一种西妥昔单抗突变体及应用的制作方法

本发明涉及抗体药物技术领域，特别是涉及一种西妥昔单抗突变体及应用。

背景技术：

癌症已成为严重危害人类健康的重大疾病之一，在中国，每天有1万人确诊癌症，平均每分钟有7个人得癌症。因此抗癌药物的研发已成为国民健康的迫切需求。化疗虽然是包括手术、放疗、以及靶向疗法在内的重要的抗癌手段之一，但由于癌细胞和正常细胞之间的微小差别限制了这些抗癌化合物因为毒副作用大在临床上的广泛应用。抗体药物因其靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，具有传统化学疗法无可比拟的优势，是对抗肿瘤的重要治疗手段。过去的20年抗体药物在癌症的治疗领域发挥了重要作用，然而其治疗效果也同样受到耐药性的困扰。

人表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)是抗体药物的重要作用靶点，在许多肿瘤中有过量表达，如乳腺癌、肺癌、结直肠癌、头颈部肿瘤、膀胱癌、卵巢癌和前列腺癌等，并且egfr的过表达与预后不良、无瘤生存期缩短以及耐药性产生具有相关性。研究发现，抑制肿瘤组织中过量表达的egfr可以有效抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡、抑制转移和侵袭，所以egfr是癌症治疗的重要靶点。单克隆抗体药物则可以通过阻断egfr的同源二聚化来抑制egfr的激活，从而达到抗癌的目的。fda已经批准上市的针对egfr靶点的单克隆抗体药物包括：西妥昔单抗(cetuximab，erbitux)和帕尼单抗(panitumumab，vectibix)，其适应症为转移性结直肠癌。cetuximab是特异性egfr人鼠嵌合型单克隆抗体，panitumumab是特异性egfr全人源化单克隆抗体，二者都可与表达于正常细胞和多种癌细胞表面的egfr胞外区特异性结合，并竞争性阻断egf和tgf-α。它与egfr的结合会刺激后者的内吞降解，使egfr的表达下调，进而阻断其酪氨酸激酶磷酸化以及细胞内信号转导途径，从而抑制癌细胞的增殖，诱导癌细胞的凋亡。

然而耐药问题是单克隆抗体药物使用过程中不可避免的问题。cetuximab和panitumumab在使用时，要求患者不带有kras基因突变，否则会导致耐药。但是，近几年有不少研究人员报导，携带野生型kras基因的病患，经过cetuximab的治疗，仍然出现了耐药的情况。对于这种情况，西班牙的研究人员首先在细胞水平，进而在病人组织样本中发现，egfr胞外区第492位的丝氨酸突变为精氨酸(s492r)导致了cetuximab无法与突变后的egfr结合，即cetuximab不能阻断突变的egfr与其配体结合激活egfr下游信号通路，不能抑制肿瘤生长、增殖、侵袭及转移，从而对cetuximab产生获得性耐药的情况(montagut,c.,etal.,identificationofamutationintheextracellulardomainoftheepidermalgrowthfactorreceptorconferringcetuximabresistanceincolorectalcancer.natmed,2012.18(2):p.221-3.)。但egfr的这种突变并不在panitumumab的结合表位上，即不会产生对panitumumab的耐药。除了s492r对cetuximab耐药，研究表明egfr胞外区第465位的甘氨酸突变为精氨酸(g465r)也会导致cetuximab无法与之结合，又因为g465r的突变也在panitumumab的结合表位上，故g465r的突变对cetuximab和panitumumab同时具有耐药现象。

美国安进公司报道的一项临床三期研究aspecct，285例西妥昔单抗用药患者中46例患者检出s492r点突变，s492r的突变频率约为16％(newhallk,pricet,peetersm,etal.frequencyofs492rmutationsintheepidermalgrowthfactorreceptor:analysisofplasmadnafrommetastaticcolorectalcancerpatientstreatedwithpanitumumaborcetuximabmonotherapy.annoncol,2014,25:ii109.)。德国汉堡大学医疗中心研究人员报道9例cetuximab用药患者中2例检出g465r点突变。g465r的突变频率约为22％(braigf,m,schieferdeckera,etal.epidermalgrowthfactorreceptormutationmediatescross-resistancetopanitumumabandcetuximabingastrointestinalcancer.oncotarget,2015,6(14):12035.)。目前为克服s492r和g465r这两个高频突变的研究主要是使用非重叠表位的混合抗体，如sym004和mm-151([1]pedersen,m.w.,etal.,sym004:anovelsynergisticanti-epidermalgrowthfactorreceptorantibodymixturewithsuperioranticancerefficacy.cancerres,2010.70(2):p.588-97.[2]kearns,j.d.,etal.,enhancedtargetingoftheegfrnetworkwithmm-151,anoligoclonalanti-egfrantibodytherapeutic.molcancerther,2015.14(7):p.1625-36.)，其原理是通过避开突变位点从而结合突变的egfr。sym004是靶标为非重叠egfr抗原的两种单抗混合物，mm-151是靶标为非重叠egfr抗原的三种单抗混合物,它们都能同时与不同的egfr表位结合，且这些结合表位均避开了突变位点。但以上这些克服耐药点突变的方法是基于现有可避开突变位点的抗体，因此要从根本上解决点突变造成的抗体耐药问题，从抗体本身的结构入手进行定向改造开发二代抗体不失为一种解决因点突变造成抗体耐药的好策略。

