his-trp-ser-tyr-d-ser(tbu)-leu-oh，然后偶联两个片段得到粗品。由于arg末端上有活泼胍基没有保护，存在竞争性的副反应，导致杂质难控制，影响反应收率。

2)固相逐级合成法。在专利cn201610485117a与cn201510005951a中，将戈舍瑞林依次按照氨基酸序列，将全保护的氨基酸逐一连接并裂解，再与盐酸氨基脲缩合、还原硝基物得到粗品。由于反应步骤长，产品的收率不可避免低。

3)固相液相合成法。专利cn106589072a公布了4+6的固液相合成法。即采用固液相结合得到[1-3,10]的四肽片段；固液相结合得到含d-ser(tbu)的[4-9]六肽片段；最后在液相中，将六肽片段与四肽片段缩合偶联得到粗品。该技术缺点在于：

3-a)直接采用了液相法将氨基脲偶联到四肽片段中，收率低；在片段对接中，副反应难以避免并影响产率及产品质量；3-b)另一方面，合成六肽片段的最后一步碱解，采用1n氢氧化钠水溶液，碱性反应条件太强，氨基酸消旋难以避免，将影响产品纯化难度增加，降低成品质量；3-c)最后，偶联反应中片段中的arg末端上有活泼胍基，对缩合反应的竞争影响难以避免，副反应增加，增加产品的纯化难度，并降低了产品收率。

4)液相法合成。专利us4024248公布了一种7+3的片段合成法，具体表现为将七肽片段ser-tyr-d-ser(tbu)-leu-arg-pro-azgly-nh2与三肽片段pyr-his-trp-oh在缩合剂的存在下直接缩合而成粗品；专利cn201010039547a公布了一种5+5的片段合成法，具体表现为将五肽片段d-ser(tbu)-leu-arg-pro-azgly-nh2与五肽片段pyr-his-trp-ser-tyr-oh在缩合剂的存在下直接缩合而成。该发明优势节约了固相材料费用；缺点是多步采用液相法合成，需要多个后处理操作，与固相法相比，操作麻烦，反应速度慢；且同样存在片段中的arg末端上有活泼胍基，对缩合反应的竞争影响难以避免，副反应增加，提升产品的纯化难度，并降低了产品收率。

综上所述，现有戈舍瑞林的合成方法，存在杂质多、氨基酸消旋、纯化困难、收率低等问题，尚未见比较适合工业化生产的技术方案。为此，本发明对戈舍瑞林的合成方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有合成过程中所存在的杂质多，纯度和收率低，成本昂贵，操作步骤繁琐，废液过量，不利于工业化生产的问题，提供一种戈舍瑞林合成方法。

技术方案：本发明所述的一种戈舍瑞林的合成方法，该方法采用如下工艺步骤：

(1)按照主链c端至n端的氨基酸顺序，固相合成第5-9氨基酸的片段[5-9]肽树脂，切割树脂得片段一；

(2)按照主链c端至n端的氨基酸顺序，固相合成第1-3氨基酸的片段[1-3]肽树脂，切割树脂得片段三；

(3)按照主链c端至n端的氨基酸顺序，固相合成第4氨基酸与树脂连接，完成片段二接头，即[4]肽树脂；

(4)固相法将片段二接头与片段一缩合连接，得到片段[4-9]肽树脂，切割树脂得到片段二；

(5)液相法将片段二与片段三缩合偶联，得到戈舍瑞林前体；

(6)将戈舍瑞林前体还原得到戈舍瑞林粗品；

(7)戈舍瑞林粗品经过纯化、成盐、冻干步骤得到醋酸戈舍瑞林；

所述[5-9]肽树脂与片段[1-3]肽树脂的his、trp、ser、tyr上有保护基。

进一步的，所述的ser与tyr的保护基任意选自tes、tms、tbs、dhp或tbu中的一种；所述的his与trp的保护基任意选自adoc、boc、mmt、mtt或trt中的一种，片段三中，氨基酸采用fmoc-arg(no2)-oh。

