BLK基因在预测癌症患者预后的工具中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及blk基因在预测癌症患者预后的工具中的应用。

背景技术：

癌症是一类以不受控制的细胞增长为表现的复杂疾病，目前，癌症已是人类死亡最主要的原因之一。对癌症病人来说，化疗是一种常规的治疗手段，但是很多癌症病人接受了不必要的化疗，以乳腺癌为例，大约有有70％到80％的乳腺癌病人接收了不必要的化疗，这大大影响了癌症病人的生存质量。因此，准确预测癌症病人的预后，对于癌症病人的治疗具有指导性的意义。同时，知道癌症病人的预后以后，准确预测某种药物对该病人的药效，对个体化治疗来说至关重要。

目前医生对于癌症病人的预后判断主要是基于癌症病人的分期和分级。癌症分期指的是医生根据原发肿瘤的大小、向周围浸润的程度与范围、是否累及邻近器官、有无附近或远处淋巴结或器官转移等因素来确定肿瘤目前己发展到什么程度。当前国际上最常用的是tnm标准。该方法虽然具有一定的临床意义，但是却并不准确，同一分期的癌症病人可能具有不同的预后。

而癌症分级是组织学概念，主要包括了细胞核分级和组织学分级。细胞核分级主要是观察细胞的分化状况，通常来说分化越底，预后也越差，因此该方法根据细胞核的大小、核仁、核膜和染色质等情况将肿瘤分为1到3级。组织学分级主要是根据肿瘤细胞的细胞特征和侵润情况来做分级。目前常用的方法是将细胞核分级和组织学分级结合起来，把细胞核分裂计数，细胞核多样性和腺管形成三项指标累计计数，按照数值的高低分成i,ii,iii级，级数越高，说明远端转移风险越高，预后越差。该分级方法独立于肿瘤大小，相对于癌症分期具有更好的预后价值，但它依然不能满足实际的需要。因此对于新的癌症预后预测方法的研究迫在眉睫。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于预测子宫内膜癌等癌症患者预后的分子标志物。使用基因标志物来预测子宫内膜癌等癌症预后，具有特异性和灵敏性，在临床上具有广泛的应用前景。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测blk基因表达的产品在制备预测癌症患者预后的工具中的应用。

进一步，上面所提到的检测blk基因表达的产品包括：通过反转录pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测blk基因表达水平以预测癌症患者预后的产品。

进一步，通过反转录pcr检测blk基因表达水平以预测癌症患者预后的产品至少包括一对特异扩增blk基因的引物；通过实时定量pcr检测blk基因表达水平以预测癌症患者预后的产品至少包括一对特异扩增blk基因的引物；通过免疫检测检测blk基因表达水平以预测癌症患者预后的产品包括：与blk蛋白特异性结合的抗体；通过原位杂交检测blk基因表达水平以预测癌症患者预后的产品包括：与blk基因的核酸序列杂交的探针；通过芯片检测blk基因表达水平以预测癌症患者预后的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与blk蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与blk基因的核酸序列杂交的探针。

进一步，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。

其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测blk基因表达的产品可以应用于该平台实现对blk基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知blk基因的异常与癌症预后相关也属于blk基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测blk基因转录水平的针对blk基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的blk蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括blk基因在内的多个基因(例如，与癌症预后相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括blk蛋白在内的多个蛋白质(例如与癌症预后相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与癌症预后的标志物同时检测，可大大提高预测癌症预后的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测blk基因转录水平的试剂。

进一步，所述试剂包括使用rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测blk基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对blk基因的引物和/或探针。根据blk基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测blk基因表达水平的引物和探针。

与blk基因的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

作为本发明的基因检测试剂盒的实例，所述基因检测试剂盒包含sybrgreen聚合酶链式反应体系、用于扩增blk基因和管家基因的引物对。sybrgreen聚合酶链式反应体系包含pcr缓冲液、dntps、sybrgreen荧光染料。

上述技术方案中，pcr缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，pcr缓冲液包含：25mmkcl，2.5mmmgcl2，200mm(nh4)2so4。

本发明的基因检测试剂盒还包含rna提取试剂，rna酶提取试剂包含trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。

