1.一种大肠癌多基因筛选探针,其制备方法为:
针对大肠癌高发的高危突变基因,下载基因外显子编码序列,在3’端和5’端各增加50bp的侧翼序列;ucsc数据库中基因组版本选择hg19/grch37;
利用oligowiz2.0软件处理基因序列,具体参数设定如下:-length:目标oligo优选长度为110个碱基;-lmax和-lmin:严格限定探针的长度,必须为110bp;-minlh:软件默认值为15;程序运行的结果,重定向到owz后缀命名的文件;其中seqno.1:5’-gaagcgaggatcaact-3’;seqno.2:5’-cattgcgtgaaccga-3’;获得output.owz文件;
利用oligowiz-2.1.0_offline.jar软件在windows系统下打开上述output.owz文件,选择最小探针间距为55bp,最大探针数量为无限制,其余参数都使用默认值,导出探针列表;
在探针5’端添加一条seqno.1的引物序列,3’端添加一条seqno.2的引物序列,然后合成探针。
2.如权利要求1所述的大肠癌多基因筛选探针,其特征在于其中的高危突变基因包括:体细胞突变基因,见表1,以及拷贝数变异的基因,见表2:
表1检测体细胞突变的基因列表
表2检测拷贝数变异的基因列表
3.如权利要求2所述的大肠癌多基因筛选探针,其特征在于重点关注的体细胞突变基因为:kras、nras、braf、apc、chek2、pten、smad4、tp53、akt3、ccnd1、jak2。
4.如权利要求2所述的大肠癌多基因筛选探针,其特征在于重点关注的拷贝数变异核心基因为:erbb2、fgfr1、myc、rb1。
5.一种大肠癌基因筛选的方法,包括:提取患者的dna样本,包括血液样本的dna、组织样本dna及cfdna;应用权利要求1至4所述大肠癌多基因筛选探针进行检测生物信息学分析,得到的结果与所述表1和所述表2所列的突变基因及拷贝数变异基因进行对比,得到患者的基因诊断结果。
6.如权利要求5所述一种大肠癌基因筛选的方法,具体包括如下步骤:
(1)dna样本制备
提取病人的病灶组织及癌旁或血液组织进行dna提取,石蜡包埋组织亦可;
(2)dna样本文库构建
将dna随机片段化成几百碱基或更短的小片段,然后采用kapa文库构建试剂盒进行文库制备;文库制备完成后将其置于-20℃保存;
(3)杂交捕获并测序
应用上述大肠癌多基因筛选探针,与dna文库进行杂交捕获,由捕获磁珠实现捕获dna片段,并送样测序;
(4)对测序结果进行生物信息学分析
测序结果为fastq文件,使用获取基因突变的算法,分析测序结果,得到基因突变的结果并注释;
主要步骤有fastq文件的质量控制,基因组联配,体细胞突变,及胚细胞突变,的分析,进行注释;
用到的软件分别有:fastqc和fastx_toolkit用来做质量控制;bwa做联配,gatk及mutect2获得体细胞突变;haplotypecaller方法获得胚细胞突变;annovar做注释。
(5)结果比对得到突变结果
对样本的测序结果与所述表1和所述表2中的dna筛选列表进行对比,得到该样本患者的基因突变结果。
7.一种大肠癌基因筛选的试剂盒,包含权利要求1所述大肠癌多基因筛选探针。