一种深色有隔内生真菌菌液高效规模化产运联动生产方法与流程

本发明属于微生物领域，具体涉及一种深色有隔内生真菌菌液高效规模化产运联动生产方法。

背景技术：

深色有隔内生真菌(darkseptateendophyte，dse)泛指一群定居于植物根内，并能形成典型的有隔菌丝和微菌核等结构的小型土壤内生真菌。这类真菌广泛存在于健康植物根表皮、皮层或维管组织，生境广泛，极地、荒漠、重金属污染、农田等均有深色有隔内生真菌分布。

大量研究表明深色有隔内生真菌可促进多种植物生长、改善光合作用、促进营养吸收、提高植物抗逆性及提高植物次生代谢物浓度。随着深色有隔内生真菌的生态作用逐渐被揭示，深色有隔内生真菌菌剂的研发也逐渐成为研究的热点与难点。

目前，深色有隔内生真菌菌剂以液体为主，其应用多为室内应用，即用即培养，且对其培养时间无准确严格的定量研究。而在野外的推广使用中，不仅对菌液的需求量较大，而且菌液运输也是其研究的重点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种深色有隔内生真菌菌液高效规模化产运联动生产方法。

本发明提供了深色有隔内生真菌(darksideasp)针a2-7。针a2-7已于2019年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18811。

本发明还保护针a2-7的培养方法，包括如下步骤：采用液体培养基培养针a2-7。

所述培养方法中，培养时间为6天。

示例性的，所述液体培养基为液体mmn培养基。

所述培养的条件为：黑暗、27℃。

所述培养的条件为170r/min振荡培养。

所述培养的过程中，第8天生物量达到最大。第6天生长率最快，生命力最强。

本发明还保护一种针a2-7的应用方法，包括如下步骤：先采用以上任一所述方法进行培养，然后2天内将菌液运输至目的地，以实现培养第8天将菌液用于植物种子浸种(以保证接菌效率)。

由于针a2-7具有重大的应用推广价值，因此实际应用中涉及将针a2-7进行不同地域的运输。考虑最佳生长率及最大生物量时间差，在培养至第6天开始运输最佳。本发明为今后野外菌剂的运输提供了依据。

运输中建议按照如下规程进行操作：

(1)在培养针a2-7至第6天，菌的生命力最强时开始运输最佳；

(2)运输过程中，由于在途中的晃动过程仍是对菌液的一个培养过程，因此对于容器的选择最好为扁形、大口径容器，以便增加菌液与容器空气的接触面积；

(3)结合室内菌液培养情况，容器需要留出一定的空间(总容器的1/3-1/2，以容器大小而定)，得以保证有一定的氧气供应，使菌能够继续生长达到最大菌丝量；

(4)菌液运输时间建议为10-12h，菌液运输至目的地后，应在第8天前(从初始接种开始计的第8天前)接种于植物根际，保证其既具有活性较强又具有较高生物量。

本发明还保护一种获得针a2-7的生长最快的时期的方法，包括如下步骤：制作针a2-7的菌株生长曲线和菌株增长速率曲线，根据菌株生长曲线和菌株增长速率曲线获得生长最快的时期。

制作针a2-7的菌株生长曲线和菌株增长速率曲线的方法具体包括如下步骤：

将2个5mm×5mm菌饼置于150mlmmn液体培养基中，27℃，170r/min振荡培养，共培养24瓶；从培养0时刻开始计时，每隔2天随机取3瓶菌液，先把滤纸烘干，称重，再用滤纸滤出菌丝，烘干称重，最后计算菌丝干重；

以培养天数为横坐标，菌丝干重为纵坐标，绘制菌株生长曲线，找出菌株生长量达到最大的生长时期；

以培养天数为横坐标，菌丝干重每天增加量为纵坐标，绘制菌株增长速率曲线。

本发明还保护所述方法在确定针a2-7的运输条件中的应用。

综合考虑针a2-7的生长曲线、增长速率曲线及运输时差(一般10-12h)，选择在培养菌株至第6天的生命力最强时，开始运输最佳。

本发明还保护针a2-7的菌液。所述针a2-7的菌液具体可为20％针a2-7菌液。

20％针a2-7菌液为菌浓度为0.4-0.5mg/ml的针a2-7菌液。

20％针a2-7菌液为菌浓度为0.478mg/ml的针a2-7菌液。

20％针a2-7菌液的制备方法具体为：取针a2-7的直径6mm菌饼，接种至100ml液体mmn培养基，25℃振荡培养(培养过程：先180r/min振荡培养1天，然后160r/min振荡培养7天)，得到菌液；采用无菌水调整菌浓度，得到20％针a2-7菌液。

20％针a2-7菌液的制备方法：取1体积份针a2-7菌液(菌浓度为2.39mg/ml)，用无菌水稀释至5体积份。

针a2-7菌液(菌浓度为2.39mg/ml)的制备方法具体为：取针a2-7的直径6mm菌饼，接种至100ml液体mmn培养基，25℃振荡培养(培养过程：先180r/min振荡培养1天，然后160r/min振荡培养7天)，得到菌液；采用无菌水调整菌浓度，得到菌浓度为2.39mg/ml的针a2-7菌液。

菌浓度的单位为mg/ml，即每毫升菌液中的菌丝干重(mg)。

本发明提供测定深色有隔内生真菌生长规律的方法，可以准确获得深色有隔内生真菌生命力最旺盛时期，由于菌株具有重大的应用推广价值，在实际野外不同地域应用中定会涉及此菌液的运输，结合菌液的运输时间，对于野外菌液的应用可以有效节约室内培养时间。因此本发明为野外深色有隔内生真菌的运输提供重要数据支撑，对进一步推进微生物复垦技术应用实践具有重要意义。

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：darksideasp.

