一种人肝癌组织和肝脏组织活性单细胞悬液的制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人肝癌组织和肝脏组织活性单细胞悬液的制备方法。

背景技术：

近年来生物学的研究在单细胞领域取得飞跃的发展和进步。如cytof质谱流式、bdrhapsody、10×genomics等技术平台应运而生。目前最为热门的当属单细胞转录组测序的研究，它能够在一定程度上详细解析复杂样本中不同类型细胞之间的特定差异，获取到之前被全转录组测序所掩盖的一些关键数据。此外，单细胞蛋白组的相关研究也在探索中，虽然目前只能对选定的蛋白组合进行单细胞定量检测，但单细胞蛋白定量同样可以在单细胞水平得到不同细胞亚型之间的差异情况。然而不论是哪种研究，在进行单细胞相关研究之前，获得高质量的单细胞悬液是实验成功的第一步，也是实验能够顺利开展的关键一步。单细胞悬液制备不合格或失败，后续研究便无从谈起。

目前针对肝癌组织和正常肝组织单细胞悬液的制备中存在着较大的方法缺陷和技术难点，相关文献资料及各生物技术公司对此制备方法虽有描述和介绍，但均难以在实验中保持稳定及可重复性，且各方介绍的制备方法存在消化时间过长及细胞活性明显不足等关键技术缺陷。因此，本课题组经反复实验探索及充分验证后建立了一项高效制备人肝癌组织和人肝脏组织单细胞悬液的关键技术。该项技术属于生物实验制备技术，主要用于肝脏疾病及肝癌的单细胞相关研究，解决目前对肝脏组织及肝癌组织进行单细胞转录组测序时单细胞悬液制备成功率较低的关键问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种人肝癌组织和肝脏组织活性单细胞悬液的制备方法。经本发明的探索及充分验证后研究出一项高效制备肝脏单细胞悬液的制备方法。该方法主要用于解决对肝脏组织及肝癌组织进行单细胞转录组测序时单细胞悬液制备成功率较低的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种人肝癌组织和肝脏组织活性单细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：

s1组织样品保存以及转运：将穿刺组织标本离体后快速浸泡入装有预冷培养基的采样容器中，转运时间不超过20分钟；

s2组织漂洗及预消化：将获取的肝组织用无血清培养基漂洗，漂洗后将组织进行预消化；

s3组织消化：将剪碎的肝组织浸泡于培养基中，加入组织消化酶，放入摇床进行震荡消化；

s4终止消化及过滤除杂：在步骤s2的消化液中加入血清和无血清培养基，摇匀，然后过滤消化液，离心除杂，收集沉淀；

s5裂解红细胞及第二次过滤：在步骤s3中的沉淀中加入红细胞裂解液摇匀静置，将其经过滤器进行过滤，离心；

s6洗涤纯化细胞：清除坏死细胞；

s7重悬获取细胞：在细胞沉淀中加入预冷pbs重悬细胞。

优选地，在将组织标本浸泡于采样容器之前，还包括以下步骤：准备装有冰块的冰盒，向采样容器中加入预冷的无血清培养基。本发明实施例中采用的冰盒为长宽高分别约40cm×30cm×40cm塑料冰盒；在15ml塑料采样杯(或15ml离心管)中加入5-8ml预先存放4℃冰箱预冷的无血清培养基dmem或1640。

优选地，所述培养基为无血清培养基dmem或1640。

优选地，所述肝组织包括肝癌组织和正常肝组织。

优选地，所述肝组织包括穿刺组织和手术标本组织。

优选地，所述穿刺组织为16g穿刺针留取3条或3条以上穿刺组织。

优选地，所述手术标本组织为切取鲜活组织200-500mg。

优选地，所述步骤s1中预消化的具体步骤为：漂洗完后将组织浸泡在加入消化酶的培养基孔板中预消化5分钟，间断60秒轻轻摇晃15秒。

优选地，所述步骤s2中消化的具体步骤为：培养基完全浸泡的组织剪碎的肝组织，再加入消化酶，摇匀1分钟，置于37℃摇床，倾斜45度角放置，摇速180rpm，摇床震荡15分钟。

