基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpoB突变的引物探针组及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学及临床检测技术领域，具体涉及基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpob突变的引物探针组及其应用。

背景技术：

结核病主要是由结核分枝杆菌复合群菌株（mycobacteriumtuberculosiscomplex，mtbc）所引起的一种严重危害人类健康的慢性传染病，其中由结核分枝杆菌（mycobacteriumtuberculosis，mtb）感染导致的病例占绝大多数。结核分枝杆菌复合群主要包括结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌等多种亲缘关系相近的菌株；其中，除田鼠分枝杆菌已明确对人无致病力外，大多数结核分枝杆菌复合群菌株对人可致病；且产生大致相同的临床表现。非结核分枝杆菌（nontuberculosismycobacteria，ntm）是指除结核杆菌复合群菌株及麻风分枝杆菌以外的所有分枝杆菌。ntm感染症状与结核病症状类似、易造成误诊、漏诊，增加了结核病诊断和治疗的难度。因此，迅速、准确的检测、鉴别结核分枝杆菌复合群菌株与非结核分枝杆菌感染已经成为影响临床用药与治疗效果的重要因素。

rpob基因是编码细菌rna聚合酶β亚单位的基因，该基因的突变直接导致其所编码的β亚单位构象异常，菌体与利福平类抗结核药物的亲和力降低，进而导致治疗失败。而利福平是一种广谱抗生素，对结核分枝杆菌有较强抗菌作用，被世界卫生组织推荐为治疗结核病的最主要药物之一。利福平与依赖dna的rna多聚酶β亚单位结合，抑制细菌rna的合成，从而阻断rna转录与延伸过程，使dna和蛋白的合成停止、抑制细菌繁殖。结核分枝杆菌对利福平的敏感性是评价结核分枝杆菌耐药特征的重要指标，对利福平耐药的菌株大多对另外一种重要的抗结核药物异烟肼不敏感，对利福平和异烟肼同时耐药的菌株被称为耐多药（multi-drugresistanttuberculosis，mdr-tb）菌株或广泛耐药（extensivelydrug-resistanttuberculosis，xdr-tb）菌株。研究表明，超过95%的rpob基因突变发生在81bp（编码507-533位点氨基酸）的核心区域—耐利福平决定区（rifampicinresistancedeterminingregion,rrdr）；该区域内发生的突变与结核分枝杆菌对利福平类药物的敏感性变化密切相关。

目前用于检测结核分枝杆菌对利福平敏感性的方法主要有表型检测法（如传统药敏试验法和bactecmgit960法）和分子药敏法。其中，传统的在含抗结核药物的固体培养基上检测药物敏感性的方法，虽然简单、经济、适用于基层，但是培养时间长，通常需1-2月时间；通过bactecmgit960快速培养系统检测利福平敏感性的方法，虽然比较快速，但目前仪器设备严重依赖进口、且无论是设备本身还是配套试剂采购成本较高、设备的依赖性强。而分子生物学的发展推动了各种快速、准确、成本低廉的检测技术得以广泛应用。

多酶恒温快速扩增技术（multienzymeisothermalrapidamplification，mira）是一种基于常温恒温核酸快速扩增的技术。具有灵敏度高、特异性强、反应时间短等优点；反应组分可做冻干处理，操作简便，易于保存；无需购买价格高昂的专属设备；且可借助生物标记手段、与侧向流动检测技术相结合，在短时间内实现多重检测、以及短时间内检测结果的可视化读取。

目前，尚没有基于多酶恒温快速扩增技术的结核分枝杆菌复合群菌株鉴定及结核分枝杆菌对利福平耐药性的检测方法，因此，建立一种基于多酶恒温快速扩增技术、用于检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpob基因突变的检测方法具有重要现实意义。

技术实现要素：

在此为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpob突变的引物探针组、试剂盒以及检测结核分枝杆菌复合群及rpob突变的方法。

为实现上述目的，本发明通过对结核分枝杆菌复合群菌株和非结核分枝杆菌的基因组序列进行了充分的研究和分析，结合大量的实践验证发现，与非结核分枝杆菌相比，结核分枝杆菌复合群菌株在其rpob基因的第1296位存在特异性的碱基突变，该碱基对应结核分枝杆菌复合群菌株rna聚合酶β亚单位氨基酸序列的第513位点氨基酸的密码子（caa:1294-1296位碱基）第3个碱基。仅当结核分枝杆菌复合群菌株rna聚合酶β亚单位第513位点氨基酸的密码子第3个碱基（第1296位碱基）发生突变时，该密码子编码的氨基酸不发生突变，因此结核分枝杆菌复合群菌株的耐药性不受该碱基突变的影响。另一方面，本发明将多酶恒温快速扩增技术引入到结核分枝杆菌复合群检测中，开发了基于多酶恒温快速扩增技术的结核分枝杆菌复合群及结核分枝杆菌对利福平耐药性的检测方法，经人工设计和筛选，针对用于区分非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群的rpob基因突变位点以及导致结核分枝杆菌株对利福平敏感性变化的rpob突变位点（对应编码第516位点（gac：1303-1305位碱基）、526位点（cac:1333-1335位碱基）和531位点（tcg:1348-1350位碱基）氨基酸的密码子突变）设计了特异的检测引物和探针。通过在该引物和探针的末端引物生物标记，可实现结合侧向流动试纸条的快速、可视化结果检测。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供rpob突变位点在作为结核分枝杆菌复合群菌株的特异性分子标记中的应用；所述rpob突变位点位于如seqidno.1所示的核苷酸序列的第1296位，结核分枝杆菌复合群菌株的该位点为a；非结核分枝杆菌的该位点为g。

本发明所述的第1296位碱基突变为相对于结核分枝杆菌的rpob编码基因（seqidno.1）的位置，非结核分枝杆菌的该位点为g是指非结核分枝杆菌在与结核分枝杆菌进行rpob基因序列比对时的对应位点。

第二方面，本发明提供rpob突变位点或所述rpob突变位点的检测试剂在鉴别结核分枝杆菌复合群菌株与非结核分枝杆菌，或者制备用于检测结核分枝杆菌复合群菌株感染或检测结核病的试剂中的应用；所述rpob突变位点位于如seqidno.1所示的核苷酸序列的第1296位，结核分枝杆菌复合群菌株的该位点为a；非结核分枝杆菌的该位点为g。

