本发明涉及一种绿木霉菌的遗传转化方法。
背景技术：
木霉菌(trichodermaspp)属于丝状真菌，也是目前农业上研究最多、应用最广泛、效果最显著的生物防治真菌。木霉菌在代谢过程中产生的次生代谢产物，包括各类抗生素物质，如木霉菌素(trichodermin)、胶毒素(gliotoxin)、绿木霉素(viridin)以及抗菌肽(antibioticpeptide)等，这些次生代谢产物对植物病原物具有显著的拮抗效果，对植物的抗病研究和开发具有重要的意义。
真菌的次生代谢产物分别由不同的基因簇进行调控，对木霉菌的基因簇内的基因进行功能研究，可深入剖析木霉菌次生代谢产物的分子调控机制，以促进木霉菌次生代谢产物的开发及应用。
遗传转化是实现基因功能研究的主要技术，通过遗传转化，实现对目标基因的敲除或增加，进而验证基因的功能。目前，应用于丝状真菌的遗传转化技术包括电击转化、基于原生质体的peg/cacl2转化、基因枪转化和农杆菌介导转化等。其中，农杆菌介导的遗传转化技术，因其成本低、操作简单、转化效率高、遗传稳定等优点，得到了广泛的应用。真菌的农杆菌介导遗传转化，其作法和原理是：农杆菌是土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它的细胞的质粒载体中有一段t-dna(transferdna、转移dna、三螺旋dna)；先将目的基因插入到农杆菌的t-dna上；农杆菌通过侵染进入受体(丝状真菌)的细胞后，其t-dna脱落并插入到受体基因组中；实现外源基因(目的基因)向受体(丝状真菌)基因组的转移和整合；然后通过培养，得到转基因的丝状真菌菌株。
1998年，首次将农杆菌介导的遗传转化技术应用到丝状真菌中并获得了成功，其转化效率是普通方法的600倍。随后各实验室通过农杆菌介导的遗传转化技术对木霉菌进行遗传转化，成功构建木霉菌t-dna随机插入突变体库，为木霉菌基因功能研究提供了重要的实验材料。
但是，丝状真菌中的不同木霉菌，其转化效率差异大。绿木霉菌(trichodermavirens)，因分生孢子壁较厚，农杆菌难以侵染进入绿木霉的细胞，其遗传转化效率很低，严重限制了绿木霉(trichodermavirens)重要基因的功能验证及开发利用。为此，亟待开发高效率的绿木霉菌的遗传转化方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种高效的绿木霉菌的遗传转化方法，该方法能明显提高绿木霉菌的遗传转化效率，有利于对绿木霉菌的基因功能的验证、分析；从而更快、更好地发挥绿木霉菌对作物土传病害的防控和促进作物生长的作用，提高作物产量。
本发明实现其发明目的所采用的技术方案是，一种高效的绿木霉菌遗传转化方法，其步骤如下：
a、农杆菌的活化与扩大培养
将含有潮霉素抗性基因和目的基因的质粒载体，通过电击转化导入到农杆菌c58c1的感受态细胞的t-dna中，获得t-dna中携带有所述的质粒载体的阳性农杆菌菌株；将阳性农杆菌菌株,用lb固体培养基26-30℃培养48-60h；随后，挑取阳性农杆菌菌株到lb液体培养基中，26-30℃振荡培养48-60h；然后，4000rpm离心5min收集阳性农杆菌菌株；随后用im诱导培养基重悬浮阳性农杆菌菌株，并使悬浮液在600nm波长的吸光值至0.2-0.3，然后，28℃振荡培养6h，即得到扩大培养后的农杆菌菌液；
b、绿木霉菌分生孢子液的制备
将绿木霉菌用pda平板培养基、26-30℃活化培养至产生分生孢子，用灭菌水刮洗菌株菌面，并用三层擦镜纸过滤菌丝，得到分生孢子滤液；将分生孢子滤液4000-5000rpm离心5-10min，倒掉上清液，收集分生孢子；再用浓度0.6-0.8m的nacl溶液重悬浮分生孢子，并加入glucanex溶壁酶，加入量为每毫升nacl溶液加入15-20mg的glucanex溶壁酶；随后，30℃下、80rpm振荡培养2.5-4h；然后，将悬浮液4000rpm离心，弃滤液、得到分生孢子，再用浓度0.6-0.8m的nacl溶液清洗分生孢子1-2遍，并用单层擦镜纸过滤残渣，得到绿木霉菌分生孢子液，并调节其浓度至106个/ml；
