一种星毛冠盖藤总香豆素的制备方法及其应用与流程

本发明属于医药技术领域，涉及天然中药的分离，具体涉及一种星毛冠盖藤总香豆素的制备方法及其应用。

背景技术：

星毛冠盖藤(pileostegiatomentellahand.mazz)为绣球花科冠盖藤属植物，《中华本草》、《广西药用植物名录》和《广西植物志》均将其收载，是广西金秀瑶族自治县瑶医医院肿瘤科用于治疗各种肿瘤的主药。

目前，关于从星毛冠盖藤提取其化学组分的文献公开极少，其中，陆国寿等人发表的《瑶药消瘤藤的化学成分研究》一文中，公开了一种从消瘤藤(即星毛冠盖藤)中提取其化学组分的方法，具体为:将消瘤藤药材15.0kg粉碎成粗粉，加8倍量95％乙醇回流提取5次，每次2h，提取液滤过，合并，回收溶剂并浓缩至无醇味，得浸膏2.91kg。浸膏加水使其混悬，分别依次使用石油醚(60-90℃)，乙酸乙酯萃取，合并各部位萃取液，浓缩，得到石油醚部位浸膏115g，乙酸乙酯部位浸膏106g。取石油醚萃取部分115g，经柱色谱硅胶分离，以石油醚-乙酸乙酯(100:0-80:20)混合溶剂梯度洗脱，得到4个组分(fr.1-fr.4)。fr.1，fr.2、fr.3组分均有析出物，分别抽滤，重结晶得到二十四烷酸25mg、蒲公英赛醇33mg、β-谷甾醇26mg。而fr.4组分2.4g经硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯(80:20)为洗脱液，得75个组分(fr.4.-fr.4.75)，组分fr.4.7，fr.4.11均有析出物，分别抽滤，重结晶得到3β-乙酰氧基-乌苏酸14mg和豆甾烷-3，6-二酮22mg。取乙酸乙酯萃取部分106g经硅胶柱色谱分离，以乙酸乙酯-甲醇(100:0-90:10-80:20-50:50)混合溶剂梯度洗脱，通过薄层色谱检查得到3个组分(fr.a-fr.c)。fr.a组分42.5g经硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯(65:35)为洗脱液，得75个组分(fr.a.1-fr.a.75)。通过薄层色谱检查合并fr.a.34-fr.a.35，通过重结晶得7-羟基-8-甲氧基香豆素200mg。fr.b组分有析出物，抽滤，重结晶，得到茵芋苷73mg。fr.c组分29.0g经硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯(60:40)为洗脱液，得42个组分(fr.c.1-fr.c.42)。通过薄层色谱检查分别合并fr.c.18-fr.c.22，fr.c.39-fr.c.40，fr.c.18-fr.c.22通过重结晶得7-羟基香豆素16mg，fr.c.39-fr.c.40通过重结晶得化合物3，4-二羟基苯甲酸44mg。

然而，上述提取方法并非专门针对总香豆素的提取，而是在于提取分离星毛冠盖藤中的多种化学成分；此外，上述提取方法采用15.0kg原料，只提取到含有香豆素的乙酸乙酯部位浸膏106g，最终分离得到的香豆素的含量也比较低。

技术实现要素：

本发明要解决的其中一个技术问题是：针对上述现有技术存在的不足，提供一种有针对性地提取制备星毛冠盖藤中总香豆素的方法，提高总香豆素的提取效率和含量。

本发明以如下技术方案解决上述技术问题：

一种星毛冠盖藤总香豆素的提取制备方法，包括以下具体步骤:

(1)称取星毛冠盖藤，粉碎，加入6-12倍量以碳基醇或碳基醇水组成的溶剂，回流提取1-4次，每次1-3小时，滤过，提取液浓缩成稠膏；

(2)步骤(1)所得稠膏加入2-4倍量硅藻土搅拌均匀，水浴上蒸干，粉碎，得混合样品a；

(3)混合样品a加入6-10倍量弱极性有机溶剂回流提取1-4次，每次1-3小时，滤过，将滤液弃去，得混合样品b；

(4)混合样品b再加入中等极性有机溶剂回流提取1-4次，每次1-3小时，滤过，回收溶剂，浓缩得萃取稠膏；

(5)所得萃取稠膏加入2-4倍量柱层析硅胶搅拌均匀，水浴上蒸干，粉碎，得混合样品c；

(6)将混合样品c过硅胶色谱柱，柱层析硅胶为混合样品c的30-100倍量，以乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集流分，采用薄层色谱检视，合并可检测到香豆素类成分的流分，回收溶剂，浓缩，即得所述总香豆素；

