一种高效富集N-DAMO细菌的便捷方法及装置与流程

本发明涉及一种高效富集n-damo细菌的便捷方法及装置，属于厌氧甲烷氧化微生物富集领域。

背景技术：

在废水生物处理过程中，或多或少都有ch4的产生和释放，在保护水环境的同时，却增加了大气温室气体含量。另一方面，由于有机碳源的不足，常规的硝化反硝化废水生物处理技术很难实现经济高效脱氮，甚至难以达标排放。

现有亚硝酸盐型厌氧甲烷氧化(nitrite-dependentanaerobicmethaneoxidation，n-damo)可以解决ch4的减排和废水生物脱氮碳源不足的问题。n-damo过程是以ch4为电子供体，还原亚硝酸盐no2^-生成氮气n2。其反应方程式为：3ch4+8no2^-+8h⁺→3co2+4n2+10h2oδg⁰'＝-928kjmol^-1。该过程广泛存在于农田、湿地、河湖等自然生态环境中，是生物圈碳氮循环的重要环节。但是n-damo细菌是自养型微生物，生长代谢缓慢，富集培养困难，较难开展工程应用与实践。并且现有关于n-damo细菌的富集培养研究，大都集中在反应器改进以提高ch4的吸收利用率。然而，这些方法大都存在培养系统复杂，运行管理成本较高等缺点，不足以支撑科学研究和工程应用技术研发对n-damo菌种资源的需求。因此，提供一种快速简便富集n-damo细菌的方法以及装置，快速简便地获得n-damo细菌培养物，为n-damo菌种资源获取、理论研究及工程应用技术研发提供基础是十分必要的。

技术实现要素：

本发明为了解决现有富集n-damo细菌存在的生长代谢缓慢，富集培养困难等问题，提供一种高效富集n-damo细菌的便捷方法及装置。

本发明的技术方案：

一种高效富集n-damo细菌的便捷装置，该装置包括反应系统、甲烷供气系统和换水系统，反应系统分别与甲烷供气系统和换水系统连通；

所述的反应系统包括反应器玻璃瓶9、气压平衡管7和气袋8，气压平衡管7的一端穿过反应器玻璃瓶9的密封瓶塞插入反应器玻璃瓶9的内部，气压平衡管7的另一端与气袋8连通，气压平衡管7上设有中止阀；

所述的甲烷供气系统包括甲烷气瓶14、换气管1和曝气头10，换气管1的一端与甲烷气瓶14连通，换气管1的另一端穿过反应器玻璃瓶9的密封瓶塞与置于反应器玻璃瓶9内的曝气头10连接，换气管1上设有中止阀；

所述的换水系统包括储液瓶12、换水管3、蠕动泵5、气压平衡管7和气袋8，换水管3的一端穿过反应器玻璃瓶9的密封瓶塞插入应器玻璃瓶9内部，换水管3另一端与蠕动泵5的软管一端连接，换水管3上设有中止阀，蠕动泵5软管的另一端穿过储液瓶12的密封瓶塞插入储液瓶12内部，气压平衡管7的一端穿过储液瓶12的密封瓶塞插入储液瓶12内部，气压平衡管7的另一端与气袋8连通，气压平衡管7上设有中止阀。

进一步限定，反应器玻璃瓶9为容积为1l的广口瓶。

进一步限定，气压平衡管7插入瓶内距离为0.5cm。

使用上述装置高效富集n-damo细菌的方法，该方法的具体操作过程为：

第一阶段：在反应器玻璃瓶9中加入液体基础培养基、亚硝酸盐和湿地土壤，打开换气管1上的中止阀充入甲烷，充气完毕后，关上中止阀，置于空气浴振荡器中密闭培养，培养24h后进去第二阶段；