第三方面，本发明提供基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpob突变的特异性引物探针组，所述引物探针组包括上游引物和探针组，所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述探针组包含选自核苷酸序列如seqidno.4~7所示的探针中的一个或多个。

seqidno.3：rpob-a1：5’-ttcgatgaacccgaacgggttgacccgc-3’；

seqidno.4：rpob-183mf1：5’-agttcttcggcaccagccagctgagcgaa-3’；

seqidno.5：rpob-531mf7：5’-tgtcggggttgacccacaagcgccgactttc-3’；

seqidno.6：rpob-526mf6：5’-caacccgctgtcggggttgactca-3’；

seqidno.7：rpob-516md2：5’-gcaccagccagctgagccaattcatcga-3’。

上述引物中，seqidno.3所示引物为上游引物，可与各探针配对使用；seqidno.4所示探针用于区分结核分枝杆菌复合群菌株和非结核分枝杆菌；seqidno.5、6、7所示探针分别用于检测rpob编码蛋白的第531位点、第526位点和第516位点氨基酸突变（第531位点、第526位点和第516位点为相对于大肠杆菌的rpob编码蛋白序列的位置，这些位点相对于结核分枝杆菌菌株的rpob编码蛋白序列，即seqidno.2序列的第450位点、第445位点和第435位点），即rpob基因（seqidno.1）的第1349位、第1333-1334位和第1303-1304位的碱基突变。

本发明所述上游引物可以4条探针中的任意一条或多条配合使用，组成引物探针组，实现所需的检测目的。例如：当同时鉴别结核分枝杆菌复合群菌株以及检测rpob的531位点、526位点和516位点氨基酸突变时，所述引物探针组包括seqidno.3~7所示的引物和探针。

为方便检测结果的判断，本发明所述的上游引物和探针的末端采用生物标记。所述生物标记包括但不限于生物素标记、荧光素标记、地高辛标记等。所述荧光素标记包括但不限于fam、hex、rox、tet、joe、cy3、cy5、tamra、vic。

优选地，所述上游引物和所述探针之间以及所述探针之间采用不同的生物标记。本领域技术人员可根据采用的生物标记检测方式的不同，设计引物和探针的不同标记方式。

作为本发明的一种实施方式，各引物、探针的标记方式如下：seqidno.3所示的引物（rpob-a1）的5’末端采用荧光素fam标记；seqidno.4所示的引物（rpob-183mf1）的5’末端采用生物素bio标记；seqidno.5所示的引物（rpob-531mf7）的5’末端采用地高辛dig标记；seqidno.6所示的引物（rpob-526mf6）的5’末端采用生物素bio标记；seqidno.7所示的引物（rpob-516md2）的5’末端采用地高辛dig标记。

第四方面，本发明提供结核分枝杆菌复合群菌株及rpob突变的检测试剂盒，其包含所述基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpob突变的特异性引物探针组。

可选地，所述试剂盒还包括选自dntps、重组酶、恒温聚合酶、辅助蛋白、核酸外切酶、聚乙二醇、tris-hcl、醋酸镁和单链结合蛋白中的一种或多种。

第五方面，本发明提供基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpob突变的特异性引物探针组或包含所述引物探针组的检测试剂盒的如下任一种应用：

（1）在鉴别结核分枝杆菌复合群菌株与非结核分枝杆菌，和/或，检测结核分枝杆菌菌株的耐药性中的应用；

（2）在制备用于检测结核分枝杆菌复合群菌株感染或检测结核病的试剂中的应用。

上述（1）中的应用，所述耐药性具体为对利福平或其衍生物的耐药性。

第六方面，本发明提供基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpob突变的方法，包括：利用所述引物探针组或所述检测试剂盒进行多酶恒温扩增。

优选地，所述多酶恒温扩增的反应体系中，所述上游引物与所述探针的摩尔比为（1.5~3）：1。

更优选地，所述多酶恒温扩增的反应体系包括：重组酶200-290ng/µl、恒温聚合酶80-160ng/µl、单链结合蛋白190-270ng/µl、辅助蛋白60-110ng/µl、核酸外切酶70-130ng/µl、dntps0.2-1mm、聚乙二醇2-4%、tris-hcl20-40mm、醋酸镁280-300mm、上游引物（seqidno.3）0.4~0.6μm、探针（seqidno.4-7中的一个或多个）0.18~0.3μm、ddh2o和待测样品。

作为本发明的优选方案，设置2个扩增体系，扩增体系1中添加上游引物（seqidno.3）以及探针（seqidno.4-5），扩增体系2中添加上游引物（seqidno.3）以及探针（seqidno.6-7）；扩增体系1中上游引物（seqidno.3）的终浓度为0.6μm、探针（seqidno.4）的终浓度为0.2μm，探针（seqidno.5）的终浓度为0.3μm；扩增体系2中上游引物（seqidno.3）的终浓度为0.4μm、探针（seqidno.6）的终浓度为0.22μm，探针（seqidno.7）的终浓度为0.18μm。

优选地，所述多酶恒温扩增的反应程序为：37~42℃反应20~25min。

本发明所述的基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpob突变的方法优选利用侧向流动试纸条检测多酶恒温扩增的产物，根据试纸条的质控线和检测线颜色变化结果判断待测菌株是否为结核分枝杆菌复合群菌株以及待测菌株的rpob基因突变情况。

作为本发明的一种优选方案，所述方法包括：

（1）将待测菌株的培养物于80~85℃加热25~35min，离心分离沉淀物，加水混匀后再次离心分离沉淀物，加水混匀后于95~105℃加热20~25min，离心分离上清作为模板；