国内外专家和学者对抗体的定向改造研究早已有之，20世纪80年代末至90年代多肽和蛋白质噬菌体展示技术的发明奠定了抗体定向改造的技术基础，2018年诺贝尔化学奖的一半被授予georgep.smith和sirgregoryp.winterb的多肽和抗体噬菌体展示技术以表彰他们对大分子蛋白定向进化所做出的贡献。噬菌体展示技术是通过将编码外源蛋白的基因序列插入构建到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因中，选择合适的插入位置并不影响外壳蛋白正常的功能活性，使外源基因表达的蛋白依附于外壳蛋白的表达而进行表达，最终使目标蛋白和外壳蛋白融合后展示在噬菌体表面。这种展示形式的蛋白可以保持相对正确的空间构想和功能活性，可以通过选择相关靶蛋白进行筛选，进而鉴定得到能够和靶蛋白进行特定结合的抗体等蛋白。利用噬菌体展示技术进行抗体定向改造首先需要利用人工合成或者扩增得到的多样化的抗体基因片段插入到噬菌体基因组中构建噬菌体展示文库，用以展示多样性的抗体片段。随后将目标抗原和构建好的噬菌体展示库进行共同孵育作用一定时间，去除未结合以及非特异性结合的噬菌体，然后洗脱下与靶蛋白特异性结合的噬菌体，将洗脱后的噬菌体感染宿主细胞进行繁殖和扩增用于下一轮的筛选，经过两轮到五轮的相同过程后，可筛选得到特异结合靶蛋白的候选抗体。然而传统的噬菌体抗体库因对抗体片段的突变位点是随机的，导致库容大，筛选工作繁琐，筛选周期长，大大降低了筛选效率，增大了筛选成本，限制了噬菌体展示技术在抗体定向改造应用中的潜力。

随着计算生物学的兴起和蛋白质结构预测的发展，基于蛋白质三维结构的模拟预测进行抗体定向改造可以有效提高抗体定向改造效率并缩短筛选周期。抗体-抗原复合物蛋白质三维结构的模拟预测是基于蛋白蛋白相互作用(protein-proteininteractions，ppi)，而ppi的研究重点通常是蛋白界面，因此对抗体和抗原结合界面的研究至关重要。rosetta是蛋白结构从头预测软件，其中interfaceanalyzer模块是用于蛋白界面分析的程序，可以计算包括dg_separated、packstat等在内的多个评价结合界面质量的指标。针对s492r和g465r点突变egfr重新设计cetuximab，首先通过计算模拟来解释实验上发现的抗原突变导致抗体亲和力下降的现象。然后用rosetta程序对抗体界面残基进行单点突变，并用interfaceanalyzer方法进行结合自由能计算。统计突变前后结合自由能差异的分布，确定有效的突变位点，根据有效突变位点建立噬菌体抗体库，对定向改造的抗体进行筛选，快速获得可克服耐药点突变的抗体，解决了抗体定向改造中时间和效益两个基本问题。

技术实现要素：

本发明为解决临床上cetuximab长期用药后因egfr发生s492r和g465r点突变而产生获得性耐药的问题，提供了一种一种西妥昔单抗突变体及应用。

针对上述问题，本发明采用计算机模拟预测，抗体-受体复合物晶体结构分析，结合噬菌体抗体展示技术定向改造cetuximab，从而获得能够克服s492r或g465r点突变的cetuximab突变体。其中能够克服s492r点突变的cetuximab突变体其抗体重链可变区氨基酸序列如seqidno.1-5所示；能够克服g465r点突变的cetuximab突变体其抗体重链可变区氨基酸序列如seqidno.6所示。

