一种牡丹类2S白蛋白及其提取方法和应用与流程

本发明属于蛋白质技术领域，具体涉及一种牡丹类2s白蛋白及其提取方法和应用。

背景技术：

牡丹为芍药科(paeoniaceae)芍药属(paeonia)落叶灌木，广泛分布于河南、山东、安徽、四川、浙江等地，牡丹全身是宝，其根皮、花、叶、种子等均可被应用。牡丹籽是牡丹的种子，是一味常用中药材，牡丹籽含有芍药苷等多种活性成分，具有抗菌、消炎、镇静、镇痛、降血糖、抗过敏及免疫调节等多种药理作用。牡丹籽含油量丰富，2011年3月国家卫生部批准凤丹和紫斑牡丹籽油为新资源食品，我国油用牡丹种植面积急剧扩大，牡丹籽产量逐年提高，油脂提取后产生大量的牡丹籽粕，牡丹籽粕蛋白含量约25％。目前这些牡丹籽粕主要作为饲料原料或食用菌培养基基料，综合开发利用水平较低。

2s白蛋白是广泛分布于双子叶植物中的水溶性种子贮藏蛋白，富含精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸的。通常，2s白蛋白的分子质量在12～15kda之间，这些分子主要是由两条多肽链组成，较短的肽链分子量在3～5kda之间，较长的肽链分子量在8～10kda之间。尽管2s白蛋白在亚基结构和合成上存在差异，但它们被认为是结构上同源的紧密球状蛋白，大多数2s白蛋白具有8个保守的半胱氨酸残基骨架(cxncxnccxncxcxncxnc)，形成了4个二硫键，包括2个链间二硫键和2个链内二硫键，使得这些蛋白质的结构非常稳定和紧密。除了保守的半胱氨酸外，2s白蛋白的氨基酸序列的同源性在植物内部和植物之间相对较低。体外研究发现，2s白蛋白家族成员具有多种功能，如翻译抑制、抗菌、消化酶抑制剂和植物防御功能等。除了具有生化活性外，2s白蛋白已被用作生物活性肽合成的载体，并通过增加必需氨基酸的含量来改善粮食作物的营养特性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种牡丹类2s白蛋白，以及该蛋白的提取方法，并为该蛋白提供一种新的应用。

针对上述目的，本发明提供的牡丹类2s白蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，其提取方法由下述步骤组成：

1、脱脂处理

将牡丹籽或牡丹籽粕粉碎成粉后，以料液比为1:4～1:6g/ml加入正己烷进行脱脂，得到牡丹籽脱脂粉或牡丹籽粕脱脂粉。

2、pbs缓冲液浸提

按料液比为1:6～1:16g/ml，向步骤1所得牡丹籽脱脂粉或牡丹籽粕脱脂粉中加入0.01～0.02mol/lph7.0～7.5的pbs缓冲液，在0～4℃下提取10～14h，提取完后匀浆60～180s，离心分离取上清液，得到蛋白提取液。

3、硫酸铵法分步沉淀粗蛋白

向步骤2所得蛋白提取液中添加硫酸铵至饱和度为20％，0～4℃下静止1.5～2h，然后离心分离取上清液；向上清液中继续添加硫酸铵至饱和度为40％，0～4℃下静止1.5～2h，然后离心分离取上清液；再向上清液中继续添加硫酸铵至饱和度为60％，0～4℃下静止1.5～2h，离心分离弃去上清液，获得粗蛋白。

4、粗蛋白透析除盐

将步骤3中所得粗蛋白用0.01～0.04mol/lph6.5～7.5的pbs缓冲液在0～4℃下透析除盐后真空冷冻干燥。

5、deae阴离子交换层析

将步骤4中冷冻干燥后的蛋白用0.01～0.04mol/lph7.0～7.5的pbs缓冲液溶解后，用0.45μm滤膜过滤，然后用deae阴离子交换色谱柱纯化，纯化条件为：先以3～4倍柱体积的0.01～0.04mol/lph7.0～7.5的pbs缓冲液平衡色谱柱，然后进行梯度洗脱，流动相a为0.01～0.04mol/lph7.0～7.5的pbs缓冲液，流动相b为含有0.5～1.0mol/lnacl的0.01～0.04mol/lph7.0～7.5的pbs缓冲液，洗脱梯度选择a:b由100:0到85:15到0:100，收集a:b＝85:15的洗脱液，用3000～3500da超滤管脱盐浓缩，真空冷冻干燥，得到牡丹类2s白蛋白。