（2）利用所述引物探针组、在2个扩增反应体系中进行多酶恒温扩增，扩增体系1的50μl反应体系包括：重组酶200~290ng/µl、恒温聚合酶80~160ng/µl、单链结合蛋白190~270ng/µl、辅助蛋白60~110ng/µl、核酸外切酶70~130ng/µl、dntps0.2~1mm、聚乙二醇2~4%、tris-hcl20~40mm、醋酸镁280~300mm、10μm的seqidno.3所示上游引物3µl、10μm的seqidno.4所示探针1µl、10μm的seqidno.5所示探针1.5µl、步骤（1）制备的模板2~3µl、以ddh2o补足至50µl；扩增体系2的50μl反应体系包括：重组酶200~290ng/µl、恒温聚合酶80~160ng/µl、单链结合蛋白190~270ng/µl、辅助蛋白60~110ng/µl、核酸外切酶70~130ng/µl、dntps0.2~1mm、聚乙二醇2~4%、tris-hcl20~40mm、醋酸镁280~300mm、10μm的seqidno.3所示上游引物2µl、10μm的seqidno.6所示探针1.1µl、10μm的seqidno.7所示探针0.9µl、步骤（1）制备的模板2~3µl、以ddh2o补足至50µl；所述多酶恒温扩增为在37~42℃反应20~25min；

（3）利用侧向流动试纸条对扩增产物进行检测：将扩增产物以侧向流动试纸条反应缓冲液稀释后，滴加到侧向流动试纸条的加样端，将试纸条插入侧向流动试纸条反应缓冲液中，反应4~5min后读取结果。根据侧向流动试纸条的质控线和各检测线的颜色判断待测菌株是否为结核分枝杆菌复合群菌株及其rpob是否存在对应于第531位点、516位点和526位点氨基酸突变的核苷酸突变。

本发明的有益效果在于：本发明发现结核分枝杆菌rpob基因的第1296位的碱基类型可作为结核分枝杆菌复合群菌株的特异性分子标记，用于有效区分结核分枝杆菌复合群菌株和非结核分枝杆菌。本发明开发了基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpob基因突变的方法，分别针对上述区分结核分枝杆菌复合群菌株和非结核分枝杆菌的rpob基因位点以及导致结核分枝杆菌耐药性的rpob基因突变位点设计了高效的多酶恒温扩增引物和探针，实现了结核分枝杆菌复合群菌株及其rpob基因耐药性突变的快速、准确检测，对于结核分枝杆菌复合群菌株的区分鉴定、结核分枝杆菌复合群菌株的感染检测及其耐药性检测具有重要的应用价值，可广泛用于结核病的辅助诊断、流行病学监测等相关领域。

相比于现有技术的结核分枝杆菌复合群菌株及结核分枝杆菌耐药性的检测方法，本发明提供的基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpob突变的方法，具有以下优点：

（1）具有较高的灵敏度和特异性；

（2）具有较高的准确性；

（3）扩增反应可在37-42℃下进行，对设备的依赖性低、甚至可利用常规微生物检测实验室的培养箱作为扩增设备，无需购置其他特殊设备，设备采购成本低廉，适用于基层机构或现场作业；

（4）可利用侧向流动试纸条对扩增产物实现可视化、即时化检测；

（5）检测过程耗时较短，可在短时间内完成大批量的样本检测；无需进行传统的dna提取，将菌株样品经简单的加热处理即可作为检测模板；临床样本直接检测（样本核酸提取、核酸扩增、结果判读）可在2小时内完成、核酸样本检测（核酸扩增、结果判读）可在30分钟内完成、可视化结果判读可在10分钟内完成；

（6）检测所需试剂耗材的保存条件要求低，关键试剂以干粉状态可长期保存，运输、携带方便；

（7）检测试剂的成本较低，适合大规模商业化生产和推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例1中结核分枝杆菌复合群菌株与非结核分枝杆菌的rpob序列比对结果。

图2为本发明实施例3中扩增反应1的各种检测结果示意图；从左至右依次为实施例3中的扩增反应1的（1）、（2）、（3）和（4）中的检测结果。

图3为本发明实施例3中扩增反应2的各种检测结果示意图；从左至右依次为实施例3中的扩增反应2的（1）、（2）、（3）、（4）和（5）中的检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，用于多酶恒温扩增的abuffer、bbuffer成品均购自潍坊安普未来生物科技有限公司。

实施例1适用于多酶恒温快速扩增技术的检测引物和探针的设计及合成

本发明通过对结核分枝杆菌复合群菌株和非结核分枝杆菌的基因组序列进行了充分的研究和分析，结合大量的实践验证发现，与非结核分枝杆菌相比，结核分枝杆菌复合群菌株在其rpob基因（rv0667或相应核酸序列，序列如seqidno.1所示）的第1296位存在特异性的碱基突变，结核分枝杆菌复合群菌株的该位点为a；非结核分枝杆菌与该位点对应的位点为g。可利用该位点鉴别结核分枝杆菌复合群菌株和非结核分枝杆菌。结核分枝杆菌复合群菌株的特异性位点及其上下游序列与非结核分枝杆菌的序列比对结果如图1所示。

分别针对该特异性位点以及与结核分枝杆菌菌株对利福平敏感性密切相关的rpob编码蛋白的531位点（即seqidno.2所示序列的450位）、526位点（即seqidno.2所示序列的445位）和516位点（即seqidno.2所示序列的435位）氨基酸突变设计适用于多酶恒温扩增的引物和探针。

与普通pcr反应过程不同，多酶恒温扩增反应对所用引物/探针的要求较高。首先，为了保证扩增反应的高特异性，所用引物/探针的长度（24-31bp）均高于普通pcr反应所需的引物长度（18-20bp）。第二，为了保证扩增反应的高效性，即单次扩增同时发生多个反应，所用引物/探针需充分考虑引物/探针之间的非特异性配对与反应效率。第三，常规核酸扩增反应用于检测点突变时，检测的突变位点主要是引物/探针的3’端最后一个碱基；若该碱基为完整密码子第三位碱基时、根据密码子编码原则翻译后的氨基酸不发生突变（相应蛋白所具有的功能不发生改变）；而本发明在进行耐药性相关位点检测时主要检测相应氨基酸位点上密码子的第一、第二位核苷酸所发生的突变（核酸突变所带来的蛋白质功能改变）。因此，适用于普通pcr扩增反应的引物和探针的设计原则并不能完全适用于本发明所用的引物/探针。

本发明在设计引物/探针时，通过在引物/探针的3’上游的某个位置引入特异的突变碱基，通过引入的突变碱基与下游碱基之间自由能发生改变、进而影响该碱基及下游碱基与模板结合的稳定性，达到检测密码子第一、第二位碱基突变的目的。