本发明所述的倍量均以质量计。

以下技术方案作为上述技术方案的优选方案:

步骤(1)所述碳基醇或碳基醇水组成的溶剂为90-95％的乙醇或甲醇。

步骤(3)所述弱极性有机溶剂为正己烷或环己烷。

步骤(4)所述中等极性有机溶剂为丙酮。

步骤(6)所述乙酸乙酯-甲醇梯度为100:0→90:10→80:20→50:50；所述收集流分按照一份流分为硅胶色谱柱柱体积的1/4-1/2量进行收集；所述薄层色谱检视以7-羟基香豆素为对照，然后合并可检测到7-香豆素类成分的流分。

本发明要解决的另一个技术问题是：提供按照上述方法制备得到的总香豆素提取物及其医药用途。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是：按照上述方法制备得到的总香豆素提取物，及该提取物用于制备抗肿瘤医药的用途。

所述的抗肿瘤医药包括用于抑制人肝癌hepg2细胞、人结肠癌ht-29细胞、人神经胶质瘤u87细胞或人乳腺癌mda-mb-231细胞的药物。

本发明提取方法操作简单，针对性强，总香豆素提取效率和提取含量都比较高，提取得到的总香豆素中香豆素含量可达60％以上，且具备以下医药功能：

(1)可显著提高对人肝癌hepg2细胞、人结肠癌ht-29细胞、人神经胶质瘤u87细胞及人乳腺癌mda-mb-231细胞增殖的抑制率。

(2)可显著抑制ht-29细胞的克隆、迁移及侵袭能力。

(3)可显著抑制bcl-2和nf-κb的表达，caspase3表达增加。

附图说明

图1是实施例中总香豆素对ht-29细胞克隆形成影响试验的培养皿观察图，其中a:阴性对照组；b:香豆素50μg/ml；c:香豆素100μg/ml。

图2是实施例中总香豆素对ht-29细胞迁移能力影响试验的显微镜图，其中a:阴性对照组；b:香豆素50μg/ml作用前；c:香豆素100μg/ml作用前；d:阴性对照组24h；e:香豆素50μg/ml作用24h后；f:香豆素100μg/ml作用24h后。

图3是实施例中总香豆素对ht-29细胞侵袭能力影响试验的培养皿观察图，其中a:阴性对照组；b:香豆素50μg/ml；c:香豆素100μg/ml。

图4是实施例中总香豆素对caspase3、bcl-2、nf-κb蛋白表达影响试验的蛋白条带图。

具体实施方式

下面将使用本领域技术人员向本领域其它的技术人员传达他们工作的实质所通常使用的术语来描述本方案的发明理念。然而，这些发明理念可体现为许多不同的形式，因而不应视为限于本方案中所述的实施例。

本发明实施例所使用的星毛冠盖藤采自广西金秀县，由广西中医药研究院卢文杰主任药师鉴定为绣球花科星毛冠盖藤pileostegiatomentellahand.mazz的全草。hepg2细胞、ht-29细胞、u87细胞及mda-mb-231细胞购自美国atcc细胞库。

一、总香豆素提取物的提取实施例

1.提取实例一

取星毛冠盖藤1.0kg，粉碎成粗粉，加8倍量95％乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，提取液浓缩成稠膏，稠膏加4倍量硅藻土搅拌均匀，水浴上蒸干，粉碎，得混合样品a。混合样品a加8倍量正己烷回流提取2次，每次2小时，滤过，将正己烷提取液弃去，得混合样品b再加丙酮回流提取2次，每次2小时，滤过，丙酮回收溶剂，浓缩得丙酮萃取稠膏。丙酮萃取稠膏加4倍量柱层析硅胶搅拌均匀，水浴上蒸干，粉碎，得混合样品c，过硅胶色谱柱，柱层析硅胶为混合样品c的80倍量，以乙酸乙酯-甲醇(100:0→90:10→80:20→50:50)梯度洗脱，收集流分(按一份流分为柱体积的1/4-1/2量进行收集)，采用薄层色谱(以7-羟基香豆素为对照)进行检视，合并可检测到7-香豆素类成分的流分，回收溶剂，浓缩，即得总香豆素提取物23.42g。