上述步骤2中，优选按料液比为1:8～1:10g/ml，向步骤1所得牡丹籽脱脂粉或牡丹籽粕脱脂粉中加入0.015mol/lph7.0的pbs缓冲液，在4℃下提取12h，提取完后匀浆80～140s，离心分离取上清液，得到蛋白提取液。

上述步骤4中，优选将步骤3中所得粗蛋白用0.01～0.04mol/lph7.0～7.5的pbs缓冲液溶解，移入分子量为3000～3500da的透析袋，在0.01～0.04mol/lph7.0～7.5的pbs缓冲液中透析12～24h，透析温度为0～4℃，透析过程中换缓冲液3～4次；然后将透析除盐后的蛋白真空冷冻干燥。

上述步骤5中，优选将步骤4中冷冻干燥后的蛋白用0.01～0.02mol/lph7.0～7.5的pbs缓冲液溶解后，用0.45μm滤膜过滤，然后用deae阴离子交换色谱柱纯化，纯化条件为：先以3～4倍柱体积的0.01～0.02mol/lph7.0～7.5的pbs缓冲液平衡色谱柱，然后进行梯度洗脱，流动相a为0.01～0.02mol/lph7.0～7.5的pbs缓冲液，流动相b为含有0.8～1.0mol/lnacl的0.01～0.02mol/lph7.0～7.5的pbs缓冲液，洗脱梯度选择a:b由100:0到85:15到0:100，收集a:b＝85:15的洗脱液，用3000～3500da超滤管脱盐浓缩，真空冷冻干燥。

本发明牡丹类2s白蛋白具有一定的抗氧化活性，可作为抗氧化剂应用。

本发明基于硫酸铵盐析、离心、透析、deae阴离子交换色谱分离纯化出了一种高纯度的牡丹类2s白蛋白(ps-2s-alb)。再通过sds-page电泳初步测定其分子量和纯度；同时采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)进一步确定其分子量；以及采用denovosequencing对目标蛋白进行从头测序，采用多重酶解，具体酶切顺序依次为胰蛋白酶酶、糜蛋白酶、葡萄球菌蛋白酶和蛋白内切酶，同时采用高分辨质谱检测(obitrapfusionlumos)，利用不同酶切肽段之间的互补性实现蛋白分子100％全序列的拼接。经数据库检索匹配发现该蛋白与2s白蛋白家族具有较高的同源性(27％～32％)，而且与2s白蛋白家族成员的8个保守半胱氨酸完全匹配。

本发明相对现在技术的有益效果是：

1、本发明采用温和的条件提取蛋白，操作过程不经过蛋白变性，保持了蛋白本身良好的活性。

2、本发明采用简单的层析技术分离纯化、工艺简单，纯化得到的牡丹类2s白蛋白纯度很高，可以达到95％以上。

3、本发明牡丹类2s白蛋白具有一定的抗氧化活性，对dpph自由基、羟自由基、abts自由基均具有一定的清除能力，其清除能力随浓度的增加而加大，并且对羟基自由基的清除能力要明显强于相同浓度的抗坏血酸。

附图说明

图1是实施例1中粗蛋白和deae阴离子交换层析纯化得到的各洗脱液的sds-page电泳图，其中m是mark分子量范围(10～180kda)，1是透析除盐后的粗蛋白；2是a:b＝100:0洗脱峰，3是a:b＝85:15洗脱峰，4是a:b＝0:100洗脱峰。