本发明中我们对cetuximab的潜在有效突变位点进行随机突变构建噬菌体展示库，用于定向改造cetuximab。我们首先利用rosetta软件预测了针对egfrs492r突变后，cetuximab的潜在有效突变位点。我们发现cetuximab轻链上的n32、w94和t96以及重链上的v50、d58和y104残基可能是较好的突变位点。我们又利用rosetta软件预测了针对egfrg465r突变后，cetuximab的潜在有效突变位点。我们发现cetuximab重链上的v50和w52残基可能是较好的突变位点。基于以上发现我们对这些位点进行定点随机突变。针对s492r突变，我们用nns简并密码子在cetuximab重链可变区cdr2区v50位，d58位，cdr3区y104位，轻链可变区cdr1区n32位，cdr3区w94位和t96位引入随机突变，以(gly4ser)3为连接子，构建cetuximab的scfv形式的突变体基因文库。针对g465r突变，我们用nns简并密码子在cetuximab重链可变区cdr2区v50位和w52位引入随机突变，以(gly4ser)3为连接子，构建cetuximab的scfv形式的突变体基因文库。利用噬菌体展示技术对scfv突变体进行展示，获得噬菌体展示文库。之后，我们利用高表达野生型，s492r或g465r突变型egfr的模型细胞筛选得到能够克服egfrs492r和g465r点突变的cetuximab的scfv形式的突变体。通过将scfv突变体中改变的氨基酸替换进入cetuximab的重链可变区中，获得cetuximab的突变体。

本发明首先提供了一种西妥昔单抗突变体，重链可变区的氨基酸序列如seqidno.1～6任一所示。

本发明又提供了编码所述西妥昔单抗突变体的基因。

本发明又提供了一种单链抗体，包括西妥昔单抗的轻链可变区和带有突变的重链可变区，带有突变的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.1～6任一所示。

本发明又提供了编码所述单链抗体的基因。

本发明又提供了一种fab片段抗体，包括西妥昔单抗的轻链、重链的ch1区和带有突变的重链可变区，带有突变的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.1～6任一所示。

本发明又提供了编码所述fab片段抗体的基因。

本发明又提供了一种(fab)2片段抗体，每一分子抗体中含有两分子的所述fab片段抗体。

本发明还提供了所述西妥昔单抗突变体、所述单链抗体、所述fab片段抗体或所述(fab)2片段抗体在制备以egfr为靶标的药物中的应用。

优选的，当重链可变区的氨基酸序列如seqidno.1～5任一所示时，egfr带有s492r突变；当重链可变区的氨基酸序列如seqidno.6所示时，egfr带有g465r突变。

优选的，所述药物针对的疾病为结直肠癌。

现有已上市针对结直肠癌的单克隆抗体药物panitumumab对egfrs492r的突变仍然有效，对egfrg465r的突变无效。本发明获得的抗体重链可变区氨基酸序列如seqidno.1～5所示的cetuximab突变体对egfrs492r有效，其中抗体重链可变区氨基酸序列如seqidno.1、2所示的cetuximab突变体效果优于panitumumab。本发明获得的抗体重链可变区氨基酸序列如seqidno.6所示的cetuximab突变体对egfrg465r有效，且效果显著。本发明获得的抗体重链可变区氨基酸序列如seqidno.1、2、6所示的cetuximab突变体仍然保持对野生型egfr的亲和力。

附图说明

图1为单克隆经iptg诱导的上清elisa筛选候选克隆结果图。

图2为抗体蛋白sds-page分析结果图。

图3为elisa检测突变体对s492r突变型egfr的亲和力检测结果图，其中hulggcontrol是作为对照的未经任何标记的非特异性igg。

图4为elisa检测突变体对g465r突变型egfr的亲和力检测结果图。

图5为elisa检测突变体对野生型egfr的亲和力检测结果图。

具体实施方式

实施例1

野生型、s492r和g465r突变型egfr高表达单克隆细胞系的构建。

野生型egfr表达质粒从北京义翘神州科技有限公司获得。通过pcr扩增野生型egfr基因序列全长(genbank号为ay888105.1，其中最后的碱基t后面还增加有ga，组成tga终止密码子)，将扩增后的egfr序列连至pmd18-t载体上，利用环状点突变pcr方法分别在egfr基因序列中引入s492r点突变(将egfr基因序列中1476c＞a)和g465r点突变(将egfr基因序列中1393g＞c)，最后将测序正确的s492r和g465r突变型egfr基因连回pcmv3真核表达载体，获得s492r和g465r突变型egfr真核表达质粒。将构建好的野生型、s492r和g465r突变型egfr表达质粒分别通过脂质体转染入小鼠成纤维细胞nih3t3(上海细胞库购得原始nih3t3细胞)，经给药筛选、流式分选后挑选出能稳定表达野生型(野生型egfr氨基酸序列如seqidno.7所示)、s492r和g465r突变型egfr蛋白的nih3t3单克隆细胞系。