本发明的所述蛋白免疫检测试剂盒包括blk蛋白的特异性抗体。所述试剂盒还包括在本领域中通常用于免疫分析的工具和试剂。通常用于免疫分析的试剂包括二级抗体结合物，该二级抗体结合物与通过与基质的反应而显色的标记物结合；与所述标记物进行显色反应的显色基质溶液；清洗液；及酶反应终止液。

本发明的用于免疫分析的试剂可进一步包含含有blk标准抗原的阳性对照和含有未导入所述抗原的动物的抗血清的阴性对照组。

本发明的蛋白免疫检测试剂盒可通过抗原-抗体结合反应定量或定性分析。可通过利用常用的酶联免疫吸附分析法(elisa)、放射免疫分析法(ria)、夹心法、免疫印迹法、免疫沉淀法、免疫组织化学染色法、荧光免疫分析法、酶基质着色法、抗原抗体聚集法等来检测所述抗原-抗体结合反应。

这里使用的用于所述抗原-抗体结合反应的固定体可包括硝酸纤维素膜、pvdf膜、由聚乙烯醇树脂或聚苯乙烯树脂合成的孔板、由玻璃制成的载玻片等。

所述二抗标记物优选为用于显色反应的常用显色剂。这里使用的标记物可包含荧光素和染料，该荧光素和染料包括辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶、胶体金、聚l-赖氨酸-异硫氰酸荧光素(fitc)或罗丹明b异硫氰酸酯(ritc)。

优选地，根据进行显色反应的标记物来使用用来诱导显色的显色基质。例如，这里使用的显色基质选自3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(tmb)、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(abts)、邻苯二胺(opd)等。优选地，提供溶解于缓冲液(0.1mnaac，ph5.5)中的显色基质。用作所述二级抗体结合物的标记物的hrp分解如tmb的显色基质而形成显色沉淀物。可通过用肉眼检查所述显色沉淀物的沉淀水平来检测所述标记蛋白的存在与否。

所述清洗液优选地包含磷酸盐缓冲液、氯化钠和吐温20。优选由0.02m磷酸缓冲液、0.13mnacl和0.05％吐温20组成的缓冲液(pbst)。待抗原-抗体结合反应后，所述二抗与所述抗原-抗体结合物进行反应。在固定体中加入适当量的清洗液并清洗3～6次。这里使用的反应终止液可优选地包含硫酸溶液。

所述高通量测序平台包括检测blk基因表达水平的试剂。

所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测blk基因的转录水平。

进一步，所述blk蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述blk蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与blk蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

本发明还提供了一种用于预测癌症患者预后的工具，所述工具包括检测样本中blk基因表达来预测癌症患者预后的试剂。

进一步，所述试剂包括针对blk基因的引物和/或探针，或针对blk蛋白的特异性抗体。

用于预测癌症患者预后的blk基因及其表达产物的来源包括但不限于组织或体液，例如血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组dna或rna的体液。在本发明的具体实施方案中，用于预测癌症患者预后的blk基因及其表达产物的来源是组织。

本发明的癌症的具体实例包括，但不限于：皮肤癌如黑色素瘤、淋巴结癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌(包括子宫内膜癌)、胃肠道癌、肺癌(包括肺腺癌)、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、口腔癌、脑癌、头颈癌、咽喉癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、脾癌、肝癌、膀胱癌、喉癌、鼻道癌、甲状腺癌、成神经细胞瘤、脑膜瘤、血管外皮细胞瘤、成胶质细胞瘤、脑干胶质瘤、恶性胶质瘤、神经内分泌肿瘤、卡波济氏肉瘤、核型急性成髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、低级滤泡性淋巴瘤、转移性黑素瘤、恶性间皮瘤、恶性胸腔积液间皮瘤综合征、腹膜癌、乳头状浆液性癌、妇科肉瘤、软组织肉瘤、平滑肌肉瘤、切除性高危软组织肉瘤、waldenstrom's巨球蛋白血症、郁积性骨髓瘤、无痛性骨髓瘤、输卵管癌、平滑肌瘤。

在本发明的具体实施方案中，所述癌症包括子宫内膜癌、肺腺癌、黑色素瘤。

在本发明的上下文中，“blk基因”包括blk基因以及blk基因的任何功能等同物的多核苷酸。blk基因(chromosome8,nc_000008.11

(11493991..11564599))序列可在国际公共核酸序列数据库genebank中查询到。

在本发明的上下文中，blk基因表达产物包括blk蛋白以及blk蛋白的部分肽。所述blk蛋白的部分肽含有与癌症相关的功能域。

“blk蛋白”包括blk蛋白以及blk蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括blk蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与blk的dna杂交的dna所编码的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是blk蛋白的融合蛋白。对于与blk蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留blk蛋白的生物学活性即可。

