一种LAMP引物在检测荷叶黑斑病菌中的应用的制作方法

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种lamp引物在检测荷叶黑斑病菌中的应用。

背景技术：

荷叶黑斑病，又名褐纹病，在我国荷花栽培区常有发生，尤其在华南、华东地区和盆养的公园及家庭盆养发生尤为严重。该病发病初期叶片出现褪绿大黄斑，叶背面更为明显，随着病情的不断发展，病斑逐渐扩大呈不规则形褐斑，直径5～15毫米，边缘有时具黄绿色晕圈，病斑具同心轮纹，上生黑色霉层，发生严重时，除叶脉外，整个叶片布满病斑，叶片焦黄，病区似火烧一般，不能开花，提早死亡，影响藕生产和荷花观赏。

引起荷叶黑斑病的病原菌是链格孢属中的莲链格孢(alternarianelumbii)除了为害莲耦外，还为害睡莲、碗莲、王莲、茨实等植物。病原菌的准确鉴定与检测是病害防控的前期基础，病原菌传统的鉴定和检测流程通常如下：从发病组织中分离病原菌、采用形态学特征对病原菌进行初步鉴定、再通过柯赫氏法则对病原菌进行最终确定。这种运用形态学方法进行鉴定不仅困难且耗时费力，不能满足病害快速、准确鉴定、诊断的需求。

随着分子生物学技术的发展，常规pcr、巢式pcr和实时荧光定量pcr等dna体外pcr扩增技术成功地应用于植物病原菌的准确鉴定和快速检测中。pcr技术虽然提升了病原菌鉴定的准确性和检测的快速性，但仍存在需要依赖精密的pcr仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备、操作繁琐和操作人员需具备一定分子生物学技术等问题，使得该技术在经济欠发达地区和基层农业部门的使用、推广受到很大的限制。

因此，如何提供一种特异性强、速度快、操作简单的荷叶黑斑病的检测方法是本领域亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明公开了一种lamp引物在检测荷叶黑斑病菌中的应用，本发明操作方法简单，检测速度快，特异性强，灵敏度高。克服了传统检测方法操作复杂、准确性低等问题

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种lamp引物在检测荷叶黑斑病菌中的应用，其特征在在于，引物序列为：

f3：5’-tgaagctcaccaaggacgt-3’；seqidno1；

b3：5’-tggaggcgtaagtgtatcgg-3’；seqidno2；

fip：5’-atgctggccttgacagccatc-acaagtacctccagcgatgt-3’；seqidno3；

bip：5’-ggcctgaaatactccctggca-gagagacaccggctttcg-3’seqidno4；

所述lamp反应体系中各物浓度：0.1-2μmf3和b3，0.5-5μmfip和bip，2×lamp反应混合液，5-20ubst聚合酶，5-20ng模板dna，h2o补齐至25μl；

优选的，f3和b3为0.1-0.3μm；

优选的，fip和bip为1-2μm；

优选的，bst聚合酶为5-10u；

所述lamp反应混合液由以下组分组成：40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱，2.0mmdntps，0.2wt.％trionx-100；

所述lamp反应温度为61-64℃，反应时间30-90min；

所述lamp反应结束后，加入显色剂，在显色结果为阳性，则性在荷叶黑斑病菌；阴性则五荷叶黑斑病菌；

显色剂优选为sybrgreen，在正常光照下，显色结果观察到绿色荧光，并且在紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，即存在荷叶黑斑病菌，在正常光照下，显色结果观察到橙色或橘黄色，且在紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性，即不存在荷叶黑斑病菌。

综上所述，本发明建立了荷叶黑斑病菌的快速、简便、特异性强、灵敏度高的lamp检测技术体系，可用于荷叶黑斑病菌的检测，或用于荷叶黑斑病的发病前期、初期检测，对于确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

特异性强：可在79个近源菌属中，准确的鉴定出荷黑斑病，克服了lamp反应易产生假阳性的弊端；

灵敏度高：本发明对荷叶黑斑病菌的检测灵敏度在dna水平上可达到10fg/μl，具有很高的灵敏性；

检测速度快：pcr或巢式pcr检测需4～6h才可得到检测结果，本发明应用本发明检测方法，可在1～1.5h得到检测结果，大大缩短了操作时间，方便快速；

应用性好：本发明lmap扩增反应在一个温度下扩增，不需要昂贵的pcr扩增仪，便于基层推广使用。

附图说明

图1：荷叶黑斑病菌lamp特异引物基因序列中的位点；

图2：荷叶黑斑病菌的lamp特异性检测；a为正常(自然)光照下的检测结果，b为波长365nm紫外光照射下的检测结果；1-2为荷叶黑斑病菌，3-7分别为烟草赤星病菌、三七黑斑病菌、番茄早疫病菌、瓜链格孢菌、胡萝卜链格孢菌，8为阴性对照；

图3：荷叶黑斑病菌lamp检测灵敏性；a为正常(自然)光照下的检测结果，b为波长365nm紫外光照射下的检测结果；1-7模板dna浓度分别为100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag，8为阴性对照；