c、农杆菌与绿木霉菌的共培养
将a步得到的农杆菌菌液和b步得到的绿木霉菌分生孢子液，等体积混合得到混合液；再将混合液均匀涂布于共培养平板培养基中，20-24℃暗培养68-76h，得到共培养物；
所述的共培养平板培养基，为每升im诱导培养基加入14-16克的琼脂粉，凝固而得；
d、转化子的初筛及稳定
在pda固体培养基中加入终浓度为140-160ug/ml的潮霉素抗生素，得到pda固体筛选培养基；
取pda固体筛选培养基，将其覆盖在c步得到的共培养物上，随后27-29℃培养至pda固体筛选培养基表面长出绿木霉菌菌株；长出的绿木霉菌菌株即为基因组中插入有农杆菌t-dna的绿木霉菌初筛转化子；
挑取出绿木霉菌初筛转化子，将其接种至另取的pda固体筛选培养基上，然后，27-29℃培养至pda固体筛选培养基表面长出绿木霉菌菌株；长出的绿木霉菌菌株即为稳定生长的、基因组中插入有农杆菌t-dna的绿木霉菌转化子。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
一、申请人发现，glucanex溶壁酶，能够酶解绿木霉菌(trichodermavirens)的分生孢子壁，使农杆菌能够顺利侵染进入绿木霉的细胞；从而大幅提高农杆菌质粒载体中含有目的基因的t-dna转入绿木霉菌基因组的转化效率。进而有利于绿木霉菌基因敲除及t-dna随机插入突变体库的构建，方便绿木霉(trichodermavirens)重要基因的功能验证、开发利用，促进木霉菌次生代谢产物的开发及应用。
实验表明，将目的基因(胶毒素合成候选基因)转入绿木霉菌基因组的遗传转化操作中：
本发明方法在共培养出的2x106个绿木霉菌分生孢子中，用pda固体筛选培养基通过潮霉素抗性筛选，筛出22个抗性检测阳性的绿木霉菌转化子。基因特异引物鉴定结果显示：这22个抗性检测阳性的转化子中，有3个确实是在目标位置转入了目标基因的同源重组转化子；有17个不是在目标位置转入了目标基因的异位整合转化子；另有2个转化子的基因组与转化前的绿木霉菌的基因组一致，为假阳性转化子。
而用传统方法在共培养出的12x106个绿木霉菌分生孢子中，用pda固体筛选培养基通过潮霉素抗性筛选，仅选出3个抗性检测阳性的绿木霉菌转化子。基因特异引物鉴定结果显示：这3个均是在其它位置转入了目标基因的异位整合转化子；而不是在目标位置转入了目标基因的同源重组转化子。
总之，本发明方法大幅提高了农杆菌质粒载体中含有目的基因的t-dna转入绿木霉菌基因组的转化效率，仅需共培养少量的绿木霉菌分生孢子，即可成功得到在基因组目标位置转入了目标基因(同源重组)的绿木霉菌转化子。
二、现有的绿木霉菌农杆菌介导遗传转化方法，需要将农杆菌悬浮液与绿木霉分生孢子悬浮液涂布于灭菌的滤膜或滤纸上，共培养完成后；再将滤膜或滤纸掀出，剪成5cm条状或整片铺于潮霉素抗性筛选培养基中进行转化子的筛选；其操作不仅费时、费人工，且农杆菌容易污染。本发明方法，是直接将潮霉素抗性筛选培养基倒入、覆盖在共培养好的菌丝上，大大减少了操作步骤及污染概率；同时，由于共培养物受到潮霉素筛选培养基的全面覆盖，明显提高了阳性转化子的筛选效率，有效减少了假阳性转化子的出现。
进一步，本发明的im诱导培养基由以下方法配制而得：
配制浓度为0.9-1.1m的mes生物缓冲液,并用naoh调ph到5.4-5.6；