术语“核酸”及同意义术语如“多核苷酸”指任何长度的核苷酸多聚形式，如核糖核苷酸(rna)、脱氧核糖核苷酸(dna)或肽核酸(pnas)，它们包含嘌呤碱基和嘧啶碱基，或者其他天然的、经化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。核酸可以是双链的或单链的。多核苷酸的骨架可包含糖和磷酸基团，如在rna或dna中通常所见，或者包含经修饰或取代的糖或磷酸基团。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸的序列可被非核苷酸成分所间断。术语核苷、核苷酸、脱氧核苷和脱氧核苷酸通常包括核苷、核苷酸、脱氧核苷和脱氧核苷酸的互补物、片段和变体，或者它们的类似物。多核苷酸包括通常包含2至约500个核苷酸的“寡核苷酸”。

本文所用的术语“引物”指能够与靶标核酸发生结合的单链寡核苷酸。通常，结合是选择性结合。引物的精确长度会随特定的应用而异，但通常为约15至约120个核苷酸。引物不需要反映靶标核酸模板的确切序列，但必须有足够的互补性以与模板发生结合。术语“核苷酸引物”包括“寡核苷酸引物”。

供用作引物的寡核苷酸可用本领域已知用于该用途的软件来选择。例如，oligo4.06引物分析软件(可获自nationalbiosciences，plymouth，mn)可用于选择各自最长达30-100个核苷酸的引物，和用于从最长达32千碱基的输入多核苷酸序列中分析最长达5,000个核苷酸的更大多核苷酸。类似的引物选择程序已并入了额外的特征以扩展性能。例如，primou引物选择程序(公众可从universityoftexassouthwestmedicalcenter(位于dallastx)的genomecenter获得)能够从兆碱基序列中选择特异的引物，因此可用于在基因组范围内设计引物。primer3引物选择程序(公众可从whiteheadinstitute/mitcenterforgenome5research，cambridgema获得)能让使用者输入“mispriminglibrary”，其中要避免作为引物结合位点的序列是使用者指定的。primer3对于选择微阵列用核苷酸特别有用。(后两个引物选择程序的源代码也可从它们各自的来源获得，并作修改以符合使用者的具体需要)。primegen程序(公众可从ukhumangenomemappingprojectresourcecentre，cambridgeuk获得)基于多个序列比对来设计引物，从而使得可以选择出能与所比对的核酸序列的最保守区域或最不保守区域结合或杂交的引物。因此，这个程序可用于鉴定独特和保守核苷酸以及多核苷酸片段。

如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(l)和两个相同的重链(h)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(vh)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(vl)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(fr)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个cdr相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位(参见kabat等,nihpubl.no.91-3242,卷i，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：iga，igd，ige，igg和igm，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如igg1，igg2，igg3，igg4，iga和iga2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

如本文所用，术语“分子标志物”是其在组织或细胞中的表达水平与对照细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因或蛋白。

本文包含用于检测分子标志物表达的现有技术中任何可用方法。本发明分子标志物的表达可在核酸水平上被检测(如，rna转录物)或蛋白质水平。通过“检测表达”旨在确定rna转录物或其分子标志物基因的表达产物的数量或存在。因此，“检测表达”包含一分子标志物被确定不能被表达、不能被检测表达，表达在低水平、表达在正常水平或过表达的实例。为了确定低表达，被检查的所述身体样本能够与相应的来自对照的身体样本比较。那就是说，所述表达的“正常”水平是分子标志物的表达水平，例如在来自人类主体或未被癌症折磨的病患的子宫内膜组织样本中的分子标志物表达水平。这个样本可以以标准化形式呈现。

本发明的优点和有益效果在于：(1)本发明首次证明了blk基因与子宫内膜癌、黑色素瘤、肺腺癌预后相关，因此blk基因成为了预测子宫内膜癌、黑色素瘤、肺腺癌预后的分子标志物，同时为研究子宫内膜癌、黑色素瘤、肺腺癌预后的分子机理提供新的思路。(2)利用检测基因表达的方式预测子宫内膜癌、黑色素瘤、肺腺癌预后较现有技术中的方法更加灵敏有效。