图2是牡丹类2s白蛋白的质谱图。

图3是牡丹类2s白蛋白的总离子流色谱图。

图4是qqqqcaqqvqrqdlalceqflnqdhqqq肽段的ms/ms图谱。

图5是eqflnqdhqqqlrlrs肽段的ms/ms图谱。

图6是skggnqqqaeel肽段的ms/ms图谱。

图7是gqccqqlsqlrdhgcrcaalsqlvryqve肽段的ms/ms图谱。

图8是aeqlpvmcqvgqacelgl肽段的ms/ms图谱。

图9是lglga肽段的ms/ms图谱。

图10是牡丹类2s白蛋白与2s白蛋白家族序列匹配结果。

图11是牡丹类2s白蛋白对dpph自由基清除率。

图12是牡丹类2s白蛋白对羟基自由基清除率。

图13是牡丹类2s白蛋白对abts自由基清除率。

图14是牡丹类2s白蛋白对frap还原力。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

1、脱脂处理

将牡丹籽粕用高速粉碎机粉碎成粉后，以料液比为1g:5ml加入正己烷进行脱脂，搅拌30min后抽滤，重复两次，合并滤液，减压蒸馏回收正己烷，将得到的牡丹籽粕脱脂粉于25℃干燥。

2、pbs缓冲液浸提

取20g牡丹籽粕脱脂粉，加入160ml0.015mol/lph值为7.0的pbs缓冲液，在4℃下提取12h，提取完后用高速匀浆机匀浆120s，然后以4000r/min离心30min后取上清液，得到蛋白提取液，其中蛋白的提取率为38.57％。

3、硫酸铵法分步沉淀粗蛋白

向步骤2所得蛋白提取液中添加硫酸铵至饱和度为20％，4℃下静止2h，然后以12000r/min离心20min取上清液；向上清液中继续添加硫酸铵至饱和度为40％，4℃下静止2h，以12000r/min离心20min取上清液；向上清液中继续添加硫酸铵至饱和度为60％，4℃下静止2h，以12000r/min离心20min，弃去上清液，获得粗蛋白。

4、粗蛋白透析除盐

将步骤3中所得粗蛋白用0.02mol/lph7.0的pbs缓冲液溶解，移入分子量为3000da的透析袋，在0.02mol/lph7.0的pbs缓冲液中透析24h，透析温度为4℃，透析过程中每隔8h更换缓冲液1次，共更换缓冲液3次。然后将透析除盐后的蛋白真空冷冻干燥。

5、deae阴离子交换层析

将步骤4中冷冻干燥后的蛋白用0.02mol/lph7.0的pbs缓冲液溶解后，用0.45μm滤膜过滤；然后用deae阴离子交换色谱柱纯化，纯化条件为：先以3～4倍柱体积的0.02mol/lph7.0的pbs缓冲液平衡色谱柱，然后进行梯度洗脱，流动相a为0.02mol/lph7.0的pbs缓冲液，流动相b为含有0.8mol/lnacl的0.02mol/lph7.0的pbs缓冲液，洗脱梯度选择a:b由100:0到85:15到0:100，分别收集各洗脱液用sds-page电泳检验，结果如图1所示。由图1可得，a:b＝85:15部分蛋白纯度很高，可以达到95％以上。将a:b＝85:15的洗脱液用3000da超滤管脱盐浓缩，真空冷冻干燥，得到目标蛋白0.86g。

将图1中泳道3的目标蛋白条带挖点，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)测定其分子量，测定条件为：电喷雾离子源esi正离子模式poshivemode，加速电压为20.00kv，质量扫描范围为10～60kda；分辨率～20000，测得目标蛋白的分子量为12.75kda，结果如图2。

为了得到12.75kda蛋白质的分子信息采用lc-ms-ms方法进行质谱鉴定，具体测定方法如下：

(1)酶解

使用胰蛋白酶酶解目标蛋白的胶条，然后将酶解液溶于样品溶解液(含0.1vol％甲酸和2vol％乙腈的水溶液)中溶解，充分振荡涡旋，13200rpm，4℃离心10min，取15ml上清转移到上样管中，进行质谱分析。

(2)lc-ms-ms分析

色谱条件为：选用毛细管高效液相色谱仪，流动相a：含0.1vol％甲酸和2vol％乙腈的水溶液，流动相b：含0.1vol％甲酸和80vol％乙腈的水溶液，流速：300nl/min；梯度洗脱条件为：0→1min，6％b；2→8min，9％b；9→24min，14％b；25→60min，30％b；61→75min，40％b；76→78min，95％b。