进一步的，所述的片段二接头结构式为：d-ser⁴(tbu)-2-ctcresin；

所述的片段一结构式为：pyr⁹-his⁸-trp⁷-ser⁶-tyr⁵-oh；

所述的片段二结构式为：

pyr⁹-his⁸-trp⁷-ser⁶-tyr⁵-d-ser⁴(tbu)-oh；

所述的片段三结构式为：leu³-arg²(no2)-pro¹-nhnhconh2¹⁰；

所述的戈舍瑞林前体结构式为：

pyr⁹-his⁸-trp⁷-ser⁶-tyr⁵-d-ser⁴(tbu)-leu³-arg²(no2)-pro¹-nhnhconh2¹⁰。

进一步的，戈舍瑞林的合成方法，具体步骤如下：

(1)将wang树脂加入固相反应器中，与fmoc-tyr(tbu)-oh在缩合剂的作用下进行偶联反应，然后进行fomc脱保护基反应；按照戈舍瑞林多肽序列依次连接如下氨基酸fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-his(trt)-oh、pyr-oh，得到片段[5-9]肽树脂；切割树脂即在裂解剂作用下裂解树脂后得到片段一pyr⁹-his⁸-trp⁷-ser⁶-tyr⁵-oh；

(2)将mbha氨基树脂与对硝基氯甲酸苯酯、水合肼进行依次偶联反应，然后按照戈舍瑞林多肽序列依次连接如下氨基酸fmoc-pro-oh、fmoc-arg(no2)-oh、fmoc-leu-ohnhnhconh2，得到片段[1-3]肽树脂，切割树脂即在裂解剂的作用下裂解树脂后得到片段三leu³-arg²(no2)-pro¹-nhnhconh2¹⁰；

(3)将2-氯三苯甲基树脂加入固相反应器中与氨基酸fmoc-d-ser(tbu)-oh在缩合剂的作用下偶联反应，然后进行fmoc脱保护基反应，得到片段二接头d-ser⁴(tbu)-2-ctcresin；

(4)固相法将片段二接头与片段一在缩合剂的作用下偶联，得到片段[4-9]肽树脂，切割树脂即在裂解剂的作用下裂解树脂后得到片段二；

(5)液相法将片段二与片段三在缩合剂的作用下偶联，得到戈舍瑞林前体；

(6)将戈舍瑞林前体在还原剂的作用下进行还原反应得到戈舍瑞林粗品；

(7)将戈舍瑞林粗品经过纯化、成盐、冻干得到醋酸戈舍瑞林精肽；

所述步骤(1)和步骤(2)中连接氨基酸步骤包括在缩合剂的作用下进行偶联反应、进行fomc脱保护基反应。

进一步的，所述步骤(1)到步骤(4)任意步骤中，所述缩合剂选自hatu/hobt/diea、hbtu/hobt/diea、pybop/hobt/diea、dic/hobt中的一种或多种；步骤(5)中所述的缩合剂选自hatu/hobt/diea、hbtu/hobt/diea、pybop/hobt/diea中的一种或多种。特别说明，缩合剂hatu/hobt/diea代表体系，该体系内含有hatu、hobt和diea这三种物质，其余的缩合剂也代表相同的含义。

进一步的，步骤(1)或步骤(2)中采用的裂解剂为三氟乙酸混合溶液，裂解剂体积为肽树脂质量的7～15倍；所述的三氟乙酸混合溶液为tfa、phsme、tis和水的混合溶液或为tfa、edt和水的混合溶液，体积比：tfa：phsme：tis：水＝70～97：10～1：10～1：10～1，tfa：edt：水＝90～95：1～5：1～5；步骤(4)中采用的裂解剂为三氟乙醇混合溶液，裂解剂体积为肽树脂质量的7～15倍，所述的三氟乙醇混合溶液为tfe和dcm混合容易，体积比tfe：dcm＝25:75～85。