附图说明

图1显示子宫内膜癌患者的生存期图；

图2显示利用blk基因预测子宫内膜癌患者预后的roc曲线图；

图3显示黑色素瘤患者的生存期图；

图4显示利用blk基因预测黑色素瘤患者预后的roc曲线图；

图5显示肺腺癌患者的生存期图；

图6显示利用blk基因预测肺腺癌患者预后的roc曲线图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1与子宫内膜癌患者生存期相关的差异表达基因筛选

1、数据集

采用tcga数据库中发表于nature的333例子宫内膜癌患者的测序数据作为分析数据集(uterinecorpusendometrialcarcinoma(tcga,nature2013))。

2、分析方法

tcga数据库中共有52例晚期(stageiii,iv)子宫内膜腺癌患者的mrna表达水平数据，分组策略认为总生存大于5年的病例为高生存病例，共11例，认为总生存小于2年且已死亡的患者为低生存病例，共4例。采用相关r语言包(edger)获得子宫内膜腺癌长生存期患者和短生存期患者之间存在的差异表达基因(与患者总生存期的皮尔森相关系数绝对值>0.3)。在273例子宫内膜癌转录组测序数据集中对前20个差异表达基因进行患者生存分析及roc曲线分析，分析过程中以roc曲线模型为准，即具有统计学差异且曲线下面积(auc值)≥0.7认为可作为预测患者生存期长短的模型。

3、分析结果

利用作图软件，将blk基因表达量低的一组与blk基因表达量高的一组的随访得到的患者生存期(os)作为横坐标，将生存率作为纵坐标进行作图，患者生存分析结果如图1所示，高表达blk基因的子宫内膜癌患者生存期长，低表达blk基因的子宫内膜癌患者生存期短，差异具有统计学意义(p<0.001)，blk基因表达量高的患者的预后明显好于blk基因表达量低的患者，即较高的blk基因表达量与患者较好的预后密切相关。roc曲线分析结果图2和表1所示，利用blk基因预测子宫内膜癌患者生存期长短的auc值为0.710，表明blk基因可作为预测子宫内膜癌患者生存期的分子标记物。

表1roc曲线分析结果

a.在非参数式假设下；b.空值设置：true区域＝0.5

实施例2blk基因与黑色素瘤患者以及肺腺癌患者生存期相关性研究

1、数据集

采用皮肤黑色素瘤tcga泛癌数据集(skincutaneousmelanoma(tcga,pancanceratlas))及肺腺癌tcga泛癌数据集(lungadenocarcinoma(tcga,pancanceratlas))进行分析。

2、分析方法

对筛选所得子宫内膜癌高低生存患者差异表达基因blk在黑色素瘤和肺腺癌患者中进行患者生存分析及roc曲线分析，分析过程中以roc曲线模型为准，即具有统计学差异且曲线下面积(auc值)≥0.55认为可作为预测患者生存期长短的模型。

3、结果

(1)黑色素瘤

患者生存分析结果如图3所示，高表达blk基因的黑色素瘤患者生存期长，低表达blk基因的黑色素瘤患者生存期短，差异具有统计学意义(p＝0.0005)，blk基因表达量高的患者的预后明显好于blk基因表达量低的患者，即较高的blk基因表达量与患者较好的预后密切相关。roc曲线分析结果图4和表2所示，利用blk基因预测黑色素瘤患者生存期长短的auc值为0.568，表明blk基因可作为预测黑色素瘤患者生存期的分子标记物。

表2roc曲线分析结果

a.在非参数式假设下；b.空值设置：true区域＝0.5

(2)肺腺癌

患者生存分析结果如图5所示，高表达blk基因的肺腺癌患者生存期长，低表达blk基因的肺腺癌患者生存期短，差异具有统计学意义(p＝0.0043)，blk基因表达量高的患者的预后明显好于blk基因表达量低的患者，即较高的blk基因表达量与患者较好的预后密切相关。roc曲线分析结果图6和表3所示，利用blk基因预测肺腺癌患者生存期长短的auc值为0.594，表明blk基因可作为预测肺腺癌患者生存期的分子标记物。

表3roc曲线分析结果

a.在非参数式假设下；b.空值设置：true区域＝0.5

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。