往400ml的mes生物缓冲液中加入600ml的水；再加入1.5-1.6g的k2hpo4、1.1-1.3g的kh2po4、5-7g的mgso4·7h2o、2.5-3.5g的nacl、9-11mg的cacl2·2h2o、47-53mg的nh4no3、4.5-5.5g的甘油、4.5-5.5mg的znso4·7h2o、4.5-5.5mg的cuso4·5h2o、4.5-5.5mg的mnso4·h2o、4.5-5.5mg的na2moo4·7h2o、4.5-5.5mg的h3bo3、18-22mg的葡萄糖、1mg的feso4，得混合液；
将混合液121℃高温高压灭菌后，加入终浓度为200μm的乙酰丁香酮，即得。
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
实施例1
本发明的一种具体实施方式是，一种高效的绿木霉菌遗传转化方法，其步骤如下：
a、农杆菌的活化与扩大培养
将含有潮霉素抗性基因和目的基因的质粒载体，通过电击转化导入到农杆菌c58c1的感受态细胞的t-dna中，获得t-dna中携带有所述的质粒载体的阳性农杆菌菌株；将阳性农杆菌菌株,用lb固体培养基26℃培养48h；随后，挑取阳性农杆菌菌株到lb液体培养基中，26℃振荡培养48h；然后，4000rpm离心5min收集阳性农杆菌菌株；随后用im诱导培养基重悬浮阳性农杆菌菌株，并使悬浮液在600nm波长的吸光值至0.2，然后，28℃振荡培养6h，即得到扩大培养后的农杆菌菌液；
b、绿木霉菌分生孢子液的制备
将绿木霉菌用pda平板培养基、26℃活化培养至产生分生孢子，用灭菌水刮洗菌株菌面，并用三层擦镜纸过滤菌丝，得到分生孢子滤液；将分生孢子滤液4000rpm离心10min，倒掉上清液，收集分生孢子；再用浓度0.6m的nacl溶液重悬浮分生孢子，并加入glucanex溶壁酶，加入量为每毫升nacl溶液加入15mg的glucanex溶壁酶；随后，30℃下、80rpm振荡培养2.5h；然后，将悬浮液4000rpm离心，弃滤液、得到分生孢子，再用浓度0.6m的nacl溶液清洗分生孢子1遍，并用单层擦镜纸过滤残渣，得到绿木霉菌分生孢子液，并调节其浓度至106个/ml；
c、农杆菌与绿木霉菌的共培养
将a步得到的农杆菌菌液和b步得到的绿木霉菌分生孢子液，等体积混合得到混合液；再将混合液均匀涂布于共培养平板培养基中，24℃暗培养68h，得到共培养物；
所述的共培养平板培养基，为每升im诱导培养基加入14克的琼脂粉，凝固而得；
d、转化子的初筛及稳定
在pda固体培养基中加入终浓度为140ug/ml的潮霉素抗生素，得到pda固体筛选培养基；
取pda固体筛选培养基，将其覆盖在c步得到的共培养物上，随后27℃培养至pda固体筛选培养基表面长出绿木霉菌菌株；长出的绿木霉菌菌株即为基因组中插入有农杆菌t-dna的绿木霉菌初筛转化子；
挑取出绿木霉菌初筛转化子，将其接种至另取的pda固体筛选培养基上，然后，27℃培养至pda固体筛选培养基表面长出绿木霉菌菌株；长出的绿木霉菌菌株即为稳定生长的、基因组中插入有农杆菌t-dna的绿木霉菌转化子。
本发明的im诱导培养基由以下方法配制而得：
配制浓度为0.9m的mes生物缓冲液,并用naoh调ph到5.4；
往400ml的mes生物缓冲液中加入600ml的水；再加入1.5g的k2hpo4、1.2g的kh2po4、6g的mgso4·7h2o、3g的nacl、10mg的cacl2·2h2o、50mg的nh4no3、5g的甘油、5mg的znso4·7h2o、5mg的cuso4·5h2o、5mg的mnso4·h2o、5mg的na2moo4·7h2o、5mg的h3bo3、20mg的葡萄糖、1mg的feso4，得混合液；
将混合液121℃高温高压灭菌后，加入终浓度为200μm的乙酰丁香酮，即得。
实施例2
一种高效的绿木霉菌遗传转化方法，其步骤如下：
a、农杆菌的活化与扩大培养