高表达野生型egfr的nih3t3细胞简称wt-egfr-nih3t3细胞；

高表达s492r突变型egfr的nih3t3细胞简称s492r-egfr-nih3t3细胞；

高表达g465r突变型egfr的nih3t3细胞简称g465r-egfr-nih3t3细胞。

实施例2

野生型、s492r和g465r突变型egfr胞外区fc融合蛋白的表达、纯化。

通过pcr分别扩增野生型、s492r和g465r突变型egfr胞外区序列、humanigg1型fc段序列(也即cetuximab抗体用的fc，编码序列为编码cetuximab抗体重链基因序列的555-1347bp)，之后通过重叠pcr反应将上述两者相连，经双酶切反应后连至pmh3真核表达载体上。将连接产物转化dh5α感受态、挑单克隆菌落。所挑单克隆菌液进行测序，扩大培养测序正确的菌株并分别从中抽提质粒获得野生型、s492r和g465r突变型egfr胞外区fc融合蛋白的真核表达质粒。将野生型、s492r和g465r突变型egfr胞外区fc融合蛋白的真核表达质粒分别瞬转入hek-293f细胞中，在37℃细胞摇床内培养4天后进行蛋白纯化，获得野生型、s492r和g465r突变型egfr胞外区fc融合蛋白，

野生型egfr胞外区fc融合蛋白简称：wt-egfr-ecd-fc；

s492r突变型egfr胞外区fc融合蛋白简称：s492r-egfr-ecd-fc；

g465r突变型egfr胞外区fc融合蛋白简称：g465r-egfr-ecd-fc。

实施例3

计算机模拟预测cetuximab有效突变位点。

对蛋白-蛋白相互作用(protein-proteininteractions，ppi)的研究重点通常是蛋白界面，而对egfr-cetuximab体系的研究属于ppi研究，因此对egfr和cetuximab结合界面的研究是关键突破口。rosetta中interfaceanalyzer模块是用于蛋白界面分析的程序，可以计算包括dg_separated、packstat等在内的多个评价结合界面质量的指标。其中，dg_separated是一种类似结合能的指标，是蛋白界面分离和结合时的能量差值。我们选择该指标评价了突变对cetuximab亲和力的影响。

针对egfrs492r点突变重新设计cetuximab首先需要考虑的是能否通过计算模拟来解释实验上发现的突变导致耐药的现象。结合自由能是考察亲和力的量化指标，值越小说明结合越强，反之则越弱。因此，我们利用egfr胞外区和cetuximab复合物晶体(pdb编号为1yy9)作为初始结构，通过rosetta程序生成了100个s492r突变后的复合物结构，interfaceanalyzer方法计算所得的δδg值绝大部分分布在0到100rosettaenergyunit之间，其余少部分甚至远远超过了100rosettaenergyunit，这说明突变后cetuximab和egfr的亲和力急剧下降，与实验结论相符，表明interfaceanalyzer方法适用于对该体系的研究。根据interfaceanalyzer方法所得δδg，按δδg值从大到小排列取前30个egfrs492r-cetuximab复合物进行聚类分析，得到3类有代表性的复合物结构。确定界面残基，然后用rosetta程序对cetuximab界面残基进行单点突变，并用interfaceanalyzer方法进行结合自由能计算。统计突变前后结合自由能差异的分布，确定有效的突变位点。

通过结合界面残基突变扫描及结合自由能变化情况的统计，我们预测cetuximabc链即抗体轻链上的n32、w94和t96以及d链即抗体重链上的v50、d58和y104残基可能是较好的突变位点。