综合上述考虑，基于多酶恒温扩增体系在反应过程中涉及的引物与模板之间、引物与引物之间、不同离子浓度之间的相互作用的复杂性，在引物/探针专业设计软件的辅助下，初步设计并筛选到多条候选的可用于本发明多酶恒温扩增体系的引物/探针。为实现高效、特异的多酶恒温扩增，本发明对经特异设计、筛选初步得到的候选引物/探针序列合成并进行生物标记后、进行了人工验证与优化，以下为本发明设计的候选引物、探针的部分罗列及效果说明。

1、516和526位点氨基酸突变检测的引物探针优化过程

上游引物的候选引物序列如下（5’-3’）：

a1：ttcgatgaacccgaacgggttgacccgc；

a2：gacagcgagccgatcagaccgatgttggg；

a3：ccgatcagaccgatgttgggcccctcagg；

a4：tcgcggacctccagcccggcacgctcacg。

516位点氨基酸突变检测的候选探针序列如下（5’-3’）：

516md1：gcaccagccagctgagccaattcataga；

516md2：gcaccagccagctgagccaattcatcga；

516md3：gcaccagccagctgagccaattcattga。

526位点氨基酸突变检测的候选探针序列如下（5’-3’）：

526mf1：cagaacaacccgctgtcggggttgactca；

526mf2：cagaacaacccgctgtcggggttgacgca；

526mf3：cagaacaacccgctgtcggggttgacaca。

利用上述候选引物和探针的不同组合进行多酶恒温扩增，扩增体系如表1所示：

表1用于候选引物探针筛选的多酶恒温扩增体系（1）

dna模板为：516位点氨基酸未突变/突变菌株、526位点氨基酸未突变/突变菌株经热处理后的样品，热处理的具体方法如下：

（1）在1.5ml螺口离心管中加入800µl的ddh2o，用接种环从罗氏固体培养基中刮取一环待测菌置于离心管中；

（2）将离心管置于80℃环境，加热30min灭活，12000rmp离心5min；

（3）将上清弃掉，向管中加入ddh2o1ml，混匀；

（4）12000rmp离心5min，将上清弃掉、加入150µlddh2o，轻微震荡混匀；

（5）置于100℃环境，加热20min；

（6）12000rmp离心10min；

（7）吸取上清作为待测样品。

将上述扩增体系在39℃反应10min。反应结束后取反应液采用侧向流动试纸条进行检测，结果显示：a1和516md2引物性能最佳；526mf1引物性能虽优于526位点检测的其他两条引物，但仍呈现非特异扩增；在此基础上继续对526位点的扩增引物进行优化。

526位点氨基酸突变检测的部分候选探针序列如下（5’-3’）：

526mf5：aacaacccgctgtcggggttgactca；

526mf6：caacccgctgtcggggttgactca。

将上述候选探针分别与上游引物a1和516md2组合进行多酶恒温扩增，扩增体系如表2所示：

表2用于候选引物探针筛选的多酶恒温扩增体系（2）

dna模板为：526位点未突变/突变菌株热处理后样品。

将上述扩增体系于39℃反应10min。反应结束后取反应液采用侧向流动试纸条进行检测，结果显示：526mf6引物最佳。

2、531位点氨基酸突变和1296位碱基突变检测的引物探针优化过程

上游引物的候选引物序列a(1-4)的序列如上述1中所述。

531位点氨基酸突变检测的候选探针序列如下（5’-3’）：

531mf1：tgtcggggttgacccacaagcgccgacggcc；

531mf2：tgtcggggttgacccacaagcgccgaccgcc；

531mf3：tgtcggggttgacccacaagcgccgacagcc；

531mf4：ggttgacccacaagcgccgacagcc；

531mf5：tgtcggggttgacccacaagcgccgactatc；

531mf6：tgtcggggttgacccacaagcgccgattatc；

531mf7：tgtcggggttgacccacaagcgccgactttc；

531mf8：tgtcggggttgacccacaagcgccgactgtc；

531mf9：tgtcggggttgacccacaagcgccgactctc；

531mf10：tgtcggggttgacccacaagcgccgaccgtc。

1296位碱基突变检测的候选探针序列如下（5’-3’）：

183mf1：agttcttcggcaccagccagctgagcgaa；

183mf2：agttcttcggcaccagccagctgagctaa；

183mf3：agttcttcggcaccagccagctgagtcga；

183mf4：agttcttcggcaccagccagctgagcaga；

183mf5：agttcttcggcaccagccagctgagctga。

利用上述候选引物和探针的不同组合进行多酶恒温扩增，扩增体系如表3所示：

表3用于候选引物探针筛选的多酶恒温扩增体系（3）

dna模板为：1296位碱基未突变/突变菌株、531位点氨基酸未突变/突变菌株热处理后样品。

将上述扩增体系在39℃反应10min。反应结束后取反应液采用侧向流动试纸条进行检测，结果显示：a1、531mf7和183mf1引物性能最佳。

通过对引物、探针序列进行筛选和人工优化，最终获得能够实现高效的多酶恒温扩增的引物和探针序列：

seqidno.3：rpob-a1：5’-ttcgatgaacccgaacgggttgacccgc-3’；

seqidno.4：rpob-183mf1：5’-agttcttcggcaccagccagctgagcgaa-3’；

seqidno.5：rpob-531mf7：5’-tgtcggggttgacccacaagcgccgactttc-3’；

seqidno.6：rpob-526mf6：5’-caacccgctgtcggggttgactca-3’；

seqidno.7：rpob-516md2：5’-gcaccagccagctgagccaattcatcga-3’。

上述引物中，seqidno.3所示引物为上游引物；seqidno.4所示探针用于检测1296位碱基突变，以区分结核分枝杆菌复合群菌株和非结核分枝杆菌；seqidno.5、6、7所示探针分别用于检测与结核分枝杆菌菌株对利福平敏感性密切相关的rpob编码蛋白的第531位点（即seqidno.2所示序列的450位ser）、第526位点（即seqidno.2所示序列的445位his）和第516位点（即seqidno.2所示序列的435位asp）氨基酸突变。