进一步的，所述wang树脂取代度为0.4-1.5mmol/g，mbha氨基树脂的取代度为0.4-1.0mmol/g，所述2-氯三苯甲基树脂取代度为0.4-1.0mmol/g。

进一步的，所述各步骤反应中采用的溶剂选自二氯甲烷、n,n-二甲基甲酰胺、n-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜中的一种或多种组合。

有益效果：

本发明采用固相法与液相法相结合的合成方法来实现戈舍瑞林合成，其中所述的片段二、片段三容易合成与纯化，纯度高；不同片段可以同时进行合成，有效地缩短了戈舍瑞林合成时间，从而提高了制备效率；最后采用液相法对接两个片段得到戈舍瑞林前体，实现了低成本偶联，并有利于工业化放大制备。

针对现有技术中arg末端上有活泼胍基对缩合反应的有竞争性副反应并难以控制，带来了杂质多、纯化困难及收率降低等问题，本发明所采用的固液相结合的片段合成法，引入arg(no2)作为片段三中的氨基酸来源，反应条件温和，有效避免了副反应，可有效地减少缺失肽、杂质与主成份的氨基酸序列相差较多的问题；由于反应时间缩短，有助于减少异构化及氨基酸消旋问题。本发明使得产品更容易纯化，后处理操作简单，三废减少，各中间体纯度较高；

本发明所述的方法工艺稳定、制备得到的戈舍瑞林纯度可达99.5％以上，总收率较高。

附图说明

图1是本发明戈舍瑞林制备流程图。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

本发明权利要求书和说明书中所使用的缩写或英文全称的含义如下表:

实施例1

步骤(1)片段一的合成

固相反应瓶中依次加入wangreasin60.00g，600mldcm，搅拌15分钟，溶胀后抽滤得滤饼。向上述瓶中依次加入dmf120ml、fmoc-tyr(tbu)-oh(3eq，41.40g)、催化剂dmap(0.6eq，2.19g)、dic(3.0eq，11.37g)、hobt(3.0eq，12.17g)，氮气下搅拌反应2小时，抽滤得滤饼。滤饼经适量dmf洗涤，抽滤得滤饼。fmoc脱保护基反应采用pip/dmf混合溶液：滤饼用300ml20％pip/dmf溶液(dmf与pip的体积比为80：20，下同)混合，搅拌5分钟，抽滤得滤饼；再加入300ml20％pip/dmf溶液，搅拌15分钟，抽滤。滤饼用适量dmf洗涤，抽滤得滤饼。按上述方法依次缩合连接氨基酸fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-his(trt)-oh、pyr-oh并脱保护得到pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-wangresin，即片段一肽树脂。加入裂解剂600ml90％tfa(tfa：水：edt；90：5：5，体积比)溶液，搅拌3小时。抽滤，得滤液。与适量乙醚沉降、离心、洗涤得固体。该固体再经适量乙醚沉降、离心、洗涤，35℃真空干燥得20.55g片段一，89％(hplc)，质谱[m+h]⁺＝703.5

步骤(2)片段三的合成固相反应瓶中依次加入rinkamidembharesin(45.00g),600mldcm，溶胀后抽滤得滤饼。滤饼用300ml20％pip/dmf溶液混合，搅拌5分钟，抽滤得滤饼；再加入300ml20％pip/dmf溶液，搅拌15分钟，抽滤。滤饼依次经适量dmf、dcm洗涤，抽滤得滤饼。滤向上述瓶中依次加入对硝基氯甲酸苯酯(3eq，12.00g)、diea(3eq，9.00g)、300mldcm反应2小时直至kaiser试剂检测无色。抽滤，适量dcm洗涤，抽干。依次加入水合肼(6eq，15ml)、diea(4eq，10.68g)及dcm100ml反应8-12小时。抽滤。滤饼经适量dmf洗涤。向250ml反应瓶中依次加入fmoc-pro-oh(3eq，20.40g)、pybop(3eq，33.31g)、hobt(3eq，8.70g)、diea(6eq，16.13g)及dmf120ml，搅拌得溶液。将新配置溶液加入到固相反应瓶中，氮气保护下搅拌至直至kaiser试剂检测无色。抽滤得滤饼。滤饼用300ml20％pip/dmf溶液混合，搅拌5分钟，抽滤得滤饼；再加入300ml20％pip/dmf溶液，搅拌15分钟，抽滤。滤饼用适量dmf洗涤。抽滤得滤饼。按上述方法依次缩合连接氨基酸并脱保护得到片段三肽树脂。加入裂解剂600ml90％tfa(tfa：水：edt；90：5：5，体积比)溶液，搅拌3小时，抽滤，得滤液。滤液与适量乙醚混合，经沉降、离心、洗涤得固体。该固体再经适量乙醚混合，经沉降、离心、洗涤，35℃真空干燥得片段三10.68g；91％(hplc),质谱[m+h]⁺＝486.3