同理得到针对egfrg465r点突变重新设计cetuximab的有效突变位点为cetuximabd链即抗体重链上v50、w52位点可能是较好的突变位点。

实施例4

噬菌体展示文库的构建。

cetuximab基因序列分为轻链序列和重链序列，轻链序列如seqidno.10所示，重链序列如seqidno.11所示(其中前357个碱基为重链可变区)。

针对s492r突变，我们通过pcr用nns(n＝a，t，c，g；s＝c或者g)简并密码子在cetuximab基因序列重链可变区cdr2区v50位，d58位，cdr3区y104位，轻链可变区cdr1区n32位，cdr3区w94位和t96位引入随机突变，以(gly4ser)3为连接子，构建cetuximab的scfv形式的突变体并通过sfii和noti酶切位点连入噬菌体展示质粒pcantab-5e形成基因文库。针对g465r突变，我们通过pcr用nns简并密码子在cetuximab基因序列重链可变区cdr2区v50位和w52位引入随机突变，以(gly4ser)3为连接子，构建cetuximab的scfv形式的突变体并通过sfii和noti酶切位点连入噬菌体展示载体pcantab-5e形成基因文库。同时，我们也构建了未引入任何突变的野生型cetuximab的scfv形式的pcantab-5e质粒。之后我们分别将两个基因文库和野生型cetuximab的scfv形式的pcantab-5e质粒电转化xl1blue感受态细胞，并制备噬菌体展示文库和展示野生型cetuximab的scfv的菌株。具体步骤如下：

(1)电转杯处理：泡置于75％乙醇电转杯用100％乙醇清洗后，置于50℃烘干，4℃预冷。

(2)取质粒100ng加入至1管感受态中，加入质粒后，总体积在75-90μl之间。

(3)轻轻混匀，冰上放置5min。同时取1mlsoc培养基(2％蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.05％nacl，2.5mmkcl，10mmmgcl2，20mm葡萄糖)37℃预热。

(4)将加入连接产物的菌液转移至电转杯的空隙中总体积不能超过90μl。

(5)设置电转仪器参数：1800v电压，250ω电阻，1mm厚度电转杯以及25μf的电容。

(6)将电转杯外围水擦拭干净放入电转仪器，打开电转杯盖子，开好仪器盖子然后电击，电击完后立即加入1ml预热的soc培养基混匀。

(7)将菌液转移至15ml纱布包裹的试管中，37℃震荡培养1h。

(8)电转效率验证：37℃预热的2ty+g+a固体培养平板(1.6％蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％nacl，2％琼脂，2.5％葡萄糖，0.1mg/ml氨苄青霉素)和soc培养基，取10μl摇匀的菌液于90μlsoc培养基中，如此10倍稀释，做6个梯度。每个梯度取5μl菌液滴于平板上，做3个平行组。待液体干燥后，37℃倒置培养过夜。次日，选取可计数的某一个稀释梯度，读取克隆数，并按照稀释比例推算出电转效率。

(9)除去10μl菌液用于验证电转效率，其余菌液涂布于2ty+g+a+tet固体培养平板(1.6％蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％nacl，2％琼脂，2.5％葡萄糖，0.1mg/ml氨苄青霉素，0.05mg/ml四环素)上，待液体干燥后，37℃倒置培养过夜。

(10)涂板培养过夜约12h后，用含15％甘油的2ty培养基(1.6％蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％nacl)将平皿上的菌刮下来分装于ep管中，置于-20℃至菌液冻结后转移至-80℃保存，即为甘油菌库。

(11)从甘油菌库中取一定量的菌接种于2ty+g+a+tet培养基(1.6％蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％nacl，2.5％葡萄糖，0.1mg/ml氨苄青霉素，0.05mg/ml四环素)中。

(12)37℃200rpm/min培养>1h，使得细菌鞭毛充分表达，但同时od600应<0.5。

(13)加入辅助噬菌体，辅助噬菌体：菌数目约10：1，37℃200rpm/min超感染30-60min。

(14)超感染完之后，验证超感染效率，分别在2ty+g+a+tet固体培养平板(1.6％蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％nacl，2％琼脂，2.5％葡萄糖，0.1mg/ml氨苄青霉素，0.05mg/ml四环素)(该固体培养平板计算总菌数)和2ty+g+k+tet固体培养平板(1.6％蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％nacl，2％琼脂，2.5％葡萄糖，0.05mg/ml卡那霉素，0.05mg/ml四环素)(该固体培养平板计算超感染辅助噬菌体的菌数)做滴定，计算超感染效率(超感染效率＝感染辅助噬菌体的菌数/总菌数，应>50％)。

(15)3000×g，离心15min，去除上清，并加入上清2倍体积的2ty+a+k+tet培养基(1.6％蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％nacl，2.5％葡萄糖，0.1mg/ml氨苄青霉素，0.05mg/ml卡那霉素，0.05mg/ml四环素)，30℃，200rpm/min过夜培养。