将含有潮霉素抗性基因和目的基因的质粒载体，通过电击转化导入到农杆菌c58c1的感受态细胞的t-dna中，获得t-dna中携带有所述的质粒载体的阳性农杆菌菌株；将阳性农杆菌菌株,用lb固体培养基30℃培养60h；随后，挑取阳性农杆菌菌株到lb液体培养基中，30℃振荡培养60h；然后，4000rpm离心5min收集阳性农杆菌菌株；随后用im诱导培养基重悬浮阳性农杆菌菌株，并使悬浮液在600nm波长的吸光值至0.3，然后，28℃振荡培养6h，即得到扩大培养后的农杆菌菌液；
b、绿木霉菌分生孢子液的制备
将绿木霉菌用pda平板培养基、30℃活化培养至产生分生孢子，用灭菌水刮洗菌株菌面，并用三层擦镜纸过滤菌丝，得到分生孢子滤液；将分生孢子滤液5000rpm离心5min，倒掉上清液，收集分生孢子；再用浓度0.8m的nacl溶液重悬浮分生孢子，并加入glucanex溶壁酶，加入量为每毫升nacl溶液加入20mg的glucanex溶壁酶；随后，30℃下、80rpm振荡培养4h；然后，将悬浮液4000rpm离心，弃滤液、得到分生孢子，再用浓度0.8m的nacl溶液清洗分生孢子2遍，并用单层擦镜纸过滤残渣，得到绿木霉菌分生孢子液，并调节其浓度至106个/ml；
c、农杆菌与绿木霉菌的共培养
将a步得到的农杆菌菌液和b步得到的绿木霉菌分生孢子液，等体积混合得到混合液；再将混合液均匀涂布于共培养平板培养基中，20℃暗培养76h，得到共培养物；
所述的共培养平板培养基，为每升im诱导培养基加入16克的琼脂粉，凝固而得；
d、转化子的初筛及稳定
在pda固体培养基中加入终浓度为160ug/ml的潮霉素抗生素，得到pda固体筛选培养基；
取pda固体筛选培养基，将其覆盖在c步得到的共培养物上，随后29℃培养至pda固体筛选培养基表面长出绿木霉菌菌株；长出的绿木霉菌菌株即为基因组中插入有农杆菌t-dna的绿木霉菌初筛转化子；
挑取出绿木霉菌初筛转化子，将其接种至另取的pda固体筛选培养基上，然后，29℃培养至pda固体筛选培养基表面长出绿木霉菌菌株；长出的绿木霉菌菌株即为稳定生长的、基因组中插入有农杆菌t-dna的绿木霉菌转化子。
本发明的im诱导培养基由以下方法配制而得：
配制浓度为1.1m的mes生物缓冲液,并用naoh调ph到5.6；
往400ml的mes生物缓冲液中加入600ml的水；再加入1.55g的k2hpo4、1.1g的kh2po4、5g的mgso4·7h2o、2.5g的nacl、9mg的cacl2·2h2o、47mg的nh4no3、4.5g的甘油、4.5mg的znso4·7h2o、4.5mg的cuso4·5h2o、4.5mg的mnso4·h2o、4.5mg的na2moo4·7h2o、4.5mg的h3bo3、18mg的葡萄糖、1mg的feso4，得混合液；
将混合液121℃高温高压灭菌后，加入终浓度为200μm的乙酰丁香酮，即得。
实施例3
一种高效的绿木霉菌遗传转化方法，其步骤如下：
a、农杆菌的活化与扩大培养
将含有潮霉素抗性基因和目的基因的质粒载体，通过电击转化导入到农杆菌c58c1的感受态细胞的t-dna中，获得t-dna中携带有所述的质粒载体的阳性农杆菌菌株；将阳性农杆菌菌株,用lb固体培养基28℃培养54h；随后，挑取阳性农杆菌菌株到lb液体培养基中，28℃振荡培养54h；然后，4000rpm离心5min收集阳性农杆菌菌株；随后用im诱导培养基重悬浮阳性农杆菌菌株，并使悬浮液在600nm波长的吸光值至0.25，然后，28℃振荡培养6h，即得到扩大培养后的农杆菌菌液；
b、绿木霉菌分生孢子液的制备
将绿木霉菌用pda平板培养基、268℃活化培养至产生分生孢子，用灭菌水刮洗菌株菌面，并用三层擦镜纸过滤菌丝，得到分生孢子滤液；将分生孢子滤液4500rpm离心7min，倒掉上清液，收集分生孢子；再用浓度0.7m的nacl溶液重悬浮分生孢子，并加入glucanex溶壁酶，加入量为每毫升nacl溶液加入18mg的glucanex溶壁酶；随后，30℃下、80rpm振荡培养3h；然后，将悬浮液4000rpm离心，弃滤液、得到分生孢子，再用浓度0.7m的nacl溶液清洗分生孢子1遍，并用单层擦镜纸过滤残渣，得到绿木霉菌分生孢子液，并调节其浓度至106个/ml；