2.提取实例二

取星毛冠盖藤5.0kg，粉碎成粗粉，加8倍量90％甲醇回流提取3次，每次1.5小时，滤过，提取液浓缩成稠膏，稠膏加4倍量硅藻土搅拌均匀，水浴上蒸干，粉碎，得混合样品a。混合样品a加10倍量环己烷回流提取3次，每次1.5小时，滤过，将环己烷提取液弃去，得混合样品b再加丙酮回流提取3次，每次1.5小时，滤过，丙酮液回收溶剂，浓缩得丙酮萃取稠膏。丙酮萃取稠膏加3倍量柱层析硅胶搅拌均匀，水浴上蒸干，粉碎，得混合样品c。混合样品c过硅胶色谱柱，柱层析硅胶为混合样品c的50倍量，以乙酸乙酯-甲醇(100:0→90:10→80:20→50:50)梯度洗脱，收集流分(按一份流分为柱体积的1/4-1/2量进行收集)，采用薄层色谱(以7-羟基香豆素为对照)进行检视，合并可检测到7-香豆素类成分的流分，回收溶剂，浓缩，即得，得总香豆素提取物112.7g。

3.提取对比例

取星毛冠盖藤10.0kg，粉碎成粗粉，加6倍量80％乙醇溶剂回流提取3次，每次2.5小时，滤过，提取液浓缩成稠膏，稠膏加3倍量硅藻土搅拌均匀，水浴上蒸干，粉碎，得混合样品a。混合样品a加6倍量石油醚(60-90℃)回流提取4次，每次1.0小时，滤过，将石油醚提取液弃去，得混合样品b再加乙酸乙酯回流提取4次，每次1小时，滤过，乙酸乙酯液回收溶剂，浓缩得乙酸乙酯萃取稠膏。乙酸乙酯萃取稠膏加2倍量柱层析硅胶搅拌均匀，水浴上蒸干，粉碎，得混合样品c。混合样品c过硅胶色谱柱，柱层析硅胶为混合样品c的30倍量，以乙酸乙酯-甲醇(100:0→90:10→80:20→50:50)梯度洗脱，收集流分(按一份流分为柱体积的1/4-1/2量进行收集)，采用薄层色谱(以7-羟基香豆素为对照)进行检视，合并可检测到7-香豆素类成分的流分，回收溶剂，浓缩，即得，得总香豆素提取物116.8g。

二、总香豆素提取物含量测定

(1)标准溶液制备

精密称定在105℃干燥至恒重的7-羟基香豆素对照品5.0mg，甲醇定容至25ml，浓度0.2mg/ml。以未加对照品的甲醇为空白溶液。

(2)最佳吸收波长选择

在200-400nm扫描对照品溶液，在320nm处有一较大吸收峰，因此，将320nm作为最佳吸收波长。

(3)标准曲线绘制

精密吸取标准溶液各0.2、0.4、0.8、1.6、3.2ml，分别用甲醇定容至10ml，以甲醇为空白，于340nm处测定吸光度(a)。以浓度c为横坐标，吸光度a为纵坐标，进行线性回归分析，结果表明，标准溶液在0.004-0.064mg/ml范围内线性良好。

(4)样品测定

取总香豆素样品5mg，甲醇定容至25ml容量瓶，于340nm处测定吸光度，根据标准曲线计算样品中总香豆素浓度。

最终计算得出提取实例一、提取实例二、提取对比例所得的总香豆素提取物中香豆素含量分别为62.08％、60.93％和61.43％。

以下试验三-七的研究试验采用提取实例一所得的总香豆素提取物作为试验药物。

三、总香豆素提取物对肿瘤细胞增殖作用影响研究

1.试验方法

将待测细胞(hepg2、mda-mb-231、ht-29、u87)传至96孔板培养板中，每孔接种细胞约10000个。置于细胞培养箱中培养24h后，吸取上清培养液，加入不同药物浓度的培养液(200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml)，每孔100μl，同一浓度设置6个复孔，继续置于细胞培养箱中培养24h，检测时将cck-8试剂与无血清的培养液按1:10比例配制工作液，每孔加入100μl工作液，放入二氧化碳培养箱中37℃恒温孵育1h，放入全波长酶标仪中，在450nm波长下检测吸光度，spss16.0计算药物半数抑制浓度(ic50)。

2.试验结果

不同质量浓度的香豆素类成分作用于肿瘤细胞24h后，香豆素类成分对4种肿瘤细胞增殖均呈现剂量依赖性抑制作用，随着浓度的增加，对其生长的抑制作用逐渐增强。抑制率计算结果见表1，半数抑制浓度ic50结果见表2。结果显示香豆素类成分对人结肠癌ht-29细胞的增殖作用显著。

表1香豆素类成分对肿瘤细胞抑制率的影响(n＝6)

注:与空白对照组比较^**p<0.05，^**p<0.01(下同)

表2香豆素类成分对肿瘤细胞的ic50(μg/ml)

