双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒的制作方法

文档序号:22039537发布日期:2020-08-28 17:55阅读:来源:国知局

技术特征:

1.双报告基因骨架载体,其特征在于:包括选自慢病毒遗传物质的双报告基因骨架载体,所述双报告基因骨架载体的双报告基因选自荧光素酶和荧光蛋白,荧光素酶报告基因的上游是调节转录的启动子,其中所述启动子优选自hef1a启动子;所述荧光蛋白报告基因的上游是增强型转录启动子e-ires;所述双报告基因骨架载体命名为pdlv19-mgfp-fluc。

2.如权利要求1所述双报告基因骨架载体,其特征在于:所述双报告基因包括荧光蛋白报告基因和荧光素酶报告基因,所述的荧光蛋白报告基因选自绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白;所述荧光素酶报告基因选自萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶。

3.如权利要求2所述双报告基因骨架载体,其特征在于:所述荧光蛋白报告基因选择修饰的绿色荧光蛋白mgfp基因,所述绿色荧光蛋白mgfp基因的序列为seqidno:1;所述荧光素酶报告基因选自密码子优化的萤火虫荧光素酶fluc基因,所述萤火虫荧光素酶fluc基因的序列为seqidno:2。

4.如权利要求3所述双报告基因骨架载体,其特征在于:所述萤火虫荧光素酶fluc基因的上游是hef1a启动子,所述hef1a启动子基因序列为seqidno:3,所述绿色荧光蛋白mgfp基因的上游是ecmv-ires增强启动子,所述ecmv-ires增强启动子的基因序列为seqidno:4。

5.如权利要求3或4任一所述双报告基因骨架载体,其特征在于:所述绿色荧光蛋白mgfp基因位于荧光素酶fluc基因的下游,所述绿色荧光蛋白mgfp基因起始密码子序列之前添加了kozak序列。

6.如权利要求1所述双报告基因骨架载体,其特征在于:所述pdlv19-mgfp-fluc双报告基因骨架载体具有seqidno:5的序列。

7.一种四质粒假病毒包装系统,其特征在于:由权利要求1~6中任一双报告基因骨架载体pdlv19-mgfp-fluc、3种真核表达包装质粒组成;其中所述3种真核表达包装质粒分别整合慢病毒gag-pol基因、慢病毒rev基因以及含有目的病毒的包膜蛋白基因。

8.如权利要求7所述四质粒假病毒包装系统,其特征在于:所述3种真核表达包装质粒选自pcaggs,质粒pcaggs中cmv启动子的序列优选替换为:

(1)ef1a启动子;

(2)包含有人巨细胞病毒主要即刻早期蛋白基因增强型启动子。

9.如权利要求8所述四质粒假病毒包装系统,其特征在于:所述含有慢病毒gag-pol的真核表达包装质粒具有seqidno:6序列,所述包装质粒命名为psl4-gag-pol;所述含有慢病毒rev基因的真核表达包装质粒具有seqidno:7序列,所述包装质粒命名为psl5-rev。

10.如权利要求8所述四质粒假病毒包装系统,其特征在于:所述pcaggs真核表达包装质粒在宿主细胞水平表达目的病毒的包膜蛋白,所述pcaggs真核表达包装质粒细胞水平表达的包膜蛋白选自冠状病毒、疱疹病毒、痘病毒、嗜肝病毒、丝状病毒、棒状病毒、流感病毒、副粘病毒、黄病毒、弹状病毒、副粘病毒、黄病毒、包膜病毒、布尼亚病毒或逆转录病毒的一种病毒或多种病毒。

11.权利要求10所述四质粒假病毒包装系统,其特征在于:所述冠状病毒优选为sars-cov-2或sars;所述嗜肝病毒优选为乙肝病毒或丙肝病毒;所述丝状病毒优选为ebola病毒;所述弹状病毒优选为狂犬病毒;所述副粘病毒优选为麻疹病毒或呼吸道合胞病毒;所述黄病毒优选为寨卡病毒或登革热病毒。

12.权利要求10所述四质粒假病毒包装系统,其特征在于:所述真核表达包装质粒表达的包膜蛋白选自冠状病毒sars-cov-2,所述双报告基因四质粒假病毒包装系统用于制备新冠假病毒时,所述冠状病毒包膜蛋白选自:(1)刺突蛋白s全长氨基酸,即seqidno:8序列、(2)刺突蛋白s的3’端缺失19个氨基酸,即seqidno:9序列、(3)刺突蛋白s的3’端缺失28个氨基酸,即seqidno:10序列或(4)刺突蛋白s的3’端缺失53个氨基酸且同时融合vsv包膜蛋白的胞内段,即seqidno:11序列;对应的所述pcaggs真核表达包装质粒在宿主细胞水平表达的囊膜蛋白的质粒命名分别为psl3-s、s19、s28、s53c。

13.一种包装新冠肺炎假病毒,其特征在于:包括权利要求7~12任一所述双报告基因四质粒假病毒包装系统、宿主细胞,所述宿主细胞选自293、293t、293sus、hek293、hek293t或hek293ft细胞。


技术总结
双报告基因骨架载体,包括双报告基因骨架载体,其双报告基因选自荧光素酶和荧光蛋白,荧光蛋白报告基因优选mGFP基因,荧光素酶报告基因优选Fluc基因;双报告基因四质粒假病毒包装系统包括双报告基因骨架载体以及分别整合慢病毒gag‑pol基因、慢病毒rev基因以及含有目的病毒的包膜蛋白基因的3种真核表达包装质粒;包装新冠肺炎假病毒包括双报告基因四质粒假病毒包装系统、宿主细胞,所述宿主细胞优选自293T‑hACE2细胞。本发明对SARS‑CoV‑2进行具体实施,可快速包装出单周期感染且安全性更高的假病毒,可用于SARS‑Cov2等冠状病毒的研究,为抗病毒制剂和疫苗的评价提供了有力的筛选工具,具备广泛的应用价值。

技术研发人员:吴飞;秦晓峰;韦治明;杜晓红;杨仁祥
受保护的技术使用者:苏州奥特铭医药科技有限公司
技术研发日:2020.03.18
技术公布日:2020.08.28
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