本发明涉及医药领域，特别是一种鲑鱼降钙素的制备方法及其制剂及其在骨质疏松的药物中的用途。
背景技术：
：降钙素是调节钙代谢，抑制甲状旁腺素的激素之一，它能显著地降低高周转性骨病的骨钙丢失，既能抑制破骨细胞活性，同时刺激成骨细胞形成。降钙素也能抑制溶骨作用，从而使病理性升高的血钙浓度降低以及通过减少肾小管再吸收而增加尿钙、磷和血钠的排。鲑鱼降钙素对它的受体结合部位具有很高的亲和力，具有十分良好的临床效果并且比合成的哺乳类(包括人)的降钙素，作用持续的时间更长。专利cn1865283b用到的鲑鱼降钙素的合成方法均为fmoc策略固相法，主要合成步骤为：fmoc-rinkamidembha树脂脱fmoc-保护后，使用相同的缩合剂体系hbtu/hobt，按照固相合成法依次缩合各种氨基酸，得到保护的三十二肽树脂；反应过程中依次脱去fmoc保护基，脱侧链保护基及切肽同时进行，合成收率较低。专利cn103254305b使用两种缩合试剂体系：dic/hobt或者pybop/hobt，合成收率相对较高。但这两篇专利报道的合成方式，鲑鱼降钙素中杂质较大，特别是22位酪氨酸，采用叔丁基(-tbu)保护羟基，易发生保护不完全，生成大量杂质e；并且在上述缩合条件下22位酪氨酸不能与23位四元环的脯氨酸缩合完全，易生成丢失22位酪氨酸的鲑鱼降钙素杂质c；另外，17位组氨酸(his)易发生消旋，特别是在引入胺基保护剂三苯甲基(trt)或者对甲苯磺酰基(tos)等保护集团，或者采用缩合剂反应时，与相邻氨基酸缩合更易发生消旋，生成杂质f。市场需要找到一种能够减少鲑鱼降钙素中杂质的鲑鱼降钙素制备方法并需要研究出新的使用方向，本发明解决这样的问题。技术实现要素：为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种鲑鱼降钙素的制备方法及其制剂及其在骨质疏松的药物中的用途，本发明找到了制备降钙素或其组合物中杂质含量低，有利于长期存储和放置，质量稳定性好，临床疗效和安全性更好的方法，且发现鲑鱼降钙素具有治疗男性骨质疏松的新用途。为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：一种鲑鱼降钙素的制备方法，包括：对由fmoc-策略固相法制备的鲑鱼降钙素片段的22位和23位氨基酸进行缩合时使用缩合剂体系dfih/eedq，能够降低鲑鱼降钙素杂质e和杂质的c生成，dfih与fmoc-tyr(alloc)-oh的摩尔比为1-1.5；eedq与fmoc-tyr(alloc)-oh的摩尔比为0.1-0.5；鲑鱼降钙素结构如下：杂质e为23位脯氨酸(pro)与22位酪氨酸(tyr)缩合副产物；杂质e结构如下：杂质c为去22位酪氨酸(tyr)鲑鱼降钙素；杂质c结构如下：前述的一种鲑鱼降钙素的制备方法，包括如下步骤：将用fmoc-策略固相法制备的鲑鱼降钙素片段23-32位：-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂中加入fmoc-tyr(alloc)-oh、dfih、eedq和dmso，反应，氮气吹干，dmso洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的dmso溶液，15-25℃反应15-25分钟，氮气吹干，dmso洗涤，氮气吹干，得到-tyr(alloc)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂，其中dfih与fmoc-tyr(alloc)-oh的摩尔比为1-1.5；eedq与fmoc-tyr(alloc)-oh的摩尔比为0.1-0.5。一种鲑鱼降钙素的制备方法，包括：对由fmoc-策略固相法制备的鲑鱼降钙素片段的17位和18位氨基酸缩合时，使用dmso作为缩合剂，dmso与fmoc-his-oh的重量比为10-15:1，能够降低鲑鱼降钙素杂质f的生成；鲑鱼降钙素结构如下：杂质f为x＝d-his；[17-d-组氨酸]-鲑降钙素；杂质f结构如下：前述的一种鲑鱼降钙素的制备方法，包括如下步骤：将有fmoc-策略固相法(fmoc-rinkamidembha树脂)制备的鲑鱼降钙素片段(18-32位)：-lys(boc)-leu-gln(trt)-thr(tbu)-tyr(alloc)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂中加入fmoc-his-oh、dmso反应，dmso与fmoc-his-oh的重量比为10-15:1，氮气吹干，dmso洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的dmso溶液，15-25℃反应5-10分钟，氮气吹干，dmso洗涤，氮气吹干，得到-his-lys(boc)-leu-gln(trt)-thr(tbu)-tyr(alloc)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂。前述的一种鲑鱼降钙素的结合型制剂，为以降钙素为活性成分的单方制剂，单方制剂为降钙素生物学载体结合型制剂的冻干粉针；冻干粉针按照质量份数的配方为：10-50份生物学载体，1-10份缓冲离子对溶液，1-10份稳定剂，20-80份冻干保护剂。前述的一种鲑鱼降钙素的结合型制剂，冻干粉针的配方为：鲑降钙素50iu，生物学载体32微克，乙酸0.5625微克，乙酸钠0.5微克，氯化钠1.875微克，甘露醇64微克。前述的一种鲑鱼降钙素在骨质疏松的药物中的用途，鲑鱼降钙素能够用于治疗男性骨质疏松。前述的一种鲑鱼降钙素在骨质疏松的药物中的用途，使用鲑鱼降钙素能够降低骨痛，提高骨密度。本发明的有益之处在于：本发明通过使用新型缩合剂体系dfih/eedq，对22位和23位氨基酸进行缩合，发现反应快，缩合程度高，大大降低了杂质c和e；本发明在17位和18位氨基酸缩合时，只采用dmso作为溶剂，此步反应温和，缩合程度高，大大降低了鲑鱼降钙素中杂质f；本发明制备出的降钙素有利于长期存储和放置，质量稳定性好，临床疗效和安全性更好；本发明提供的降钙素制备方法中操作更简单，处理步骤更简化，经济合理，更适合车间生产；本发明制备的降钙素生物学载体结合型制剂具有治疗男性骨质疏松的新用途。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。