优选地，所述步骤s4中过滤前用红细胞裂解液预先湿润过滤器，离心条件为：4℃，450g(约1600rpm)，5分钟，加速度5降速度4。

本发明的有益效果：由本发明肝脏组织活性单细胞悬液的制备方法获得单细胞，其细胞活性较高，细胞总体活性大于70％，且操作较为简单，稳定性好，适用于单细胞领域的相关科学实验研究，解决了各实验室及各生物公司在开展肝脏疾病或肝脏肿瘤的科研工作中制备肝脏单细胞悬液的所遇难题。

附图说明

图1实验器材示意图(其中表示孔板+培养基+消化酶)。

图2实验器材剪刀、镊子、6cm培养皿示意图。

图3实验器40μm过滤器示意图。

图4大块组织剪碎示意图。

图5第一孔漂洗示意图。

图6第二孔漂洗示意图。

图7第三孔预消化示意图。

图8组织处理示意图。

图9震荡消化前管底可见组织示意图。

图10震荡消化摇床参数设置。

图11震荡消化后可见管底组织消失示意图。

图12第一次过滤示意图。

图13离心参数设置。

图14裂解红细胞前可见管底红棕色沉淀细胞示意图。

图15裂解红细胞后可见管底淡黄色沉淀细胞示意图。

图16荧光检测结果示意图。

图17台盼蓝检测结果示意图。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

步骤1.组织样本保存及转运：

准备一个长宽高分别约40cm×30cm×40cm塑料冰盒，内装适量小冰块。2.取15ml塑料采样杯(或15ml离心管)若干，向其中加入5-8ml预先存放4℃冰箱预冷的无血清培养基dmem或1640。3.待穿刺组织标本离体后快速浸泡入装有培养基的采样杯(或离心管)中，后将采样杯(或离心管)插入塑料冰盒内保存及转运。4.转运时间越短越好，尽量控制转运时间于20分钟内。

步骤2.器械材料准备：

准备一块干净6孔板，取其中3个孔，2个孔分别加入5ml预冷(4℃)的无血清培养基(dmem或1640)，1个孔加入5ml无血清培养+三种消化酶(a,h,r)。消毒的剪刀和镊子各一把，6cm培养皿若干个(根据需求)，40μm过滤器若干个(样品数×2)。15ml和50ml离心管若干个。本实施例采用的消化酶购自美天旎公司上生产的人组织消化酶试剂盒(tumordissociationkithuman)，其成分包含消化酶h、消化酶r、消化酶a三种。消化酶均按其各自说明书配制。

步骤3.组织漂洗和预消化：

准备消毒的剪刀和镊子各一把，6cm培养皿一个，取500mg组织在培养皿中剪切成4-6毫米碎块，镊子夹起组织依次浸泡入2个孔无血清培养基中漂洗，每孔浸泡3分钟，间断30秒轻轻摇晃10秒；漂洗完后将组织浸泡在加入消化酶的培养基孔板中预消化5分钟，间断60秒轻轻摇晃15秒。组织预消化使用的消化酶用法：5ml无血清dmem中加入消化酶a：12.5μl；消化酶r：50μl；消化酶h：100μl

步骤4.组织处理：

在6cm培养皿中，快速剪切碎组织至浆糊状(尽可能使组织剪碎)，过程控制在3分钟内。

步骤5.组织消化：

取1支干净15ml离心管，加入2ml无血清培养基(dmem或1640)，用镊子将剪碎组织转移至离心管中，使培养基完全浸泡组织，加入消化酶，手动摇匀1分钟，置于37℃摇床，倾斜45度角放置，摇速180rpm，摇床15分钟震荡消化后可见管底组织消失。组织震荡消化使用的消化酶用法：2ml无血清dmem中加入消化酶a：12.5μl；消化酶r：50μl；消化酶h：100μl，消化酶d20μl

步骤6.终止消化及过滤除杂：

加入1ml血清至震荡消化完毕的离心管中，手动摇匀，继续加5ml无血清培养基(dmem或1640)，摇匀，手动轻柔平移摇匀30秒。

除杂过滤(第一次过滤)