第二阶段：打开蠕动泵5和换水管3上的中止阀，将反应器玻璃瓶9中上清液排至储液瓶12内，倒掉储液瓶12内的液体后，将添加了亚硝酸盐的液体基础培养基注入储液瓶12内，改变蠕动泵5软管内液体流动方向，并保证换水管3管口与反应器玻璃瓶9的瓶底距离为2cm，将储液瓶12内的新鲜的液体基础培养基注入反应器玻璃瓶9中，更换液体基础培养基完毕后，关闭蠕动泵5和换水管3上的中止阀，然后打开换气管1上的中止阀充入甲烷，充气完毕后，关闭换气管1上的中止阀，继续放置在空气浴振荡器中密闭培养；

第三阶段：重复上述第二阶段至第60天。

进一步限定，每升液体基础培养基中包括的0.25gkhco3，0.30gcacl2·2h2o，0.05gkh2po4，0.20gmgso4·3h2o，0.5ml酸性微量元素液和0.2ml碱性微量元素液。

更进一步限定，每升酸性微量元素液包含：2.085gfeso4·3h2o，0.120gcocl2·6h2o，0.320gcuso4，0.014gh3bo3，0.068gznso4·3h2o，0.500gmncl2·4h2o，0.095gnicl2·6h2o和8.75mlhcl，其中hcl的浓度为12m。

更进一步限定，每升碱性微量元素液包含：0.063gseo2，0.050gna2wo4·2h2o，0.242gna2moo4和0.400gnaoh。

进一步限定，亚硝酸盐为nano2，添加nano2使其在液体基础培养基中的浓度为1mmol/l。

进一步限定，每个第二阶段时长为24h，其中反应器玻璃瓶9中上清液排出时间为15min，注入新鲜的添加了亚硝酸盐的液体基础培养基的时间为10min，补充甲烷气体时间为5min，在空气浴振荡器中密闭培养时间为19.5h。

更进一步限定，反应器玻璃瓶9中密闭培养条件为：温度为30±1℃、ph为7.0-7.5，瓶内气压为101kpa。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的提供的n-damo细菌培养基，更加有利于富集n-damo菌群；

(2)本发明的方法可较快地有效富集n-damo菌群，为n-damo细菌菌种的资源获得和工程应用提供了方法指导；

(3)本发明提供的装置反应器及配套装置的组件便宜易得，组装简便，利于工程应用。

附图说明

图1为本发明富集n-damo细菌的装置示意图。

图中1-换气管，3-换水管，5-蠕动泵，7-气压平衡管，8-气袋，9-反应器玻璃瓶9，10-曝气头，12-储液瓶，14-甲烷气瓶。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

具体实施方式1

将富集n-damo细菌的装置组装，如图1所示。

第一阶段：取自然保护区40-60cm深的湿地土壤100g置于反应器玻璃瓶9内，添加液体基础培养基0.6l，添加nano2使其在液体基础培养基中的浓度为1mmol/l。使用1mol/l的hcl调节ph值为7.0-7.5，打开换气管1的中止阀，充入高纯(99.99％)甲烷气体，5min后关闭换气管1的中止阀，将整个系统密封后，置于空气浴振荡器中，在30℃、甲烷分压(pch4)101kpa条件下持续培养，24h后，no2^-消耗殆尽，反应结束，沉淀静置。

第二阶段：打开蠕动泵5和换水管3上的中止阀，将反应器玻璃瓶9中0.4l的上清液排至储液瓶12内，倒掉储液瓶12内的液体后，将添加了nano2的液体基础培养基注入储液瓶12内，其中nano2含量为1mmol/l，改变蠕动泵5软管内液体流动方向，并保证换水管3管口与反应器玻璃瓶9的瓶底距离为2cm，将储液瓶12内的新鲜的液体基础培养基注入反应器玻璃瓶9中，输入液体基础培养基的体积为0.4l，关更换液体基础培养基完毕后，关闭蠕动泵5和换水管3上的中止阀，将装置继续放置在空气浴振荡器中密闭培养