(16)次日，10000×g，4℃，10min离心，取上清；加入上清1/5体积的peg/nacl(20％peg8000，2.5mnacl)，4℃沉淀噬菌体1h。

(17)4500×g，4℃，15min离心，去除上清。用上清1/20体积左右的灭菌，4℃遇冷的pbs(137mmnacl，2.683mmkcl，8.1mmna2hpo4，1.76mmkh2po4)重悬沉淀。

(18)12000×g，4℃，10min离心，取上清，即为噬菌体-抗体溶液。

(19)利用吸光度粗略评估噬菌体浓度(od268＝1.0对应每ml5×10¹²个噬菌体)。

(20)分装保存于-80℃，即为噬菌体展示文库。针对s492r和g465r的两个噬菌体展示文库和展示野生型cetuximab的scfv的菌株均采用上述方法制备。

实施例5

1.噬菌体抗体展示文库的筛选

(1)细胞预处理：胰酶消化nih3t3细胞，高表达野生型egfr的nih3t3细胞(wt-egfr-nih3t3细胞)和高表达s492r突变型egfr的nih3t3细胞(s492r-egfr-nih3t3细胞)或高表达g465r突变型egfr的nih3t3细胞(g465r-egfr-nih3t3细胞)，完全培养基重悬后台盼蓝染色活细胞计数。300×g，4℃，5min离心后用10ml预冷pbs重悬；各取1×10⁷的细胞进行下一步操作。

(2)非特异性筛选：取大于库容100倍的噬菌体-抗体加入1ml的封闭液于4℃下旋转混合1h。5ml封闭液加入到nih3t3细胞中，于4℃下旋转混合1h。细胞300×g，4℃，5min离心。去上清，上述含噬菌体-抗体的溶液中于4℃下旋转混合2h。300×g，4℃，5min离心，将上清转移至新的离心管中。

(3)特异性筛选：各5ml封闭液分别加入到s492r-egfr-nih3t3和g465r-egfr-nih3t3细胞中，4℃旋转混合1h。300×g，4℃，5min离心，弃上清。将(2)中得到的上清加入到封闭的s492r/g465r-egfr-nih3t3细胞中，4℃旋转2h。300×g，4℃，5min离心，弃上清。1mlpbs洗涤细胞20次。加入500μl洗脱液后放置10min左右，收集上清。在洗脱上清中加入中和液，ph调整至7.2左右。5ml封闭液加入到wt-egfr-nih3t3细胞中，4℃旋转混合1h。300×g，4℃，5min离心，弃上清。将上述中和上清加入到封闭的wt-egfr-nih3t3细胞中，4℃旋转2h。300×g，4℃，5min离心，弃上清。1mlpbs洗涤细胞20次。加入500μl洗脱液后放置10min左右，收集上清。在洗脱上清中加入中和液，ph调整至7.2左右。取10μl中和上清做滴定，并利用od268吸光度值粗略计算噬菌体浓度，随后4℃保存用于下一轮的筛选。

(4)分轮筛选：接种xl-1blue大肠杆菌10ml于2ty+g+tet培养基中，摇至od600为0.5，将(3)中筛选获得的含噬菌体的上清加入到xl-1blue大肠杆菌中，37℃200rpm/min培养1h。加入10倍于菌量的辅助噬菌体，37℃200rpm/min超感染1h。3000×g，25℃，离心10min，弃上清。加入20ml2ty+a+k+tet培养基，30℃，200rpm/min摇过夜。按照噬菌体展示库制备方法制备次级噬菌体抗体库，进行下一轮筛选。筛选方法同第一轮，筛选三轮后开始鉴定。最后一轮筛选当天，提前准备xl-1blue大肠杆菌，xl-1blue大肠杆菌摇至od600在0.1-0.5之间。将筛选获得的含噬菌体的上清加入到准备好的xl-1blue大肠杆菌中，37℃，200rpm/min培养1h。3000×g，10min离心，剩下适量的上清液重悬菌体，并涂布于2ty+g+a+tet的固体培养平板上，倒置培养过夜，挑取单克隆做后续鉴定。

2.阳性克隆的鉴定

经过三轮筛选后，利用elisa鉴定能克服egfrs492r或g465r点突变的scfv突变体，具体操作步骤如下：

(1)单克隆菌株的培养：从第三轮筛选的固体培养平板上随机挑取单克隆到含900μl2ty+g+a+tet培养基的2mlep管中，同时设置展示野生型cetuximab的scfv形式的xl-1blue菌和空白对照。ep管置于37℃，220rpm/min的培养箱中培养od600为0.5左右。