为配合后续利用侧向流动试纸条检测扩增产物，对各引物、探针进行不同的生物标记，具体标记方式如下：seqidno.3所示的引物（rpob-a1）的5’末端采用荧光素fam标记；seqidno.4所示的引物（rpob-183mf1）的5’末端采用生物素bio标记；seqidno.5所示的引物（rpob-531mf7）的5’末端采用地高辛dig标记；seqidno.6所示的引物（rpob-526mf6）的5’末端采用生物素bio标记；seqidno.7所示的引物（rpob-516md2）的5’末端采用地高辛dig标记。

实施例2基于多酶恒温快速扩增技术的快速、可视化检测试剂盒

本实施例提供用于结核分枝杆菌复合群菌株检测及其rpob突变检测的、基于多酶恒温快速扩增技术的快速、可视化的试剂盒，试剂盒包括如下组分：

（1）序列如seqidno.3-7所示的引物和探针；

（2）多酶恒温快速扩增反应缓冲液：、包含dntps、重组酶、恒温聚合酶、辅助蛋白、核酸外切酶、聚乙二醇、tris-hcl、醋酸镁和单链结合蛋白；

（3）可同时检测3种标记（bio、dig、fam）扩增产物的侧向流动试纸条及其反应缓冲液；

（4）ddh2o。

实施例3基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpob基因突变的方法

1、待测样品的制备：

（1）在1.5ml螺口离心管中加入800µl的ddh2o，用接种环从罗氏固体培养基中刮取一环待测菌置于离心管中；

（2）将离心管置于80℃环境，加热30min灭活，12000rmp离心5min；

（3）将上清弃掉，向管中加入ddh2o1ml，混匀；

（4）12000rmp离心5min，将上清弃掉、加入150µlddh2o，轻微震荡混匀；

（5）置于100℃环境，加热20min；

（6）12000rmp离心10min；

（7）吸取上清作为待测样品；

以上待测样品的制备过程耗时约90min。

2、多酶恒温快速扩增反应

根据检测目的和识别位点的不同，将实施例1中的引物、探针应用于2个扩增反应，分别构建扩增体系，各扩增反应体系的具体组成如下：

扩增体系1（50µl）：ddh2o、10.6µl；abuffer、29.4µl；rpob-183mf1(seqidno.4，10µm)、1µl；rpob-531mf7（seqidno.5，10µm）、1.5µl；rpob-a1（seqidno.3，10µm）、3µl；待测样品，2µl；bbuffer、2.5µl。

扩增体系2（50µl）：ddh2o、12.1µl；abuffer、29.4µl；rpob-526mf6（seqidno.6，10µm）、1.1µl；rpob-516md2（seqidno.7，10µm）、0.9µl；rpob-a1（seqidno.3，10µm）、2µl；待测样品，2µl；bbuffer、2.5µl。

扩增体系1用于鉴别结核分枝杆菌复合群菌株与非结核分枝杆菌以及检测rpob基因编码531氨基酸位点的突变。扩增体系2用于检测rpob基因编码516和526氨基酸位点的突变。

扩增体系的配制方法如下：在反应管中配制扩增反应体系，不添加bbuffer；短暂离心混匀；打开反应管盖，在盖上加入2.5µlbbuffer，盖上管盖；用手指轻弹反应管，混匀反应管中的扩增反应体系；短暂离心，将管中的反应液与管盖上bbuffer充分混匀，启动反应。

将反应管置于39℃环境中反应10min（反应进行到第4min时，将反应管从39℃环境中取出，再次用手指轻弹混匀，短暂离心后置于39℃环境中继续反应）；反应10min后将反应管取出、进行可视化检测，如不立即进行检测，可置于4℃环境短时间保存。

以上多酶恒温快速扩增反应过程耗时约20min。

为提高多酶恒温扩增的检测效率，本发明对扩增体系进行了优化，以下为优化实验的部分罗列及效果说明。

（1）扩增体系1的优化过程

针对各引物和探针分别设置不同的添加量，具体如表4所示：

表4扩增体系1的优化

dna模板：1296位碱基未突变/突变菌株、531位点氨基酸未突变/突变菌株热处理后样品。

将上述各扩增体系于39℃反应10min。反应结束后取反应液采用侧向流动试纸条进行检测，结果显示：当a1为3µl、531mf7为1.5µl、183mf1为1µl时扩增体系性能最佳。

（2）扩增体系2的优化过程

针对各引物和探针分别设置不同的添加量，具体如表5所示：

表5扩增体系2的优化

dna模板为：516位点氨基酸未突变/突变菌株、526位点氨基酸未突变/突变菌株热处理后样品。

将上述各扩增体系于39℃反应10min。反应结束后取反应液采用侧向流动试纸条进行检测，结果显示：当a1为2µl、516md2为0.9µl、526mf6为1.1µl时扩增体系性能最佳。

3、基于侧向流动试纸条（可同时检测bio、dig和fam3种标记扩增产物）的扩增结果可视化检测

（1）在1.5ml离心管中加入49µl侧向流动试纸条反应缓冲液,吸取1µl多酶恒温快速扩增反应产物于离心管中进行50倍稀释，混匀，得到扩增产物稀释液；

（2）吸取10µl扩增产物稀释液滴加到侧向流动试纸条上的加样端；

（3）另取一个1.5ml离心管，加入90µl侧向流动试纸条反应缓冲液；

（4）将已滴加扩增产物稀释液的侧向流动试纸条插入含有90µl侧向流动试纸条反应缓冲液的1.5ml离心管中，4min后读取结果；

以上可视化检测耗时约10min。

4、结果判读

侧向流动试纸条上从上至下依次分布3条检测带，依次为质控条带、dig检测带、bio检测带。当侧向流动试纸条上的某一检测带呈现红色或紫红色明显条带时，表示相应扩增反应呈阳性；当无红色或紫红色明显条带时，表示相应扩增反应呈阴性。