一种鲑鱼降钙素的制备方法，包括如下步骤：将用fmoc-策略固相法制备的鲑鱼降钙素片段23-32位：-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂中加入fmoc-tyr(alloc)-oh、dfih、eedq和dmso，反应，氮气吹干，dmso洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的dmso溶液，15-25℃反应15-25分钟，氮气吹干，dmso洗涤，氮气吹干，得到-tyr(alloc)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂，其中dfih与fmoc-tyr(alloc)-oh的摩尔比为1-1.5；eedq与fmoc-tyr(alloc)-oh的摩尔比为0.1-0.5。一种鲑鱼降钙素的制备方法，包括如下步骤：将有fmoc-策略固相法制备的鲑鱼降钙素片段18-32位：-lys(boc)-leu-gln(trt)-thr(tbu)-tyr(alloc)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂中加入fmoc-his-oh、dmso反应，dmso与fmoc-his-oh的重量比为10-15:1，氮气吹干，dmso洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的dmso溶液，15-25℃反应5-10分钟，氮气吹干，dmso洗涤，氮气吹干，得到-his-lys(boc)-leu-gln(trt)-thr(tbu)-tyr(alloc)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂。鲑鱼降钙素的结合型制剂为以降钙素为活性成分的单方制剂，单方制剂为降钙素生物学载体结合型制剂的冻干粉针；冻干粉针按照质量份数的配方为：10-50份生物学载体，1-10份缓冲离子对溶液，1-10份稳定剂，20-80份冻干保护剂。生物学载体优选为含有半胱氨酸和/或二硫键的蛋白质，更优选为人血清白蛋白。降钙素制剂的制备方法：将白蛋白分散于少量注射用水中，加入缓冲离子对溶液，定容；将鲑降钙素分散于少量注射用水中，缓慢加入白蛋白溶液中，边加边搅拌，定容。制得降钙素白蛋白结合物。所得降钙素白蛋白结合物混悬液通过0.22μm的滤膜除菌过滤，得无菌品。向无菌品中加入稳定剂和冻干保护剂，进行冷冻干燥，制得降钙素白蛋白结合物冻干制剂。以下通过实验验证本发明的有益效果；对比例1按照专利cn1865283b实施例1操作步骤，详细操作过程如下所示：称取rinkamidembha树脂22克(100-200目,0.85mmol/g,18.7mmol)，用300m1dmf浸泡,使树脂充分溶胀,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹滤去六氢吡啶,用dmf、洗涤三次,氮气吹干。fmoc-pro-树脂的制备:加fmoc-pro-oh(mw337.4,74.4mmol)25.1g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250m1dmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次，氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-thr(tbu)-oh(mw:397.5,74.5mmo1)29.6g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-gly-oh(mw:297.3,74.3mmol)22.lg,tbtu(mw:321,74.5mmo1)23.9g,hobt(miw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干fmoc-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:fmoc-ser(tbu)-oh(miw:383.4,74.3mmol)28.5g,tbtu(mw:321,74.3mmo1)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmo1)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500毫升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-gly-ser(tbu)-g1y-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-g1y-oh(297.3,74.3mmo1)22.1g、tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(miw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500毫升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-thr(tbu)gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-thr(tbu)-oh(mw:397.5,74.5mmol)29.6g,tbtu(mw:321，74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250m1dmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次，氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-asn(trt)-oh(mw:596.7,74.4mmo1)44.4g，tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf.将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-g1y-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-thr(tbu)-oh(397.5,74.4mmol)29.6g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmo1)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250m1dmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-arg(pbf)-oh(mw:648.8,74.4mmo1)48.3g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmol)11.6g,nm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500毫升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-pro-oh(mw:337.4,74.4mmol)25.1g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmo1)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250m1dmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500毫升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-g1y-thr(tbu)-pro-树脂的制备：加fmoc-tyr(tbu)-oh(mw:459.5,74.4mmo1)34.2g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmo1)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250m1dmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-thr(tbu)-oh(mw:297.3,74.4mmo1)29.6g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-g1n(trt)-thr(tbu)tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-gln(trt)-oh(mw:610.7,74.4mmo1)45.4g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250m1dmf,将:混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次，氮气吹干。加入500毫升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-leu-g1n(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-leu-oh(mw:353.4,74.4mmol)26.3g,tbtu(\mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmo1)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，dmf洗涤三次，氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-his(trt)-lys(boc)-leu-gln(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-his(trt)-oh(mw:619.7,74.4mmo1)46.1g，tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(miw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-leu-his(trt)-lys(boc)-leu-gln(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-g1y-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-leu-oh(mw:353.4,74.4mmol)26.3g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmo1)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-glu(otbu)-leu-his(trt)-lys(boc)-leu-g1n(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-g1u(otbu)-oh(mw:425.5,74.4mmo1)31.7g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次，氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-gln(trt)-glu(otbu)-leu-his(trt)-lys(boc)-leu-gln(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-g1n(trt)-oh(mw:610.7,74.4mmo1)45.4g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(miw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-ser(tbu)-g1n(trt)-glu(otbu)-leu-his(trt)-lys(boc)-leu-g1n(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