取一支干净50ml离心管(管壁预先标记a)，一次性45μm过滤器一个，过滤前预先用2-3ml无血清培养基或pbs湿润过滤器，将15ml离心管中的消化液过滤至50ml离心管中，离心，4℃，450g(约1600rpm)，5分钟，加速度6降速度5。

步骤7.裂解红细胞及第二次过滤：

上述步骤6离心后肉眼可见管底细胞沉淀(呈红棕色)，吸走上清，加入5ml红细胞裂解液，redbloodcelllysissolution(10×)(#130-094-183)美天旎公司。摇匀手动轻轻摇匀30秒，静置2分钟。

第二次过滤，另取一支干净50ml离心管(管壁预先标记b)，45μm过滤器一个，静置2分钟后将50mla离心管中的液体过滤至b离心管中，过滤前用1-2ml红细胞裂解液预先湿润过滤器，离心，4℃，450g(约1600rpm)，5分钟，加速度5降速度4。裂解红细胞前可见管底红棕色沉淀细胞，裂解红细胞后可见管底淡黄色沉淀细胞。

步骤8.洗涤纯化细胞

离心后肉眼可见管底细胞沉淀(注：手术标本管底一定可见沉淀细胞，穿刺组织管底细胞可能肉眼观察不明显)，如管底细胞颜色偏红则说明红细胞裂解不充分。此时手动轻轻摇匀或用宽口枪头吹匀管底沉淀细胞，继续重复步骤6一次。如管底细胞颜色呈淡黄色，则说明裂红充分，此时可用除死细胞kitdeadcellremovalkit(#130-090-101)美天旎公司。清除坏死细胞，也可待上机检测后根据需要决定是否除死细胞。

步骤9.重悬获取细胞

离心后肉眼可见管底细胞沉淀(呈淡黄色)，将上清轻柔吸走，转移至干净的15ml或50ml离心管中保存备用(防止离心失败后管底细胞丢失)。在细胞沉淀中加入预冷(4℃)pbs重悬细胞。穿刺组织加入80-150μl；手术切除标本组织加入200-400μl，注意加入pbs时动作轻柔，重悬细胞后立即置于冰上保存。

步骤10.细胞计数及检测

使用台盼蓝或者荧光计数的方式对细胞数和细胞活性进行定量检测。如计数显示细胞活性欠佳或碎片稍多，用pbs清洗1-2次。或可加用除死细胞kit。检测结果如图16、17所示。

表1：荧光计数分析结果

对比例1美天旎公司组织解离消化方法(参考消化酶说明书)

步骤1.准备一支干净的c管，加入2.2ml无血清培养基(dmem或1640)，向c管中加入适量3种消化酶(消化酶a，h,r)。组织量为0.05-0.2g对应的消化酶量为酶a：12.5μl；酶r：50μl；酶h：100μl。组织量为0.2-1.0g对应的消化酶量为：酶a:25μl，酶r：100μl，酶h：200μl。

步骤2.将组织切成2-4毫米大小后转移至c管中混匀。

步骤3.将c管插入组织匀浆机，选择h-tumor-01程序，自动搅拌36秒，将c管取下后放入37℃摇床，震荡消化30分钟。

步骤4.30分钟后将c管再次插入匀浆机，选择h-tumor-01程序，自动搅拌36秒后再次将c管转移至37℃摇床，震荡消化30分钟。

步骤5.30分钟后再次将c管插入组织匀浆机，选择h-tumor-01程序，自动搅拌36秒，取下c管观察组织消化情况，肉眼见组织结构完全消失后则认为消化完全；如组织形态结构可见，则考虑组织消化不充分，此时将c管中的消化液转移至另外一只新的c管中，并加添加2-4ml无血清培养基(dmem或1640)，插入组织匀浆机，选择m-imptumor-01程序搅拌一次。