(2)iptg诱导scfv的分泌表达：3000×g，10min离心，去除上清，加入新的2ty+a+tet培养基(1.6％蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％nacl，0.1mg/ml氨苄青霉素，0.05mg/ml四环素)以及1mm的iptg，30℃，180rpm/min过夜诱导分泌表达。

(3)次日，4℃，12000×g，10min离心，取上清用于elisa和流式细胞术鉴定。

(4)抗原包被：将wt-egfr-ecd-fc和s492r-egfr-ecd-fc或g465r-egfr-ecd-fc抗原蛋白按照1μg/ml，100μl/孔包被elisa板，4℃包被过夜。

(5)封闭：弃去过夜包被的抗原，用pbst洗三次elisa板，拍干后向elisa板中加入200μl/孔的封闭液，置于37℃培养箱，孵育1h。

(6)一抗孵育：弃去elisa板中的封闭液，拍干后加入收集的诱导上清100μl/孔，置于37℃培养箱，孵育1h。

(7)二抗孵育：弃去elisa板中的一抗，用pbst清洗五次elisa板，拍干后加入100μl/孔的mouse-anti-e-tag单克隆抗体，二抗按1:1000比例稀释于1％的脱脂牛奶中，37℃孵育1h。

(8)三抗孵育：弃去elisa板中的二抗，用pbst清洗五次elisa板，拍干后加入100μl/孔的hrp-conjugated–goat-anti-mouseigg(h+l)多克隆抗体，三抗按1:1000比例稀释于1％的脱脂牛奶中，37℃孵育1h。

(9)显色：弃去elisa板中的一抗，用pbst清洗五次elisa板，拍干后加入100μl/孔的tmb显色液，37℃培养箱避光反应15-30min，使用酶标仪测定各单克隆孔在405nm处的吸光值(a405)，根据抗原孔和对照孔的信号值，确定阳性的候选突变体克隆。部分elisa的结果如图1所示，针对s492r点突变的强阳性克隆有5个，针对g465r点突变的强阳性克隆有1个。

3.cetuximab、panitumumab及cetuximab突变体的表达和纯化

通过测序，将阳性候选突变体克隆的重链可变区改变的氨基酸替换进如cetuximab的重链可变区中，构建cetuximab突变体全抗形式重链质粒。将cetuximab(轻链氨基酸序列如seqidno.8所示，重链氨基酸序列如seqidno.9所示)、panitumumab及cetuximab突变体的全抗形式重链质粒和轻链质粒瞬转入hek-293f细胞中，在37℃细胞摇床内培养4天后收集细胞培养液上清，用proteina亲和柱纯化蛋白得到cetuximab、panitumumab和重链可变区氨基酸序列如seqidno.1-6所示的cetuximab突变体，六种cetuximab突变体分别对应图2中的vy(重链可变区的氨基酸序列如seqidno.1所示，碱基序列由编码v50位的gta突变为cag、编码y104位的tac突变为gtg)、y104d(重链可变区的氨基酸序列如seqidno.2所示，碱基序列由编码y104位的tac突变为gat)、y104n(重链可变区的氨基酸序列如seqidno.3所示，碱基序列由编码y104位的tac突变为aac)、y104c(重链可变区的氨基酸序列如seqidno.4所示，碱基序列由编码y104位的tac突变为tgc)、y104v(重链可变区的氨基酸序列如seqidno.5所示，碱基序列由编码y104位的tac突变为gtg)、w52d(重链可变区的氨基酸序列如seqidno.6所示，碱基序列由编码w52位的tgg突变为gac)。对纯化收集到的cetuximab、panitumumab和6种cetuximab突变体抗体蛋白进行sds-page分析，发现在还原条件下55kda和28kda左右的位置出现了目的条带，说明成功表达了cetuximab、panitumumab和6种cetuximab突变体。

