一种ADGRG6增强子突变的核酸检测方法及其试剂盒与流程

本发明涉及核酸检测的技术领域，尤其涉及一种adgrg6增强子突变的核酸检测方法及其试剂盒。

背景技术：

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，高发年龄段为50～70岁，且男性膀胱癌发病率是女性的3～4倍。2004年世界卫生组织发布的《泌尿系统及男性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》中尿路系统肿瘤组织学分类中膀胱癌的病理类型分为尿路上皮癌、膀胱鳞状细胞癌、膀胱腺癌等。事实上，90％以上的膀胱癌患者都是膀胱尿路上皮癌，因此，通常所说的膀胱癌就是指膀胱尿路上皮癌。

膀胱癌具有分子异质性，其遗传物质含有多种单核苷酸突变，染色体易位，甚至染色体组异常等。许多原癌基因因为突变变成癌基因，在转录翻译后产生癌蛋白促进了细胞的癌变。膀胱癌中常见的突变基因有ras、ccnd、erbb2、fgfr3等。可见，通过核酸检测已知突变，对于判断肿瘤的分子类型，辅助诊断和治疗具有重要意义。

传统的核酸检测方法主要基于荧光定量pcr法，该方法能高效准确地鉴定宿主体内是否含有外源dna如细菌，病毒，真菌等；然而，其对于单碱基突变的检测，该方法在实际应用当中依然不能保持优秀的特异性；且对于是否有突变往往依赖于进一步的判断。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种adgrg6增强子突变的核酸检测方法及其试剂盒，旨在解决现有膀胱癌突变核酸检测方法对单碱基突变的特异性不高的问题。

本发明的技术方案如下：

一种adgrg6增强子突变的核酸检测方法，其中，包括步骤：

提供待测dna；

以引物对p对所述待测dna进行扩增，得到扩增产物；

将cas12a蛋白、缓冲液、crrna与fam-tttttt-bhq探针混合形成预混液；所述crrna为5'-aauuucuacuguuguagauuuguauguuuauacaaa-3'；

将所述扩增产物加入所述预混液中，进行荧光定量测量。

一种adgrg6增强子突变的核酸检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测标志物为adgrg6增强子突变，所述试剂盒包括针对所述adgrg6增强子突变设计的用于扩增待测dna的引物对p，以及由cas12a，crrna-错配蛋白、缓冲液、crrna和fam-tttttt-bhq探针构成的预混液；所述crrna为5'-aauuucuacuguuguagauuuguauguuuauacaaa-3'。

有益效果：本发明通过针对adgrg6增强子突变设计crrna，并将其与cas12a同时用于制备核酸检测用预混液，从而获得基于cas12a的adgrg6增强子突变的核酸检测方法；该预混液中的crrna与含有pam序列的靶标dna的匹配能激活cas12a非特异性切割dna的活性，该活性能剪切fam-tttttt-bhq荧光探针，fam荧光基团失去bhq淬灭基团的限制，能产生荧光信号，该信号的产生可指示被测物中是否含有能与crrna匹配的靶标dna，且该方法能够特异性区别单碱基突变；此外，该核酸检测方法具有快速、准确、简单的特点。

附图说明

图1为本发明实施方式中的一种adgrg6增强子突变的核酸检测方法的流程图。

图2为本发明实施方式中的一种adgrg6增强子突变的核酸检测方法的检测原理示意图。

图3为本发明实施例1中，一种adgrg6增强子突变的核酸检测方法对样品dna浓度大小的响应图。

图4为本发明实施例1中，一种adgrg6增强子突变的核酸检测方法的特异性的评价图。

具体实施方式

本发明提供一种adgrg6增强子突变的核酸检测方法及其试剂盒，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

参照图1，本发明实施例提供一种adgrg6增强子突变的核酸检测方法，其中，包括步骤：

s100、提供待测dna；

s200、以引物对p对所述待测dna进行扩增，得到扩增产物；

s300、将cas12a蛋白、缓冲液、crrna与fam-tttttt-bhq探针混合形成预混液；所述crrna为5'-aauuucuacuguuguagauuuguauguuuauacaaa-3'；

s400、将所述扩增产物加入所述预混液中，进行荧光定量测量。

本实施例中，不以诊断和诊疗为目的，针对adgrg6增强子突变设计crrna，并将其与cas12a同时用作制备预混液的基于cas12a的adgrg6增强子突变的核酸检测方法对单碱基突变具有特异性、灵敏度高；具有快速、准确、简单的特点。

参照图2，本实施例具体通过针对adgrg6增强子突变设计crrna，并将其与cas12a同时用于制备核酸检测用预混液；该预混液中的crrna与含有pam序列(tttn)的靶标dna(即扩增产物)的匹配能激活cas12a非特异性切割dna的活性，该活性能剪切fam-tttttt-bhq荧光探针，fam荧光基团失去bhq淬灭基团的限制，能产生荧光信号，该信号的产生可指示被测物中是否含有能与crrna匹配的靶标dna；否则，若被测物中不含有能与crrna匹配的靶标dna，则两者进行错配，错配后的中间体不能激活cas12a非特异性切割dna的活性，则不会产生荧光信号。

在一种实施方式中，所述adgrg6增强子突变为adgrg6位点chr.6:142，706，206位为g>a。进一步在一种实施方式中，所述adgrg6增强子突变可为但不限于膀胱癌adgrg6增强子突变。