-g1y-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-ser(tbu)-oh(mw:383.4,74.4mmo1)28.5g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(miw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250m1dmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500毫升20％六氢吡啶的dmf溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-leu-ser(tbu)-g1n(trt)-glu(otbu)-leu-his(trt)-lys(boc)-leu-gln(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-g1y-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-leu-oh(mw:353.4,74.4mmol)26.3g,tbtu(mw:321,74.5mmo1)23.9g,hobt(iw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250m1dmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-lys(boc)-leu-ser(tbu)-gln(trt)-g1u(otbu)-leu-his(trt)-lys(boc)-leu-g1n(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-g1y-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-lys(boc)-oh(mw:468.5,74.4mmo1)34.9g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(miw:135.1,85.6mmo1)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次，氮气吹干。加入500毫升20％六氢吡啶的dmf溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-gly-lys(boc)-leu-ser(tbu)-g1n(trt)-glu(otbu)-leu-his(trt)-lys(boc)-leugln(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-g1y-oh(mw:297.3,74.4mmol)22.1g,tbtu(mw:321,74.5mmo1)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmo1)11.6g,nmm16.5ml(iw＝101.2),250mldmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-leu-gly-lys(boc)-leur-ser(tbu)-g1n(trt)-glu(otbu)-leu-his(trt)-lys(boc)-leu-g1n(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-leu-oh(mw:353.4,74.4mmol)26.3g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmo1)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-val-leu-gly-lys(boc)-leu-ser(tbu)-gln(trt)-glu(otbu)-leu-his(trt)-lys(boc)-leu-g1n(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-val-oh(mw339.4,74.4mmol)25.3g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250m1dmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-cys(trt)-val-leu-gly-lys(boc)-leu-ser(tbu)-g1n(trt)-glu(otbu)-leu-his(trt)-lys(boc)-leu-g1n(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-cys(trt)-oh(mw:585.7,74.4mmo1)43.6g,tbtu(mw:321,74.5mmo1)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmo1)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250m1dmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-thr(tbu)-cys(trt)-val-leu-gly-lys(boc)-leu-ser(tbu)-g1n(trt)-g1u(otbu)-leu-his(trt)-lys(boc)-leu-gln(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly--ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-thr(tbu)-oh(mw:397.5,74.4mmo1)29.6g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-ser(tbu)-thr(tbu)-cys(trt)-val-leu-gly-lys(boc)-leu-ser(tbu)-gln(trt)-glu(otbu)-leu-his(trt)-lys(boc)-leu-g1n(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-ser(tbu)-oh(mw:383.4,74.4mmo1)28.5g,tbtu(mw:321,74.5mmo1)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmo1)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250m1dmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-leu-ser(tbu)-thr(tbu)-cys(trt)-val-leu-gly-lys(boc)-leu-ser(tbu)-g1n(trt)-glu(tbu)-leu-his(trt)-lys(boc)-leu-gln(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-leu-oh(mw:353.4,74.4mmol)26.3g,tbtu(mw:321,74.5mmol)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmo1)11.6gnmm16.5ml(mw＝101.2),250m1dmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-asn(trt)-leu-ser(tbu)-thr(tbu)-cys(trt)-val-leu-gly-lys(boc)-leu-ser(tbu)-gln(trt)-glu(otbu)-leu-his(trt)-lys(boc)-leu-g1n(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-g1y-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-asn(trt)-oh(mw:596.7,74.4mmo1)44.4g,tbtu(mw:321,74.5mmo1)23.9g,hobt(iw:135.1,85.6mmo1)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250mldmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次，氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-ser(tbu)-asn(trt)-leu-ser(tbu)-thr(tbu)-cys(trt)-val-leu-gly-lys(boc)-leu-ser(tbu)-g1n(trt)-glu(otbu)-leu-his(trt)-lys(boc)-leu-gln(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-g1y-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-ser(tbu)-oh(mw383.4,74.4mmo1)28.5g,tbtu(mw:321,74.5mmo1)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250m1dmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次,氮气吹干。加入500亳升20％六氢吡啶的dmf溶液,25℃振摇30分钟。氮气吹干,用dmf洗涤六次,氮气吹干。fmoc-cys(trt)-ser(tbu)-asn(trt)-leu-ser(tbu)-thr(tbu)-cys(trt)-va1-leu-gly-lys(boc)-leu-ser(tbu)-gln(trt)-glu(otbu)-leu-his(trt)-lys(boc)-leu-g1n(trt)-thr(tbu)-tyr(tbu)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂的制备:加fmoc-cys(trt)-oh(mw:585.7,74.4mmo1)43.6g,tbtu(mw:321,74.5mmo1)23.9g,hobt(mw:135.1,85.6mmol)11.6g,nmm16.5ml(mw＝101.2),250m1dmf,将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干,dmf洗涤三次，氮气吹干。甲醇洗涤三次。抽干后,放入真空干燥器中干燥,称重,得保护的32肽树脂约80g(mw＝3434,17.47mmol),接肽总收率约为:93.5％。切肽:取80g保护的32肽树脂转移到茄形瓶中,冷却下加入切肽试剂:(tfa/tis//edt/h20＝900ml/40m1/25ml/10),25-30"c搅拌2小时。过滤,抽干,滤液加无水乙醚沉淀，过滤收集沉淀得约55g还原型鲑鱼降钙素粗品。粗品收率为86.1％。氧化(二硫键的形成)将55g鲑鱼降钙素粗品溶于55000ml水，在搅拌下缓慢加入加氨水调ph至7.5-10.0,反应温度30-35℃,氧化24小时,过滤。纯化滤液分批经c18柱(10×300mm)纯化,流动相:0.1mnh4ac:乙腈(72:28)；流速为:300m1/min；检测波长为:280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液。样品峰合并后去盐除乙腈、冻干,约得11g白色疏松块状物成品。收率17.2％(以rinkamidembha-树脂的18.7mmol计)。实施例1鲑鱼降钙素22位与23位、17位与18位缩合操作步骤如下，其他片段合成参考对比例1。