c、农杆菌与绿木霉菌的共培养
将a步得到的农杆菌菌液和b步得到的绿木霉菌分生孢子液，等体积混合得到混合液；再将混合液均匀涂布于共培养平板培养基中，22℃暗培养72h，得到共培养物；
所述的共培养平板培养基，为每升im诱导培养基加入15克的琼脂粉，凝固而得；
d、转化子的初筛及稳定
在pda固体培养基中加入终浓度为150ug/ml的潮霉素抗生素，得到pda固体筛选培养基；
取pda固体筛选培养基，将其覆盖在c步得到的共培养物上，随后28℃培养至pda固体筛选培养基表面长出绿木霉菌菌株；长出的绿木霉菌菌株即为基因组中插入有农杆菌t-dna的绿木霉菌初筛转化子；
挑取出绿木霉菌初筛转化子，将其接种至另取的pda固体筛选培养基上，然后，28℃培养至pda固体筛选培养基表面长出绿木霉菌菌株；长出的绿木霉菌菌株即为稳定生长的、基因组中插入有农杆菌t-dna的绿木霉菌转化子。
所述的im诱导培养基由以下方法配制而得：
配制浓度为1.0m的mes生物缓冲液,并用naoh调ph到5.5；
往400ml的mes生物缓冲液中加入600ml的水；再加入1.6g的k2hpo4、1.3g的kh2po4、7g的mgso4·7h2o、3.5g的nacl、11mg的cacl2·2h2o、53mg的nh4no3、5.5g的甘油、5.5mg的znso4·7h2o、5.5mg的cuso4·5h2o、5.5mg的mnso4·h2o、5.5mg的na2moo4·7h2o、5.5mg的h3bo3、22mg的葡萄糖、1mg的feso4，得混合液；
将混合液121℃高温高压灭菌后，加入终浓度为200μm的乙酰丁香酮，即得。
以下给出本发明方法应用于将胶毒素合成候选基因作为目的基因转入绿木霉菌基因组中的实验结果。
实验结果：
根据胶毒素合成候选基因(目的基因)序列设计引物，通过超保真dna聚合酶分别扩增得到目标基因5’端1016bp及3’端892bp的片段，作为基因转入的左同源臂(lf)及右同源臂(rf)，将lf、rf组装到改造好的pgko2-hyp质粒载体的潮霉素抗性基因(hyp)两侧，得到含有潮霉素抗性基因和目的基因的质粒载体。
将含有潮霉素抗性基因和目的基因的质粒载体和绿木霉菌t23，按本发明的方法进行遗传转化实验。实验结果如下：
在共培养出的2×106个绿木霉菌分生孢子中，用pda固体筛选培养基通过潮霉素抗性筛选，筛出22个抗性检测阳性的绿木霉菌转化子。基因特异引物鉴定结果显示：这22个抗性检测阳性的转化子中，有3个确实是在目标位置转入了目标基因的同源重组转化子；有17个不是在目标位置转入了目标基因的异位整合转化子；另有2个转化子的基因组与转化前的绿木霉菌的基因组一致，为假阳性转化子。
而用现有的农杆菌介导的遗传转化方法，在共培养出的12×106个绿木霉菌t23分生孢子中，用pda固体筛选培养基通过潮霉素抗性筛选，仅选出3个抗性检测阳性的绿木霉菌转化子。基因特异引物鉴定结果显示：这3个均是在其它位置转入了目标基因的异位整合转化子；而不是在目标位置转入了目标基因的同源重组转化子。
总之，现有的农杆菌介导的遗传转化方法在绿木霉菌t23的转化效率极低，在6倍于本发明方法的共培养出绿木霉菌t23分生孢子中只能获得少数几个转化子，分子鉴定结果均为异位整合插入，并没有鉴定到同源重组的目标基因转入突变体。本发明方法仅用现有方法六分之一的共培养绿木霉菌分生孢子，即得到22个转化子，分子鉴定结果到同源重组的目标基因转入突变体3个。本发明方法大幅提高了绿木霉菌基因的转化效率。有利于对绿木霉菌的基因功能的验证、分析；从而更快、更好地发挥绿木霉菌对作物土传病害的防控和促进作物生长的作用，提高作物产量。