质谱条件为：正离子模式；参考质荷比为350-1800mz；分辨率为70000。质谱采集数据生成raw文件，使用xcalibur打开，可以得到总离子流色谱图如图3，从图中可看出，整个样品经过液相色谱的高效分离后，在质谱中鉴定到的蛋白数量与丰度较大。将质谱原始文件使用maxquant(1.6.2.10)检索uniprot数据库，对比blast，鉴定结果如表1所示，uniprot数据库检索发现得分最高的是牡丹库的热休克蛋白，分子量为71.253kda，但是覆盖率太低只有4％，而且分子量与目标蛋白相差太大，结果不匹配。而与热休克蛋白得分一样的是牡丹库中的聚泛素蛋白，分子量为18.588kda，覆盖率为19.3％，但是丰度为0，所以这一匹配结果也不可信。通过搜库在数据库中未匹配到可信的蛋白，在数据库中还未被收录，因此对目标蛋白近一步从头测序鉴定。

表2蛋白lc-ms/ms鉴定

将目标蛋白采用多重酶解处理，酶解处理后的肽段进行液相色谱分离(rplc)和高分辨质谱检测(obitrapfusionlumos)，利用蛋白序列分析软件peaksmassspectrometrysoftware进行数据分析，通过从头测序法分析重叠多肽，从分析得到的多肽中自动组装蛋白序列，实现蛋白分子100％全序列的拼接。具体方法如下：

(1)多重酶解

胶粒脱色：将目标蛋白条带切成1mm³的胶粒，分别装入1.5mlep管中。以乙腈和50mmol/l碳酸氢铵水溶液体积比为1:1的混合溶液作为脱色液脱色，脱色10～30min后吸出脱色液，重复此操作至胶粒无色。

胶粒脱水：向无色胶粒中加入100μl乙腈，放置30min，待胶粒呈白色团状，弃去乙腈，室温放置干燥。

还原烷基化：按照100μl/管向脱水后的胶粒中加入10mmol/ldtt于56℃水浴中还原1h，吸出dtt弃去。按照100μl/管加入55mmol/liaa，暗处室温反应1h，吸出iaa弃去，用脱色液洗一遍，吸出脱色液弃去，加入100μl乙腈，放置30min，待胶粒呈白色团状，弃去乙腈，室温放置干燥。

胰蛋白酶(trypsin)酶切：按照10μl/管的量向还原烷基化后的胶粒中加入15ng/μl胰蛋白酶溶液(用25mmol/l碳酸氢铵水溶液稀释)，放入4℃冰箱孵育40min，取出后每管补加10μl25mmol/l碳酸氢铵水溶液，密封置于37℃水浴中酶切16h。然后按照100μl/管向ep管中加提取液(三氟乙酸与乙腈、水体积比为5:50:45的混合溶液)，37℃水浴1h后，超声5min，离心5min，将提取液移入另一新ep管中，重复提取一次，将提取液合并，真空离心干燥。肽段用样品溶解液(含0.1vol％甲酸和2vol％乙腈的水溶液)溶解，充分振荡涡旋，13200rpm，4℃离心10min，上清转移到上样管中，进行质谱分析。

糜蛋白酶酶切(chymotrypin)：按照10μl/管的量向胰蛋白酶酶切后的ep管中加入25ng/μl的糜蛋白酶溶液(用100mmol/lph8.0的tris-hcl缓冲液稀释)，放入4℃冰箱孵育40min，取出后每管补加10μl100mmol/lph8.0的tris-hcl缓冲液，密封置于37℃水浴中酶切16h。然后按照100μl/管向ep管中加提取液(三氟乙酸与乙腈、水体积比为5:50:45的混合溶液)，37℃水浴1h后，超声5min，离心5min，将提取液移入另一新ep管中，重复提取一次，将提取液合并，真空离心干燥。肽段用样品溶解液(含0.1vol％甲酸和2vol％乙腈的水溶液)溶解，充分振荡涡旋，13200rpm，4℃离心10min，上清转移到上样管中，进行质谱分析。