四、总香豆素提取物对ht-29细胞克隆形成能力的影响研究

1.试验方法

将处于对数生长期的细胞接种于60mm的细胞培养皿中(300个细胞/皿)，培养24h后，弃去培养液，加入不同浓度的含药培养液，药物与细胞作用24h后，弃去含药培养液，加入新的培养液洗3次后培养7d，观察克隆形成及克隆大小。pbs洗涤2～3次，加入3ml固定液(甲醇-冰醋酸(3:1))，固定15min，弃去固定液，干燥后加入0.1％结晶紫染色，染色1h，在克隆着色足够时用水洗去残余染液，晾干后在显微镜下计数大于10个细胞的克隆数，计算克隆形成相当率，公式为克隆形成相当率＝(药物处理组克隆数/细胞接种数)×100％。

2.试验结果

ht-29细胞经香豆素类成分(50，100μg/ml)处理24h后，再除去药物常规培养7d，发现不同质量浓度药物对ht-29细胞集落形成率有明显抑制作用(p<0.01)，50，100μg/ml药物处理组的克隆形成行当率分别为64.00％和15.00％。结果见图1和表3。

表3总香豆素对ht-29细胞克隆形成的影响(n＝3)

五、总香豆素提取物对对ht-29细胞迁移能力的影响研究

1.试验方法

将处于对数生长期的细胞接种于6孔板中，培养过夜，使细胞融合率达到95％。用灭过菌的20ml枪头尖端部位在细胞表面划出一条直线“伤口”，pbs多次洗涤除去漂浮细胞，加入完全培养液，显微镜下拍照并记录位置，弃去培养液，实验组加入不同浓度含药培养液，对照组加入等体积培养液，继续培养一段时间后于相同位置拍照。用imagej软件打开图片后，随机划取6-8条水平线，量取划痕中间的距离，计算细胞间距离的均值，细胞迁移率(％)＝(细胞迁移前的距离-细胞迁移后的距离)/细胞迁移前的距离。

2.试验结果

ht-29细胞经香豆素类成分(50，100μg/ml)处理24h后，进行细胞划痕实验。划痕实验24h后，与空白对照组(79.17±2.35)％比较，给药组细胞迁移率明显减少，均具有统计学差异(p<0.01)，分别为(64.28±1.25)％和(40.00±2.46)％，表明香豆素类成分能显著抑制ht-29细胞的迁移能力。结果见图2和表4。

表4香豆素成分对ht-29细胞迁移能力的影响(n＝3)

六、总香豆素提取物对ht-29细胞侵袭能力的影响研究

1.试验方法

用无血清的培养基1:10稀释matrigel，包被transwell小室底部膜的上室面，置于37℃培养箱1h使matrigel聚合凝胶。消化ht-29细胞，终止消化后离心弃去培养液，用pbs希2遍，用无血清培养基重悬，200μl细胞悬液加入transwell小室，24孔板下室加入600μl含20％血清的培养基，常规培养24h。取出transwell小室，弃去孔中培养液，用pbs洗2遍，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，甲醇-冰醋酸(3:1)固定30min，将小室适当风干。用0.1％结晶紫染色60min，用pbs洗3遍。棉签擦掉上室水分，显微镜下观察并计数。

2.试验结果

ht-29细胞经香豆素类成分(50，100μg/ml)处理24h后，进行细胞侵袭实验，24h后，与阴性对照组比较，香豆素类成分能显著抑制ht-29细胞的侵袭能力，结果见图3和表5。

表5香豆素成分对ht-29细胞侵袭能力的影响(n＝3)

七、总香豆素提取物对bcl-2、nf-κb、caspase-3蛋白表达的影响研究

1.试验方法

使用bca蛋白质定量试剂盒对蛋白样品进行浓度测定，经计算各组取等量蛋白样品，与荧光液混合，95℃加热5分钟。将配置好的蛋白样品、封闭液、洗涤缓冲液、一抗稀释液、二抗稀释液、化学液按说明书要求依次加入微型反应板(试剂盒中提供)中，3000rpm离心15min，置于全自动蛋白质定量分析系统(美国proteinsimple，wes)中，安装好一次性毛细管，开机启动，蛋白样品将在毛细管内自动进行电泳分离和免疫检测。

2.试验结果

药物作用ht-29细胞24h后，提取蛋白进行westernblot实验，发现与阴性对照组比较，给药组bcl-2、nf-κb蛋白的表达水平明显下调，caspase-3蛋白水平上调，结果见图4和表6。

表6总香豆素对caspase3、bcl-2、nf-κb蛋白表达的影响(n＝3)