对于扩增反应1：（1）当质控条带、dig检测带和bio检测带均为阳性时，表示检测反应成功，待测样本为结核分枝杆菌复合群菌株且其相应的rpob基因编码531氨基酸位点未发生突变；（2）当质控条带为阳性、dig检测带与bio检测带均为阴性时，表示检测反应成功，待测样本为分枝杆菌属中不属于结核分枝杆菌复合群的菌株或其他属菌株，且其相应的rpob基因编码531氨基酸位点发生突变；（3）当质控条带为阳性、dig检测带为阴性、bio检测带均为阳性时，表示检测反应成功，待测样本为结核分枝杆菌复合群菌株且其相应的rpob基因编码531氨基酸位点发生突变；（4）当质控条带、dig检测带和bio检测带均为阴性时，表示检测反应未成功。各种检测结果的示例如图2所示。

对于扩增反应2：（1）当质控条带、dig检测带和bio检测带均为阳性时，表示检测反应成功，且待测样本相应的rpob基因编码516和526氨基酸位点均未发生突变；（2）当质控条带为阳性、dig检测带为阳性、bio检测带为阴性时，表示检测反应成功，且待测样本相应的rpob基因编码516氨基酸位点未发生突变、rpob基因编码526氨基酸位点发生突变；（3）当质控条带为阳性、dig检测带为阴性、bio检测带为阳性时，表示检测反应成功，且待测样本相应的rpob基因编码516氨基酸位点发生突变、rpob基因编码526氨基酸位点未发生突变；（4）当质控条带为阳性、dig检测带和bio检测带均为阴性时，表示检测反应成功，且待测样本相应的rpob基因编码516和526氨基酸位点均发生突变；（5）当质控条带、dig检测带和bio检测带均为阴性时，表示检测反应均未成功。各种检测结果的示例如图3所示。

实施例4基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpob基因突变的方法的临床应用（1）

选取结核分枝杆菌复合群菌株、非结核分枝杆菌菌株、其他呼吸道病原菌的参考菌株共127株（表6、表7、表8和表9），利用实施例2的检测试剂盒和实施例3的检测方法对上述菌株进行结核分枝杆菌复合群菌株与非结核分枝杆菌及其他常见呼吸道病原菌的鉴别。

表6用于检测、鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的参考菌株（1）

表7用于检测、鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的参考菌株（2）

表8用于检测、鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的参考菌株（3）

表9用于检测、鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的参考菌株（4）

检测结果如表10所示，127株菌中所有结核分枝杆菌复合菌菌株的检测结果均为阳性，而非结核分枝杆菌和其他常见呼吸道病原菌的检测结果均为阴性。利用本发明提供的引物和探针以及检测方法鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌和其他常见呼吸道病原菌株的灵敏度与特异度均达到100%，灵敏度和特异度的计算公式如下：

灵敏度=真阳性数/（真阳性数+假阴性数）*100%；特异度=真阴性数/（真阴性数+假阳性数）*100%。

表10结核分枝杆菌复合群菌株检测结果

实施例5基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpob基因突变的方法的临床应用（2）

收集74株已经确定为结核分枝杆菌的临床菌株，采用实施例2的试剂盒和实施例3的检测方法检测rpob编码基因的1296位以及编码蛋白的516位点、526位点、531位点氨基酸发生突变的情况。

同时对各菌株的rpob基因相应编码片段进行扩增、测序，所得序列与结核分枝杆菌参考菌株h37rv（atcc27294）的rpob基因（rv0667）序列进行对比分析，确定各菌株rpob编码基因的1296位以及编码蛋白的516位点、526位点、531位点氨基酸的突变信息，并与利用实施例2的检测试剂盒和实施例3的检测方法得到的检测结果对比。

测序引物序列如下：

rpob-f:5’-tcggtcgctataaggtcaac-3’(seqidno.8)；

rpob-r:5’-gctccaggaagggaatcatc-3’(seqidno.9)。

表11本发明试剂盒检测rpob基因编码516、526和531氨基酸位点突变结果

采用本发明实施例2的试剂盒和实施例3的检测方法检测rpob编码基因的1296位以及编码蛋白的516位点、526位点、531位点氨基酸的突变发生情况得到的检测结果与测序结果完全符合，结果见表11。

以上结果表明，采用本发明的基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpob基因突变的引物、探针及试剂盒，能够准确、快速的鉴别、检测结核分枝杆菌复合群菌株及其rpob基因突变。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120>基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpob突变的引物探针组及其应用

<130>khp201110510.1ys

<160>31

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3519

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ttggcagattcccgccagagcaaaacagccgctagtcctagtccgagtcgcccgcaaagt60