胰蛋白酶(trypsin)+葡萄球菌蛋白酶(glu-c)+糜蛋白酶(chymotrypin)酶切：按照10μl/管的量向糜蛋白酶酶切后的ep管中加入15ng/μl的胰蛋白酶溶液(用25mmol/l碳酸氢铵水溶液稀释)胰蛋白酶溶液，放入4℃冰箱孵育40min，取出后每管补加10μl25mmol/l碳酸氢铵水溶液，密封置于37℃水浴中酶切16h。按照100μl/管向ep管中加提取液(三氟乙酸与乙腈、水体积比为5:50:45的混合溶液)，37℃水浴1h后，超声5min，离心5min，将提取液移入另一新ep管中，重复提取一次，将提取液合并，真空离心干燥。将酶切产物重新溶解于50mmol/l碳酸氢铵水溶液中，按照葡萄球菌蛋白酶与底物质量比为1:40加入葡萄球菌蛋白酶，37℃酶切4小时，继续按质量比1:40加入葡萄球菌蛋白酶，37℃酶切反应16h，再按照100μl/管向ep管中加提取液(三氟乙酸与乙腈、水体积比为5:50:45的混合溶液)37℃水浴1h后，超声5min，离心5min，将提取液移入另一新ep管中，重复提取一次，将提取液合并，真空离心干燥。按照10μl/管的量加入25ng/μl的糜蛋白酶溶液(用100mmol/lph8.0的tris-hcl缓冲液稀释)，放入4℃冰箱孵育40min，取出后每管补加10μl100mmol/lph8.0的tris-hcl缓冲液，密封置于37℃水浴中酶切16h。再按照100μl/管向ep管中加提取液(三氟乙酸与乙腈、水体积比为5:50:45的混合溶液)37℃水浴1h后，超声5min，离心5min，将提取液移入另一新ep管中，重复提取一次，将提取液合并，真空离心干燥，肽段用样品溶解液(含0.1vol％甲酸和2vol％乙腈的水溶液)溶解，充分振荡涡旋，13200rpm，4℃离心10min，上清转移到上样管中，进行质谱分析。

蛋白内切酶(asp-n)酶切：按照10μl/管的量加入浓度为15ng/μl的asp-n酶(用25mmol/l碳酸氢铵水溶液稀释)，放入4℃冰箱孵育40min，取出后每管补加10μl25mmol/l碳酸氢铵水溶液，密封置于37℃水浴中酶切16h。然后按100μl/管加提取液(三氟乙酸与乙腈、水体积比为5:50:45的混合溶液)，37℃水浴1h后，超声5min，离心5min，将提取液移入另一新ep管中，重复提取一次，将提取液合并，真空离心干燥。肽段用样品溶解液(含0.1vol％甲酸和2vol％乙腈的水溶液)溶解，充分振荡涡旋，13200rpm，4℃离心10min，上清转移到上样管中，进行质谱分析。

随机碎裂：在样品中加入50μl100mmol/l碳酸氢铵水溶液，加入dtt溶液使其终浓度为10mmol/l，于56℃水浴中还原1h；然后加入iaa溶液使其终浓度为50mmol/l，避光反应40min。使用物理方法进行随机碎裂，使用自填脱盐柱脱盐后，于45℃真空干燥。

(2)液质联用检测

酶解处理后的肽段进行液相色谱分离(rplc)和高分辨质谱检测(obitrapfusionlumos)。

采用ultimate3000毛细管高效液相色谱仪，thermoscientific电喷雾-组合型离子阱orbitrap质谱仪；所得肽段以高效液相色谱仪梯度洗脱，流动相a：含0.1vol％甲酸和2vol％乙腈的水溶液，流动相b：含0.1vol％甲酸和80vol％乙腈的水溶液，流速：300nl/min，梯度洗脱条件为：0→1min，6％b；2→8min，9％b，9→24min，14％b；25→60min，30％b；61→75min，40％b；76→78min，95％b。

质谱检测条件为：正离子模式；一级质谱参数：分辨率为70000，agctarget容纳离子数为3×106，参考质荷比为350-1800mz；二级质谱参数：分辨率为75000，agctarget容纳离子数为1×106，nce/steppednce：27。