步骤(3)片段二接头肽树脂的合成

在固相反应瓶中加入2-ctc树脂15.00g及600mldcm，溶胀后抽滤得滤饼。依次加入fmoc-d-ser(tbu)-oh(1.5eq，6.30g)、diea(3eq，4.50g)及60mldcm反应2h。加入meoh(15ml)搅拌30min，抽滤，滤饼经适量dmf洗涤。滤饼用100ml20％pip/dmf溶液混合，搅拌5分钟，抽滤得滤饼；再加入300ml20％pip/dmf溶液，搅拌15分钟，抽滤。滤饼用适量dmf洗涤。抽滤得片段二接头肽树脂，直接用于下一步

步骤(4)片段二的合成

在上述固相反应瓶中加入片段一(7mmol,15.00g)、hatu(7mmol，7.80g)，diea(14mmol，6.30g)、hobt(0.95g)、dmf20ml反应2h，检测反应完全。抽滤，滤饼经适量dmf洗涤，抽滤得滤饼。依次加入dcm150ml、30ml乙酸酐及30ml吡啶，搅拌30min。抽滤，滤饼经适量dcm、甲醇交替洗涤，抽滤得滤饼。加入裂解剂20％tfe的dcm溶液600ml(dcm:tfe；80：20,体积比)，搅拌2小时，抽滤得滤液。滤液与适量乙醚沉降、离心、洗涤得固体。该固体再经适量乙醚沉降、离心、洗涤，35℃真空干燥得片段二8.25g，87％(hplc)，质谱[m+h]⁺＝846.1

步骤(5)戈舍瑞林前体的合成

液相反应瓶中依次加入片段二(3.00g)、diea(2.76g)、hobt(0.51g)、dmf36ml及hbtu(1.40g)，室温下搅拌1h。加入片段三(2.25g)，室温下搅拌至反应结束。缓慢加入到冰冷的乙醚420ml中，析出固体，去除溶剂；残留物与dmf30ml混合，缓慢加入到冰冷的乙醚360ml中，析出固体，去除溶剂。35℃真空干燥得白色固体4.50g，收率93％，92％(hplc)，质谱[m+h]⁺＝1315.3。直接用于下一步。

步骤(6)戈舍瑞林粗品的合成

液相反应瓶中依次加入戈舍瑞林前体(3.00g)、甲醇75ml、乙酸3ml，室温下搅拌溶清。氮气保护下加入10％钯碳0.30g。反应体系置换氢气三次，室温下搅拌至反应结束。过滤去除不溶物，滤液于35℃减压浓缩得戈舍瑞林粗品。残留物经甲醇20ml溶清，缓慢加入到冰冷的乙醚450ml中，析出固体，去除溶剂。hplc89％，质谱[m+h]⁺＝1270.2；直接用于下一步。