图4：发病叶片中荷叶黑斑病菌的检测；a为正常(自然)光照下的检测结果，b为波长365nm紫外光照射下的检测结果；1-2、5为荷叶黑斑病发病叶片，3-4、6为健康荷叶，7为阳性对照，8为阴性对照。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：荷叶黑斑病菌环介导等温扩增(lamp)引物特异性的鉴定

1.引物设计

本发明在rnapolymeraseiibetasubunit(rpb2)上设计了4个特异性引物(图1)共识别序列的6个不同区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，特异性极高；

2.供试菌株基因组dna的提取

采用ctab法提取供试菌株(表1)基因组dna，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5ml离心管中(菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜)，加入900μl2％ctab(十六烷基三甲基溴化铵)提取液(2％ctab；100mmol/ltris-hcl,ph8.0；20mmol/ledta，ph8.0；1.4mol/lnacl)和90μlsds(十二烷基苯磺酸钠)【注：ctab，sds需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h(dna释放至缓冲液中)，12000r·min-1离心15min；取上清液700μl，加等体积酚、氯仿、异戊醇(25:24:1)，轻轻振荡混匀，12000r·min-1离心9min；取上清液500μl，加入等体积氯仿再抽提一次，12000r·min-1离心5min；取上清液350μl，加入1/10体积3mol·l-1naac和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min-1离心5min；弃去上清液，加入700μl冰70％乙醇进行洗涤(稍离心；倾掉上清液)，在超净工作台上晾干无酒精味，加入30～60μlte(10mmol/ltris-hcl，0.1mmol/ledta，ph8.0)溶液进行溶解，得到dna溶液，用紫外分光光度计检测dna浓度并稀释至100ng/μl待用。

3.荷叶黑斑病菌lamp检测方法的建立及引物特异性验证

以80种(表1)供试菌株的dna为模板，利用f3、b3、fip和bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱(betaine)，2.0mmdntps，0.2％trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：63.5℃温育45min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定。待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0μl，在正常光照下，显色结果观察到绿色荧光，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，即存在荷叶黑斑病菌，在正常光照下，显色结果观察到橙色或橘黄色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性，即不存在荷叶黑斑病菌。

4.引物特异性验证结果

lamp扩增结果表明，供试的菌株中只有荷叶黑斑病菌显色结果可观察到绿色荧光和白色浑浊沉淀状，其余供试菌株显色结果为橙色和透明状(图2)，说明所设计的荷叶黑斑病菌引物f3/b3和引物fip/bip可以将荷叶黑斑病菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于荷叶黑斑病菌快速可靠的检测和鉴定。

表1

实施例2：荷叶黑斑病菌环介导等温扩增(lamp)检测灵敏度测定

1.不同浓度基因组dna的制备

用无菌超纯水对荷叶黑斑病菌基因组dna进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用；

2.lamp检测方法灵敏度测定及结果观察

以不同浓度的荷叶黑斑病菌基因组dna为模板，利用引物f3/b3和引物fip/bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱(betaine)，2.0mmdntps，0.2％trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，不同浓度dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：63.5℃温育45min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0μl，在正常光照下，显色结果观察到绿色荧光，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，在正常光照下，显色结果观察到橙色或橘黄色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性。

3.lamp扩增灵敏度检测结果

lamp扩增灵敏度检测结果表明，100pg、10pg、1pg、100fg、10fg/μl浓度的荷叶黑斑病菌基因组dna显色结果可观察到绿色荧光和白色浑浊状沉淀，其余浓度及阴性对照显色结果为橙色和无色透明状，说明所设计的荷叶黑斑病菌引物f3、b3、fip和bip通过lamp扩增，对荷叶黑斑病菌的检测灵敏度可达10fg/μl(图3)。

实施例3：发病叶片中荷叶黑斑病菌的lamp检测

样品采集：从福建霞浦、政和、福安采集荷叶黑斑病发病症状典型的叶片及健康叶片带回实验室备用；

植物组织dna的提取：采用naoh快速裂解法提取dna，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10μl0.5mol/lnaoh，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5ml离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5μl加入495μl0.1mol/ltris-hcl(ph＝8.0)混合均匀，取1.0μl作为pcr模板进行扩增。

lamp扩增检测及观察：以上述提取的dna为模板，利用引物f3、b3、fip和bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱(betaine)，2.0mmdntps，0.2％trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：63.5℃温育45min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0μl，在正常光照下，显色结果观察到绿色荧光，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，即存在荷叶黑斑病菌，在正常光照下，显色结果观察到橙色或橘黄色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性，即不存在荷叶黑斑病菌。

检测结果：检测结果(图4)表明，荷叶黑斑病发病的叶片通过lamp扩增，显色结果可观察到绿色荧光和白色浑浊沉淀，说明存在荷叶黑斑病菌，而健康叶片及阴性对照显色结果为橙色和无色透明状，说明不存在荷叶黑斑病菌，该套技术能用于植物组织中荷叶黑斑病菌的快速分子检测。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>一种lamp引物在检测荷叶黑斑病菌中的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgaagctcaccaaggacgt19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tggaggcgtaagtgtatcgg20

<210>3

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atgctggccttgacagccatcacaagtacctccagcgatgt41

<210>4

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggcctgaaatactccctggcagagagacaccggctttcg39