tcctcgaataactccgtacccggagcgccaaaccgggtctccttcgctaagctgcgcgaa120

ccacttgaggttccgggactccttgacgtccagaccgattcgttcgagtggctgatcggt180

tcgccgcgctggcgcgaatccgccgccgagcggggtgatgtcaacccagtgggtggcctg240

gaagaggtgctctacgagctgtctccgatcgaggacttctccgggtcgatgtcgttgtcg300

ttctctgaccctcgtttcgacgatgtcaaggcacccgtcgacgagtgcaaagacaaggac360

atgacgtacgcggctccactgttcgtcaccgccgagttcatcaacaacaacaccggtgag420

atcaagagtcagacggtgttcatgggtgacttcccgatgatgaccgagaagggcacgttc480

atcatcaacgggaccgagcgtgtggtggtcagccagctggtgcggtcgcccggggtgtac540

ttcgacgagaccattgacaagtccaccgacaagacgctgcacagcgtcaaggtgatcccg600

agccgcggcgcgtggctcgagtttgacgtcgacaagcgcgacaccgtcggcgtgcgcatc660

gaccgcaaacgccggcaaccggtcaccgtgctgctcaaggcgctgggctggaccagcgag720

cagattgtcgagcggttcgggttctccgagatcatgcgatcgacgctggagaaggacaac780

accgtcggcaccgacgaggcgctgttggacatctaccgcaagctgcgtccgggcgagccc840

ccgaccaaagagtcagcgcagacgctgttggaaaacttgttcttcaaggagaagcgctac900

gacctggcccgcgtcggtcgctataaggtcaacaagaagctcgggctgcatgtcggcgag960

cccatcacgtcgtcgacgctgaccgaagaagacgtcgtggccaccatcgaatatctggtc1020

cgcttgcacgagggtcagaccacgatgaccgttccgggcggcgtcgaggtgccggtggaa1080

accgacgacatcgaccacttcggcaaccgccgcctgcgtacggtcggcgagctgatccaa1140

aaccagatccgggtcggcatgtcgcggatggagcgggtggtccgggagcggatgaccacc1200

caggacgtggaggcgatcacaccgcagacgttgatcaacatccggccggtggtcgccgcg1260

atcaaggagttcttcggcaccagccagctgagccaattcatggaccagaacaacccgctg1320

tcggggttgacccacaagcgccgactgtcggcgctggggcccggcggtctgtcacgtgag1380

cgtgccgggctggaggtccgcgacgtgcacccgtcgcactacggccggatgtgcccgatc1440

gaaacccctgaggggcccaacatcggtctgatcggctcgctgtcggtgtacgcgcgggtc1500

aacccgttcgggttcatcgaaacgccgtaccgcaaggtggtcgacggcgtggttagcgac1560

gagatcgtgtacctgaccgccgacgaggaggaccgccacgtggtggcacaggccaattcg1620

ccgatcgatgcggacggtcgcttcgtcgagccgcgcgtgctggtccgccgcaaggcgggc1680

gaggtggagtacgtgccctcgtctgaggtggactacatggacgtctcgccccgccagatg1740

gtgtcggtggccaccgcgatgattcccttcctggagcacgacgacgccaaccgtgccctc1800

atgggggcaaacatgcagcgccaggcggtgccgctggtccgtagcgaggccccgctggtg1860

ggcaccgggatggagctgcgcgcggcgatcgacgccggcgacgtcgtcgtcgccgaagaa1920

agcggcgtcatcgaggaggtgtcggccgactacatcactgtgatgcacgacaacggcacc1980

cggcgtacctaccggatgcgcaagtttgcccggtccaaccacggcacttgcgccaaccag2040

tgccccatcgtggacgcgggcgaccgagtcgaggccggtcaggtgatcgccgacggtccc2100

tgtactgacgacggcgagatggcgctgggcaagaacctgctggtggccatcatgccgtgg2160

gagggccacaactacgaggacgcgatcatcctgtccaaccgcctggtcgaagaggacgtg2220

ctcacctcgatccacatcgaggagcatgagatcgatgctcgcgacaccaagctgggtgcg2280

gaggagatcacccgcgacatcccgaacatctccgacgaggtgctcgccgacctggatgag2340

cggggcatcgtgcgcatcggtgccgaggttcgcgacggggacatcctggtcggcaaggtc2400

accccgaagggtgagaccgagctgacgccggaggagcggctgctgcgtgccatcttcggt2460

gagaaggcccgcgaggtgcgcgacacttcgctgaaggtgccgcacggcgaatccggcaag2520

gtgatcggcattcgggtgttttcccgcgaggacgaggacgagttgccggccggtgtcaac2580

gagctggtgcgtgtgtatgtggctcagaaacgcaagatctccgacggtgacaagctggcc2640

ggccggcacggcaacaagggcgtgatcggcaagatcctgccggttgaggacatgccgttc2700

cttgccgacggcaccccggtggacattattttgaacacccacggcgtgccgcgacggatg2760

aacatcggccagattttggagacccacctgggttggtgtgcccacagcggctggaaggtc2820

gacgccgccaagggggttccggactgggccgccaggctgcccgacgaactgctcgaggcg2880

cagccgaacgccattgtgtcgacgccggtgttcgacggcgcccaggaggccgagctgcag2940

ggcctgttgtcgtgcacgctgcccaaccgcgacggtgacgtgctggtcgacgccgacggc3000

aaggccatgctcttcgacgggcgcagcggcgagccgttcccgtacccggtcacggttggc3060

tacatgtacatcatgaagctgcaccacctggtggacgacaagatccacgcccgctccacc3120

gggccgtactcgatgatcacccagcagccgctgggcggtaaggcgcagttcggtggccag3180

cggttcggggagatggagtgctgggccatgcaggcctacggtgctgcctacaccctgcag3240

gagctgttgaccatcaagtccgatgacaccgtcggccgcgtcaaggtgtacgaggcgatc3300

gtcaagggtgagaacatcccggagccgggcatccccgagtcgttcaaggtgctgctcaaa3360

gaactgcagtcgctgtgcctcaacgtcgaggtgctatcgagtgacggtgcggcgatcgaa3420

ctgcgcgaaggtgaggacgaggacctggagcgggccgcggccaacctgggaatcaatctg3480

tcccgcaacgaatccgcaagtgtcgaggatcttgcgtaa3519

<210>2

<211>1172

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

leualaaspserargglnserlysthralaalaserproserproser

151015

argproglnserserserasnasnservalproglyalaproasnarg

202530

valserphealalysleuarggluproleugluvalproglyleuleu

354045

aspvalglnthraspserpheglutrpleuileglyserproargtrp

505560

arggluseralaalagluargglyaspvalasnprovalglyglyleu

65707580

glugluvalleutyrgluleuserproilegluasppheserglyser

859095

metserleuserpheseraspproargpheaspaspvallysalapro

100105110

valaspglucyslysasplysaspmetthrtyralaalaproleuphe

115120125

valthralaglupheileasnasnasnthrglygluilelyssergln

130135140

thrvalphemetglyasppheprometmetthrglulysglythrphe

145150155160

ileileasnglythrgluargvalvalvalserglnleuvalargser

165170175

proglyvaltyrpheaspgluthrileasplysserthrasplysthr

180185190

leuhisservallysvalileproserargglyalatrpleugluphe

195200205

aspvalasplysargaspthrvalglyvalargileasparglysarg

210215220

argglnprovalthrvalleuleulysalaleuglytrpthrserglu

225230235240

glnilevalgluargpheglyphesergluilemetargserthrleu

245250255

glulysaspasnthrvalglythraspglualaleuleuaspiletyr

260265270

arglysleuargproglygluproprothrlysgluseralaglnthr

275280285

leuleugluasnleuphephelysglulysargtyraspleualaarg

290295300

valglyargtyrlysvalasnlyslysleuglyleuhisvalglyglu

305310315320

proilethrserserthrleuthrglugluaspvalvalalathrile

325330335

glutyrleuvalargleuhisgluglyglnthrthrmetthrvalpro

340345350

glyglyvalgluvalprovalgluthraspaspileasphisphegly

355360365

asnargargleuargthrvalglygluleuileglnasnglnilearg

370375380

valglymetserargmetgluargvalvalarggluargmetthrthr

385390395400

glnaspvalglualailethrproglnthrleuileasnileargpro

405410415

valvalalaalailelysgluphepheglythrserglnleusergln

420425430

phemetaspglnasnasnproleuserglyleuthrhislysargarg

435440445