第三阶段：重复上述第二阶段至第60天。

其中每升上述液体基础培养基中包括的0.25gkhco3，0.30gcacl2·2h2o，0.05gkh2po4，0.20gmgso4·3h2o，0.5ml酸性微量元素液和0.2ml碱性微量元素液。其中每升酸性微量元素液包含：2.085gfeso4·3h2o，0.120gcocl2·6h2o，0.320gcuso4，0.014gh3bo3，0.068gznso4·3h2o，0.500gmncl2·4h2o，0.095gnicl2·6h2o和8.75mlhcl，其中hcl的浓度为12m。每升碱性微量元素液包含：0.063gseo2，0.050gna2wo4·2h2o，0.242gna2moo4和0.400gnaoh。

每个第二阶段时长为24h，故具体实施方式1的整个n-damo细菌富集过程时长为60d，在反应器玻璃瓶9中获得富集培养物。对富集培养物中no2^-含量进行检测，发现富集培养物对no2^-的去除效率高达99％，说明使用本发明的装置以及方法富集n-damo菌群成功，并且n-damo菌群具备了优良的n-damo代谢活性。

具体实施方式2

考察在不同ph、温度、nacl浓度条件下测试n-damo细菌的环境适应性。

方案一：与具体实施方式一不同的是，分别在不同ph条件下的液体基础培养基富集n-damo(使用1mol/l的hcl溶液或1mol/l的naoh溶液调节液体基础培养基的ph值)。考察ph梯度为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0。对比可知，在ph7-8条件下，更有利于n-damo细菌的富集，n-damo细菌表现出良好的代谢活性。

方案二：与具体实施方式一不同的是，分别在不同温度条件下富集n-damo。考察温度梯度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃。对比可知，温度在30℃-40℃，更有利于n-damo细菌的富集，n-damo细菌表现出良好的代谢活性。

方案三：与具体实施方式一不同的是，在液体基础培养中加入nacl，nacl在液体基础培基液中浓度分别为0g/l、1.0g/l、2.5g/l、5.0g/l、10.0g/l和15.0g/l。对比可知，当液体基础培基液中nacl浓度为0g/l～5g/l，更有利于n-damo细菌的富集，n-damo细菌表现出良好的代谢活性。

具体实施方式3

生长因子(维生素、血红素和甜菜碱)能够进一步提高n-damo细菌的代谢生长能力。

方案四：与具体实施方式一不同的是，在液体基础培养中加入维生素液，维生素液在液体基础培基液中浓度分别为0ml/l、0.01ml/l、0.02ml/l、0.03ml/l、0.05ml/l、0.07ml/l和0.10ml/l。对比可知，添加维生素液能显著提高damo菌的生长代谢活性，当维生素液为0.02ml/l更有利于n-damo细菌的富集，n-damo细菌表现出良好的代谢活性。其中，1l维生素液中包含2.00g生物素，5.00g盐酸硫胺素，5.00gd-ca-泛酸，5.00g硫辛酸，2.00g叶酸，5.00g核黄素，0.10g微生物b12，10.00g维生素b6，5.00g烟酸和5.00g对氨基苯甲酸。

方案五：与具体实施方式一不同的是，在液体基础培养中加入血红素，血红素在液体基础培基液中浓度分别为0μg/l、2μg/l、4μg/l、6μg/l、10μg/l、15μg/l、20μg/l和30μg/l。对比可知，添加血红素能显著提高damo菌的生长代谢活性，当血红素为6μg/l更有利于n-damo细菌的富集，n-damo细菌表现出良好的代谢活性。

方案六：与具体实施方式一不同的是，在液体基础培养中加入甜菜碱，甜菜碱在液体基础培基液中浓度分别为0mg/l、0.1mg/l、0.2mg/l、0.3mg/l、0.5mg/l、0.7mg/l和1.0mg/l。对比可知，添加甜菜碱能显著提高damo菌的生长代谢活性，当甜菜碱为0.5mg/l更有利于n-damo细菌的富集，n-damo细菌表现出良好的代谢活性。