(3)数据分析

利用蛋白序列分析软件peaksmassspectrometrysoftware进行数据分析，通过从头测序法分析重叠多肽，将一级、二级谱图用peaks软件进行denovo解析，利用不同酶切肽段之间的互补性实现蛋白分子100％全序列的拼接，其氨基酸序列如序列表seqidno.1所示。各肽段经二级质谱(ms/ms)分析后，均得到主要碎片离子(bn或yn)基本齐全的ms/ms图谱。质谱检测到的七个肽段的ms/ms及其解析结果如图4～9所示。将蛋白全序列在ncbi数据库中检索分析，发现该蛋白与2s白蛋白家族具有较高的同源性，序列匹配结果如图10所示。因此命名目标蛋白为牡丹类2s白蛋白(ps-2s-alb)。

实施例2

本实施例中，用牡丹籽替换实施例1中的牡丹籽粕，其他步骤与实施例1相同，得到目标蛋白牡丹类2s白蛋白(ps-2s-alb)0.98g，纯度95％以上。

实施例3实施例1提取的牡丹类2s白蛋白的抗氧化活性

本实施例采用清除dpph能力、清除羟自由基能力、清除abts自由基能力及frap还原能力四种方法对纯化的牡丹类2s白蛋白进行体外抗氧化活性评价，并同时与阳性对照抗坏血酸的活性大小进行比较。

(1)dpph自由基清除能力测定

取一系列浓度的蛋白水溶液3.0ml，加入3.0ml100μmol/l的dpph-乙醇溶液，室温下避光反应30min，在517nm处测反应混合液的吸光度值a；用蒸馏水代替蛋白样品，相同条件下测吸光度值a0；用乙醇溶液代替dpph，相同条件下测定的吸光度值b。并用抗坏血酸(vc)作阳性对照，每个试样做三组平行。自由基清除率(dpph.sc)计算如下：

(2)羟基自由基清除能力测定

取一系列浓度的蛋白水溶液2.0ml，加入0.6ml6mmol/lh2o2水溶液、0.6ml6mmol/lfeso4水溶液、0.6ml6mmol/l水杨酸水溶液和4.2ml蒸馏水，摇匀，37℃下反应30min，在510nm下测吸光值，a0为不加蛋白样品的空白对照的吸光值，a为样品的吸光值，b为不加显色剂h2o2时的值。抗坏血酸(vc)作阳性对照，每个试样做三组平行。羟基自由基清除率(oh.sc)计算公式如下：

(3)abts自由基清除能力测定

将7.4mmol/labts水溶液与2.6mmol/lk2s2o8水溶液等体积混合避光反应12h，用1.0mmol/lph7.4pbs缓冲液稀释50倍，使a734nm＝0.7±0.02。先加入200μl不同浓度的蛋白水溶液，再加入4.8mlbts，混匀室温避光10min后，在734nm出测其紫外吸收a1，蒸馏水做空白对照测a0。抗坏血酸(vc)作阳性对照，每个试样做三组平行。abts自由基清除率计算公式如下：

(4)frap还原力测定

测定原理为：fe³⁺-tptz可被样品还原为fe²⁺-tptz形式并呈现出明显的蓝色，于593nm处有最大吸收，吸光值越大，则样品还原力越强。将0.2mol/l醋酸钠缓冲溶液(5.1g醋酸钠溶解于20ml冰醋酸后用水稀释定容至250ml配制而成)、10mmol/ltptz溶液(31.233mgtptz样品用40mmol/l盐酸溶液定容至10ml配制而成)、20mmol/lfecl3水溶液按体积比为10:1:1混合制成tptz工作液。取不同浓度蛋白水溶液2ml再加3mltptz工作液后混匀37℃反应10min，在593nm处测吸光度a。

上述测试结果如图11～14所示。由图可见，在一定的浓度范围内，牡丹类2s白蛋白具有一定的抗氧化活性，对dpph自由基、羟自由基、abts自由基均具有一定的清除能力，其清除能力随浓度的增加而加大，并且对羟基自由基的清除能力要明显强于相同浓度的抗坏血酸。

序列表

<110>西北大学

<120>一种牡丹类2s白蛋白及其提取方法和应用

<141>2020-03-16

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>112

<212>prt

<213>paeoniasuffruticosa

<400>1

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151015

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