(1)鲑鱼降钙素22位与23位缩合操作步骤：-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂中加入fmoc-tyr(alloc)-oh(mw：487.51,74.4mmol)36.3g，dfih23.4g(mw：262.11,89.3mmol)、eedq1.8g(mw：247.29,7.44mmol)和250gdmso，反应，氮气吹干，dmso洗涤三次，氮气吹干；加入300g25％的六氢吡啶dmso溶液，20℃反应20分钟，氮气吹干，dmso洗涤三次，氮气吹干，得到-tyr(alloc)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂。(2)鲑鱼降钙素17位与18位缩合操作步骤：-lys(boc)-leu-gln(trt)-thr(tbu)-tyr(alloc)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂中加入中加入fmoc-his-oh(mw：377.39,74.4mmol)28.1g，421.5gdmso反应，氮气吹干，dmso洗涤三次，氮气吹干；加入300g25％的六氢吡啶dmso溶液，20℃反应10分钟，氮气吹干，dmso洗洗涤，氮气吹干，得到：-his-lys(boc)-leu-gln(trt)-thr(tbu)-tyr(alloc)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂。实施例2鲑鱼降钙素22位与23位缩合操作步骤如下，其他片段合成参考对比例1。鲑鱼降钙素22位与23位缩合操作步骤：-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂中加入fmoc-tyr(alloc)-oh(mw：487.51,74.4mmol)36.3g，dfih29.3g(mw：262.11,111.6mmol)、eedq9.2g(mw：247.29,37.2mmol)和250gdmso，反应，氮气吹干，dmso洗涤三次，氮气吹干；加入300g25％的六氢吡啶dmso溶液，20℃反应20分钟，氮气吹干，dmso洗涤三次，氮气吹干，得到-tyr(alloc)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂。实施例3鲑鱼降钙素17位与18位缩合操作步骤如下，其他片段合成参考对比例1。鲑鱼降钙素17位与18位缩合操作步骤：-lys(boc)-leu-gln(trt)-thr(tbu)-tyr(alloc)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂中加入中加入fmoc-his-oh(mw：377.39,74.4mmol)28.1g，337.2gdmso反应，氮气吹干，dmso洗涤三次，氮气吹干；加入300g25％的六氢吡啶dmso溶液，20℃反应10分钟，氮气吹干，dmso洗涤，氮气吹干，得到-his-lys(boc)-leu-gln(trt)-thr(tbu)-tyr(alloc)-pro-arg(pbf)-thr(tbu)-asn(trt)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-gly-thr(tbu)-pro-树脂。(3)其他片段的合成参考实施例1，制备鲑鱼降钙素。用降钙素制备降钙素冻干粉剂；本发明的注射剂，为粉针剂，是由药学上可接受但无配伍禁忌的生物学载体与降钙素结合而得到的无菌冻干制剂。实验一，杂质验证实验；采用实施例1-3制备的降钙素，按照
发明内容提到的制备方法和如下处方，制备相应的降钙素冻干粉针a、b、c制剂。处方：微克/支降钙素冻干粉剂对比例1采用对比例1制备的降钙素，按照
发明内容提到的制备方法和如下处方，制备相应的降钙素冻干粉针。处方：微克/支按照2015版药典鲑鱼降钙素项下方法测定实施例1-3制得的鲑鱼降钙素和对比例1制得的鲑鱼降钙素的含量、杂质e、c和f，结果如下：实验二，稳定性考察；采用实施例1-3得到的制剂a、b、c，及对降钙素冻干粉剂对比例1得到的制剂放置加速条件(40±5℃，75±10％rh)进行6个月的稳定性考察。所得结果如下表所示，证明制剂a的稳定性优于其他制剂，经实施例1-3制备的制剂a、b、c优于对比例。实验三，骨质疏松的新用途验证实验；实施例1-3中制得的制剂a进行临床试验，选定患有骨质疏松的男性患者50例进行研究。全部患者符合以下标准：1、经骨密度仪检查存在骨质疏松，骨密度低于健康年轻同性均值2.0-2.5个标准；2、存在不同程度的腰背部疼痛，所有患者均能合作评价疼痛程度。评价指标：1、骨密度(bmd)的测量；2、临床症状观察：骨痛程度。实验组:50iu制剂a进行肌肉注射，1次/d，连用两周改为隔日1次；同时联合口服钙剂，600mg,1次/d，连续使用3个月。评价骨痛控制情况及测量骨密度变化。对照组：肌肉注射氯化钠或葡萄糖为安慰剂，联合口服钙剂，600mg,1次/d，连续使用3个月。评价骨痛控制情况及测量骨密度变化。评价标准1、治疗后疼痛控制评价标准：2、骨密度测定：经双能x射线骨密度测定仪测定两组治疗前后腰椎骨密度值变化。3、统计学处理：实验数据采用x2检验比较两组间的差异，以p＜0.05为有显著性差异。经统计，治疗后疼痛控制结果如下：组别有效无效实验组223对照组520实验组中疼痛缓解率为22/25*100＝88％，对照组中疼痛缓解率为5/25*100＝20％，两组比较p＜0.01有显著性差异。经统计，两组治疗前后腰椎骨密度比较(g/cm2,x+sd)结果如下：组别治疗前治疗后实验组0.607±0.1200.668±0.115对照组0.602±0.1050.601±0.115实验组腰椎骨密度均值在治疗后3个月有显著提高，p＜0.01有显著性差异；而对照组p＞0.05无显著性差异。由以上几个实验结果发现通过使用新型缩合剂体系dfih/eedq，对22位和23位氨基酸进行缩合，发现反应快，缩合程度高，大大降低了杂质c和e；另外17位和18位氨基酸缩合时，我们只采用dmso作为溶剂，由于dmso有一定的活化作用，我们不使用其他缩合剂，并且17位组氨酸胺基未保护，经过此种方式，取得了很好的效果，此步反应温和，缩合程度高，鲑鱼降钙素中杂质f大大降低。本发明还提供了上述降钙素制剂、降钙素复方制剂治疗男性骨质疏松的新用途。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。当前第1页12