在一种实施方式中，步骤s200中，所述引物对p为f：5'-ttccagcaacccccaagaaa，r:5'-cagctccactccaccaagtc-3'。

在一种实施方式中，所述扩增的方式为pcr扩增或等温扩增。进一步在一种实施方式中，所述扩增的方式为pcr扩增；所述pcr扩增包括步骤：

s201、将所述待测dna置于pcr扩增体系，于95℃进行扩增5min；

s202、然后依次按照95℃，15s；58℃，15s；72℃，15s进行扩增，重复35～45次；

s203、最后于72℃进行扩增2min。

具体地，执行步骤s201，可使所述adgrg6增强子突变进行预变性；执行步骤s203，可使得待测dna充分扩增。

进一步在一种实施方式中，pcr扩增体系(为primestar(takara公司)扩增体系)为：

在一种实施方式中，步骤s300中，所述crrna由化学合成法制备得到。进一步，所述crrna是针对adgrg6增强子突变位点chr.6:142,706,206位为g>a突变位点设计获得，并通过化学合成法制备得到。相对于采用体外转录纯化制备crrna(浓度一般小于100nm，浓度低；且易引入难除杂质，例如模板dna)，化学合成法制得的crrna的纯度高，浓度极高，为粉末状，从而可获得高含量crrna的核酸检测用预混液，这为提高核酸的检测灵敏度提供了可能。在一种实施方式中，步骤s400中，所述荧光定量测量采用荧光定量pcr法。具体地，放入荧光定量pcr仪中，设置一定的温度(如25℃、37℃)进行检测，每检测1～10min(如1min、5min、10min)采集一次fam荧光信号。根据需要设定检测时间及采集次数(如24次)。

本发明还提供一种adgrg6增强子突变的核酸检测用试剂盒，其中，所述试剂盒的检测标志物为adgrg6增强子突变，包括针对所述adgrg6增强子突变设计的用于扩增待测dna的引物对p，以及由cas12a蛋白、缓冲液、crrna和fam-tttttt-bhq探针构成的预混液；所述crrna为5'-aauuucuacuguuguagauuuguauguuuauacaaa-3'。

本实施例中，含有cas12a蛋白、crrna的试剂盒对adgrg6增强子突变的核酸检测的灵敏度高、快速；该试剂盒能够特异性区别单碱基突变，且方便携带。

在一种实施方式中，所述adgrg6增强子突变为adgrg6位点chr.6:142，706，206位为g>a；和/或

所述引物对p为f：5'-ttccagcaacccccaagaaa-3'，r:5'-cagctccactccaccaagtc-3'。

在一种实施方式中，所述缓冲液为buffer，10x。具体地，buffer，10x包括:1mnacl，500mmtris-hcl，100mmmgcl2，10mmdtt，ph7.9@25℃。

在一种实施方式中，所述crrna的浓度大于150nm。

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

(1)用tianampffpedna试剂盒(tiangenbiotech)提取样品dna，作为待测dna；

(2)用引物对p(f:5'-ttccagcaacccccaagaaa-3',r:5'-cagctccactccaccaagtc-3')对样品dna进行pcr扩增；

扩增用酶为primestar扩增体系(来源于takara公司)为：

pcr扩增步骤为：

(2.1)将所述样品dna置于pcr扩增体系，于95℃进行扩增5min，使所述adgrg6增强子突变进行预变性；

(2.2)依次按照95℃15s，58℃15s，72℃15s进行扩增，循环35次；

(2.3)于72℃进行延伸扩增2min，得到扩增产物。

(3)制备cas12a反应体系(即预混液)：

(4)将扩增产物加入预混液中，放入荧光定量pcr仪中，设置37℃恒温，进行核酸检测，1min采集一次fam信号。

(5)按照上述检测步骤，对不同浓度(1nm、2nm、5nm、10nm、20nm、50nm、100nm)的样品dna(含有adgrg6增强子突变的dna)进行检测，不同浓度样品dna的fam信号随检测时间的变化如图3所示，可知，本实施例的核酸检测方法对含有突变的adgrg6的dna具有很高的灵敏度，检测限低至2nm。

(6)按照上述检测步骤，对相同浓度(10nm或100nm)的不同类型的样品dna(突变型：即含有adgrg6增强子突变的样品dna；野生型：adgrg6增强子未发生突变的样品dna)进行检测，相同浓度的不同类型的样品dna的fam信号随检测时间侧变化如图4所示，可知，本实施例的核酸检测方法对单碱基突变具有很好的特异性。

综上所述，本发明提供一种adgrg6增强子突变的核酸检测方法及其试剂盒，本发明通过针对adgrg6增强子突变设计crrna，并将其与cas12a同时用于制备核酸检测用预混液，从而获得基于cas12a的adgrg6增强子突变的核酸检测方法；该预混液中的crrna与含有pam序列的靶标dna的匹配能激活cas12a非特异性切割dna的活性，该活性能剪切fam-tttttt-bhq荧光探针，fam荧光基团失去bhq淬灭基团的限制，能产生荧光信号，该信号的产生可指示被测物中是否含有能与crrna匹配的靶标dna，且该方法能够特异性检测单碱基突变；此外，该核酸检测方法具有快速、准确、简单的特点。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。