步骤6.消化完毕后将c管的消化液过滤至50ml离心管，30μm或者75μm过滤器，然后向过滤器中加20ml无血清培养基(dmem或1640)清洗。

步骤7.离心过滤后的消化液，300g，7分钟，离心后吸走上清，向离心管中加入适量红细胞裂解液，混匀，静置2分钟，300g，离心5分钟。

步骤8.离心完毕后吸走上清，用适量无血清培养基或pbs重悬细胞。

由对比例1方法解离得到的细胞活性太低，总体细胞活性＜50％，远远达不到单细胞研究上机建库要求。与本发明的制备方法相比存在以下缺点：1.组织消化时间过长，全程消化时间超过1小时，肝细胞及肝癌细胞相对较脆弱，长时间消化容易导致消化过度，可严重影响细胞活性。2.组织处理不合理，该方案选择用组织匀浆机切碎组织，组织分解不均匀充分，搅拌过程速度过快，直接损伤细胞，此外c管体积过大，而c管中消化液较少，搅碎组织后容易致组织残留管壁及管口，导致组织损失及消化不充分。3.震荡消化无详述震荡频率，震荡频率过大或太小均可影响细胞消化，震荡消化完毕后无及时终止消化步骤，可致细胞长时间消化过度。4.组织处理无漂洗及预消化过程，后续离心转速不够，不能够有效去除细胞碎片及杂质，从而严重影响细胞计数和活性。

对比例2诺禾生物公司单细胞悬液制备方法(参考诺禾公司单测分析部方案)

步骤1.用无菌剪刀或手术刀将组织切成2-4毫米的碎块。

步骤2.在冰上将碎组织加入适当的缓冲液或平衡盐溶液中，清洗2-3次。这里一般会采用预冷的生理盐水/pbs/培养基等等，此外为了减少细胞损伤，还可以根据情况添加fbs或者bsa。

步骤3.加入适量的酶，并在最佳温度(通常为37℃)下孵育适当的时间，并间歇的混匀。消化时间与组织的类别很有关系，对于某些肿瘤组织或其他较致密结缔组织，消化时间4-48h，对于容易消化的组织可以采用37℃震荡消化15-45min，也可以根据具体情况而定。如组织块已分散而失去块的形状，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可以认为已消化充分。

步骤4.通过移液枪或研磨的方式轻轻分散细胞。这是单细胞制备至关重要的一步。过度的话，就会破坏细胞；不足的话，则会降低细胞收率。

步骤5.通过合适的滤网过滤细胞悬液。

步骤6.让细胞沉降并倒出多余的含酶液体。

步骤7.洗涤并重复2-3次。在适当的培养基或缓冲液中重悬细胞。细胞碎片可以在此步通过离心初步去除，300g或1000～1500rpm的条件下5min。

由对比例2方法解离得到的解离得到的细胞活性较低，总体细胞活性＜60％，并且此方案得到的单细胞中红细胞比例及杂质偏多，而免疫细胞及肿瘤细胞较少，测序研究可行性及结果准确性严重受限。与本发明的制备方法相比存在以下缺点：1.该方法操作过程需要自己摸索不同条件，如消化时间、过滤器大小及过滤次数等，费时费力。2.推荐的消化时间相对较长，超过20分钟容易导致消化过度，不适合肝肿瘤和正常肝组织的消化解离。3.此方法中没有裂解红细胞的相关步骤，导致所得细胞悬液中红细胞比例过高，严重影响计数分析。4.消化完毕后没有及时终止消化的步骤，另外此方案建议在消化完毕后通过移液枪或研磨方式分散细胞，此操作方法会对细胞造成巨大破坏，影响细胞活性。5.组织处理欠佳，2-4毫米组织碎块正常消化完毕需30分钟以上，并且方案中无组织预消化步骤，更容易延长组织消化时间，长时间消化则会导致消化不均匀和过度消化。

表2：不同方法获得单细胞参数的比较结果

通过上述分析可知，目前针对肝癌组织和正常肝组织单细胞悬液的制备中存在着较大的方法缺陷和技术难点。虽然现有制备方法能够制备单细胞悬液，但获得的单细胞的质量却较低，含有多种杂质，不足以满足实际需求，并且现有制备方法中存在明显消化时间过长及细胞活性不足等关键缺陷。而由本发明的制备方法获得的肝癌组织和正常肝组织单细胞悬液杂质含量低，红细胞比例低，细胞活性高，总体细胞活性超过70％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。