leuseralaleuglyproglyglyleuserarggluargalaglyleu

450455460

gluvalargaspvalhisproserhistyrglyargmetcysproile

465470475480

gluthrprogluglyproasnileglyleuileglyserleuserval

485490495

tyralaargvalasnpropheglypheilegluthrprotyrarglys

500505510

valvalaspglyvalvalseraspgluilevaltyrleuthralaasp

515520525

glugluasparghisvalvalalaglnalaasnserproileaspala

530535540

aspglyargphevalgluproargvalleuvalargarglysalagly

545550555560

gluvalglutyrvalprosersergluvalasptyrmetaspvalser

565570575

proargglnmetvalservalalathralametilepropheleuglu

580585590

hisaspaspalaasnargalaleumetglyalaasnmetglnarggln

595600605

alavalproleuvalargserglualaproleuvalglythrglymet

610615620

gluleuargalaalaileaspalaglyaspvalvalvalalagluglu

625630635640

serglyvalileglugluvalseralaasptyrilethrvalmethis

645650655

aspasnglythrargargthrtyrargmetarglysphealaargser

660665670

asnhisglythrcysalaasnglncysproilevalaspalaglyasp

675680685

argvalglualaglyglnvalilealaaspglyprocysthraspasp

690695700

glyglumetalaleuglylysasnleuleuvalalailemetprotrp

705710715720

gluglyhisasntyrgluaspalaileileleuserasnargleuval

725730735

glugluaspvalleuthrserilehisileglugluhisgluileasp

740745750

alaargaspthrlysleuglyalaglugluilethrargaspilepro

755760765

asnileseraspgluvalleualaaspleuaspgluargglyileval

770775780

argileglyalagluvalargaspglyaspileleuvalglylysval

785790795800

thrprolysglygluthrgluleuthrproglugluargleuleuarg

805810815

alailepheglyglulysalaarggluvalargaspthrserleulys

820825830

valprohisglygluserglylysvalileglyileargvalpheser

835840845

arggluaspgluaspgluleuproalaglyvalasngluleuvalarg

850855860

valtyrvalalaglnlysarglysileseraspglyasplysleuala

865870875880

glyarghisglyasnlysglyvalileglylysileleuprovalglu

885890895

aspmetpropheleualaaspglythrprovalaspileileleuasn

900905910

thrhisglyvalproargargmetasnileglyglnileleugluthr

915920925

hisleuglytrpcysalahisserglytrplysvalaspalaalalys

930935940

glyvalproasptrpalaalaargleuproaspgluleuleugluala

945950955960

glnproasnalailevalserthrprovalpheaspglyalaglnglu

965970975

alagluleuglnglyleuleusercysthrleuproasnargaspgly

980985990

aspvalleuvalaspalaaspglylysalametleupheaspglyarg

99510001005

serglyglupropheprotyrprovalthrvalglytyrmettyrile

101010151020

metlysleuhishisleuvalaspasplysilehisalaargserthr

1025103010351040

glyprotyrsermetilethrglnglnproleuglyglylysalagln

104510501055

pheglyglyglnargpheglyglumetglucystrpalametglnala

106010651070

tyrglyalaalatyrthrleuglngluleuleuthrilelysserasp

107510801085

aspthrvalglyargvallysvaltyrglualailevallysglyglu

109010951100

asnileprogluproglyileprogluserphelysvalleuleulys

1105111011151120

gluleuglnserleucysleuasnvalgluvalleuserseraspgly

112511301135

alaalailegluleuarggluglygluaspgluaspleugluargala

114011451150

alaalaasnleuglyileasnleuserargasngluseralaserval

115511601165

gluaspleuala

1170

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ttcgatgaacccgaacgggttgacccgc28

<210>4

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

agttcttcggcaccagccagctgagcgaa29

<210>5

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tgtcggggttgacccacaagcgccgactttc31

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

caacccgctgtcggggttgactca24

<210>7

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gcaccagccagctgagccaattcatcga28

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

tcggtcgctataaggtcaac20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gctccaggaagggaatcatc20

<210>10

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

gacagcgagccgatcagaccgatgttggg29

<210>11

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

ccgatcagaccgatgttgggcccctcagg29

<210>12

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

tcgcggacctccagcccggcacgctcacg29

<210>13

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

gcaccagccagctgagccaattcataga28

<210>14

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

gcaccagccagctgagccaattcattga28

<210>15

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

cagaacaacccgctgtcggggttgactca29

<210>16

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

cagaacaacccgctgtcggggttgacgca29

<210>17

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

cagaacaacccgctgtcggggttgacaca29

<210>18

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

aacaacccgctgtcggggttgactca26

<210>19

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>19

tgtcggggttgacccacaagcgccgacggcc31

<210>20

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>20

tgtcggggttgacccacaagcgccgaccgcc31

<210>21

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>21

tgtcggggttgacccacaagcgccgacagcc31

<210>22

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>22

ggttgacccacaagcgccgacagcc25

<210>23

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>23

tgtcggggttgacccacaagcgccgactatc31

<210>24

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>24

tgtcggggttgacccacaagcgccgattatc31

<210>25

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>25

tgtcggggttgacccacaagcgccgactgtc31

<210>26

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>26

tgtcggggttgacccacaagcgccgactctc31

<210>27

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>27

tgtcggggttgacccacaagcgccgaccgtc31

<210>28

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>28

agttcttcggcaccagccagctgagctaa29

<210>29

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>29

agttcttcggcaccagccagctgagtcga29

<210>30

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>30

agttcttcggcaccagccagctgagcaga29

<210>31

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>31

agttcttcggcaccagccagctgagctga29