akta蛋白纯化仪操作步骤如下所述：

(1)配制proteina亲和柱纯化相关溶液，并用0.22μm滤膜过滤，除去杂质；

(2)开启akta蛋白纯化仪，设置各项参数，压力上限：0.15mpa，流速：3ml/min；

(3)将泵头放入纯水中，启动清洗程序；

(4)将proteina亲和柱装于蛋白纯化仪上，用纯水冲至平衡；

(5)依次用洗脱缓冲液和结合缓冲液冲洗柱子至平衡；

(6)上样；

(7)完成上样后，用结合缓冲液冲洗柱子至平衡；

(8)用洗脱缓冲液冲洗，收集蛋白，用sds-page鉴定蛋白纯度；

(9)依次用纯水和20％乙醇冲柱子，直至平衡；

(10)收柱子，最后在20％乙醇、4℃中保存。

目的蛋白用膜截留分子量为30kda的超滤管将溶液置换成pbs缓冲液，nanodrop测定蛋白浓度，并于-80℃保存。

4.elisa测定各cetuximab突变体亲和力

将各cetuximab突变体进行elisa检测，验证其亲和功能。elisa操作步骤如下：

(1)包被抗原：将野生型，或s492r突变型，或g465r突变型egfr胞外区fc融合蛋白用包被液稀释至1μg/ml后，每孔100μl加入96孔酶标板中，4℃过夜；

(2)洗板：甩去孔中液体，每孔加250μlpbst，轻轻震荡数次后弃去液体，重复清洗5次；

(3)封闭：每孔加入200μl的封闭液，37℃下孵育1h；

(4)孵一抗：甩去液体，每孔加入100μl从100nm起10倍梯度稀释7个浓度梯度的抗体，37℃下孵育1h；

(5)洗板5次，同步骤(2)；

(6)孵二抗：每孔加入100μl用封闭液1:250稀释的hrp标记的山羊抗人kappa轻链二抗，37℃下孵育1h；

(7)洗板5次，同步骤(2)；

(8)显色：每孔加入100μl显色液，避光37℃下孵育20-30min；

(9)终止：每孔加入100μl终止液，轻轻拍动96孔板，使液体混合均匀；

(10)读数：用酶标仪读取各孔od450值。

(11)graphpadprism5绘制亲和力曲线。

通过梯度稀释抗体浓度进行elisa亲和力检测实验，进一步比较了cetuximab、panitumumab、vy、y104d、y104n、y104c、y104v与s492r突变型egfr胞外区fc融合蛋白(s492r-egfr-ecd-fc)的亲和力，针对s492r突变型的egfr胞外区的亲和力曲线如图3所示，相比cetuximab的亲和力曲线，panitumumab、vy、y104d、y104n、y104c、y104v的亲和力曲线明显呈现出浓度依赖性，且vy、y104d效果不弱panitumumab甚至优于panitumumab。说明cetuximab不能与s492r突变型egfr的结合，panitumumab和vy、y104d、y104n、y104c、y104v这5个cetuximab突变体能与s492r突变型egfr的结合，且vy、y104d这两个cetuximab突变体效果不弱panitumumab甚至优于panitumumab。

通过梯度稀释抗体浓度进行elisa亲和力检测实验，进一步比较了cetuximab、panitumumab、w52d与g465r突变型egfr胞外区fc融合蛋白(g465r-egfr-ecd-fc)的亲和力，针对g465r突变型的egfr胞外区的亲和力曲线如图4所示，相比cetuximab和panitumumab的亲和力曲线，w52d的亲和力曲线明显呈现出浓度依赖性。说明cetuximab和panitumumab不能与g465r突变型egfr结合，w52d这个cetuximab突变体能与g465r突变型egfr的结合。

通过梯度稀释抗体浓度进行elisa亲和力检测实验，进一步验证了cetuximab、panitumumab、vy、y104d、w52d与野生型egfr胞外区fc融合蛋白(wt-egfr-ecd-fc)的亲和力，针对野生型egfr胞外区的亲和力曲线如图5所示，vy、y104d、w52d、cetuximab与panitumumab的亲和力曲线均呈现出浓度依赖性。说明vy、y104d、w52d这三个cetuximab突变体不影响与野生型egfr的结合。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种西妥昔单抗突变体及应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>119

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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151015

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202530

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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115

<210>2

<211>119

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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151015

serleuserilethrcysthrvalserglypheserleuthrasntyr

202530

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354045

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505560

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100105110

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115

<210>3

<211>119

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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151015

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202530

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100105110

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115

<210>4

<211>119

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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151015

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202530

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354045

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100105110

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115

<210>5

<211>119

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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151015

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202530

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100105110

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115

<210>6

<211>119

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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151015

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202530

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100105110

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115

<210>7

<211>1210

<212>prt

<213>智人(homosapiens)

<400>7

metargproserglythralaglyalaalaleuleualaleuleuala

151015

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202530

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354045

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100105110

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115120125

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165170175

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180185190

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195200205

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210215220

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225230235240

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290295300

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610615620

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645650655

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114011451150

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1185119011951200

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12051210

<210>8

<211>214

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

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151015

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210

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<213>人工序列(artificialsequence)

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225230235240

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275280285

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