步骤(7)醋酸戈舍瑞林精肽的制备

称取1.50g戈舍瑞林粗品，与含10％氨水的30ml水混合，溶解。采用汉邦制备hplc系统(波长为210nm，色谱柱为c8反相柱，20m磷酸二氢铵溶液，ph3.0/乙腈为流动相)在室温下纯化，得到纯度大于99.5％的戈舍瑞林精肽溶液。将精肽溶液经制备hplc系统(色谱柱为c18反相柱，0.2％醋酸/乙腈为流动相)纯化，收集目标组分，减压浓缩，冻干得到醋酸戈舍瑞林1.20g，99.85％(hplc)，纯化收率80％，总收率32％；质谱质谱[m+h]⁺＝1270.4。

实施例2

与实施例1的不同之处在于片段一的合成

片段一的合成固相反应瓶中依次加入wang树脂60.00g，600mldcm，搅拌15分钟，抽滤得滤饼。向上述瓶中依次加入dmf120ml、fmoc-tyr(tbu)-oh(3eq，41.40g)、催化剂dmap(0.6eq，2.19g)、hbtu(3.0eq，34.14g)、hobt(3.0eq，12.17g)，diea(3.0当量，11.67g)氮气下搅拌反应2小时，抽滤得滤饼。滤饼经适量dmf洗涤，抽滤得滤饼。滤饼用300ml20％pip/dmf溶液混合，搅拌5分钟，抽滤得滤饼；再加入300ml20％pip/dmf溶液，搅拌15分钟，抽滤。滤饼用适量dmf洗涤，抽滤得滤饼；

按上述方法依次缩合连接氨基酸fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-his(trt)-oh、pyr-oh并脱保护得到pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-wangresin，即片段一肽树脂。加入用600ml90％tfa(tfa：水：edt；90：5：5，体积比)溶液，搅拌3小时。抽滤，得滤液。与适量乙醚沉降、离心、洗涤得固体。该固体再经适量乙醚沉降、离心、洗涤，35℃真空干燥得21.63g片段一，91％(hplc)，质谱[m+h]⁺＝703.3

实施例3

与实施例1的不同之处在于片段一的合成

片段一的合成

固相反应瓶中依次加入wang树脂60.00g，600mldcm，搅拌15分钟，抽滤得滤饼。向上述瓶中依次加入dmf120ml、fmoc-tyr(tbu)-oh(3当量，41.40g)、催化剂dmap(0.6当量，2.19g)、pybop(3.0eq，46.87g)、hobt(3.0eq，12.17g)，diea(3.0eq，11.67g)氮气下搅拌反应2小时，抽滤得滤饼。滤饼经适量dmf洗涤，抽滤得滤饼。滤饼用300ml20％pip/dmf溶液(dmf:pip；80：20,体积比)混合，搅拌5分钟，抽滤得滤饼；再加入300ml20％pip/dmf溶液，搅拌15分钟，抽滤。滤饼用适量dmf洗涤，抽滤得滤饼

按上述方法依次缩合连接氨基酸fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-his(trt)-oh、pyr-oh并脱保护得到pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-wangresin，即片段一肽树脂。加入裂解剂600ml85％tfa(tfa：phsme：tis：水＝85：5：5：5；体积比)溶液，搅拌3小时。抽滤，得滤液。与适量乙醚沉降、离心、洗涤得固体。该固体再经适量乙醚沉降、离心、洗涤，35℃真空干燥得19.08g片段一，92％(hplc)，质谱[m+h]⁺＝703.5。

实施例4

与实施例1的不同之处在于戈舍瑞林前体的合成

戈舍瑞林前体的合成

液相反应瓶中依次加入片段二(1.00g)、diea(0.92g)、hobt(0.17g)、dmf12ml及hatu(0.46g)，室温下搅拌1h。加入片段三(0.75g)，室温下搅拌8小时至反应结束。反应溶剂缓慢加入到冰冷的乙醚140ml中，析出固体，滤除溶剂；残留物经dmf100ml溶清，缓慢加入到冰冷的乙醚120ml中，析出固体，滤除溶剂。35℃真空干燥得白色固体1.50g，收率96％，73％(hplc)，质谱[m+h]⁺＝1315.0。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。