生物材料的菌株编号：针a2-7

生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

生物材料的保藏单位简称：cgmcc

生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

生物材料的保藏日期：2019年11月19日

生物材料的保藏中心登记入册编号：cgmccno.18811

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：darksideazeta

生物材料的菌株编号：针a1-3

生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

生物材料的保藏单位简称：cgmcc

生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

生物材料的保藏日期：2019年4月8日

生物材料的保藏中心登记入册编号：cgmccno.17464

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：链格孢(alternariasp.)

生物材料的菌株编号：001

生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

生物材料的保藏单位简称：cgmcc

生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

生物材料的保藏日期：2019年04月08日

生物材料的保藏中心登记入册编号：cgmccno.17463

附图说明

图1为针a2-7的形态照片。

图2为针a2-7的生长曲线

图3为针a2-7的增长速率曲线。

图4为针a2-7菌液浸种12小时的侵染率结果。

图5为针a2-7菌液浸种16小时的侵染率结果。

图6为针a1-3菌液浸种12小时的侵染率结果。

图7为针a1-3菌液浸种16小时的侵染率结果。

图8为深色有隔内生真菌001菌液浸种12小时的侵染率结果。

图9为深色有隔内生真菌001菌液浸种16小时的侵染率结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。菌丝干重，即菌丝干物质的质量。测量菌丝干重的方法：105℃烘干至恒重，然后称重。

液体mmn培养基(ph5.5)：将cacl20.05g、mgso40.15g、nacl0.025g、fecl30.01g、kh2po40.5g、vitaminb1(硫胺素)0.0001g、(nh4)2hpo40.25g、葡萄糖10g、柠檬酸0.2g和maltextract(麦芽提取物)10g混合，得到混合物，然后加入蒸馏水并定容至1l，分装，121℃高压灭菌15min，备用。

实施例1、菌株的获得和保藏

三个菌株(针a2-7、针a1-3、001号菌)，均是发明人从内蒙古自治区锡林郭勒盟锡林浩特市北电胜利矿区的针茅根系中分离纯化得到的菌株。

检测针a2-7的its序列，如序列表中序列1所示，鉴定为深色有隔内生真菌(dse)(darksideasp.)。针a2-7已于2019年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18811。深色有隔内生真菌的形态特征：黑色或深褐色，菌丝在根系内呈深色，有明显的横隔。针a2-7在根系内的形态照片见图1。

检测针a1-3的its序列，如序列表中序列2所示，鉴定为深色有隔内生真菌(dse)(darksideazeta)。针a1-3已于2019年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.17464。

检测001号菌的its序列，如序列表中序列3所示，鉴定为链格孢(alternariasp.)，命名为链格孢001，又称为深色有隔内生真菌001。深色有隔内生真菌001已于2019年04月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.17463。

实施例2、针a2-7的生长规律

实施例中所述试验操作均在无菌操作台中进行，试验操作前，先用紫外灯照射工作台20min。实施例中所有试剂均经高压灭菌锅灭菌15min，再放置于经紫外灯杀菌后的超净工作台内。实施例中所有实验用具均经高压灭菌锅灭菌15min，烘干后再放置于经紫外灯杀菌后的超净工作台内。实施例中生长曲线的绘制以培养天数为横坐标，以菌丝干重为纵坐标。

固体pda培养基：取去皮马铃薯200g，切成小块，加入1l蒸馏水，煮沸30min；纱布过滤后收集滤液，向滤液中加入葡萄糖20.0g、kh2po43.0g、mgso4.7h2o1.5g、维生素b110μg和琼脂15.0g，调ph值至6.0并用蒸馏水定容至1.0l，然后115℃灭菌15min。

一、菌株的培养

将针a2-7进行菌株活化，即用接种针挑取菌株边缘菌丝，接种到新的固体pda培养基进行培养。待其长出新菌落后，根据菌落颜色和形态等特征再次挑取边缘菌丝，接种到新的固体pda培养基进行培养。反复进行上述步骤，直至培养基中的菌落均匀一致。

二、菌液的制备

完成步骤一后，用无菌打孔器打取5mm×5mm菌饼，将2个菌饼置于装有150ml液体mmn培养基的250ml锥形瓶中，黑暗条件下、27℃、170r/min振荡培养。共培养24瓶。

三、干物质的测定

步骤二的培养过程中，第1个48小时后作为第2天时刻，第2个48小时后作为第4天时刻，依次类推。

分别于第2天时刻、第4天时刻、第6天时刻、第8天时刻、第10天时刻、第12天时刻、第14天时刻和第16天时刻，各取3瓶，分别测量菌丝干重，计算每瓶的菌丝干重平均值。

以培养天数为横坐标，菌丝干重为纵坐标绘制菌株生长曲线。见图2。随着培养天数的增多，呈现先增后不变的趋势，在培养第8天以后生物量不再随培养时间的增加发生显著变化，而是达到趋于相对稳定的状态，说明针a2-7在培养第8天生物量达到最大。

n＝2、4、6、8、10、12、14或16。增长速率曲线见图3。从增长速率来看，针a2-7在6-8天内的增长速率达到相对较高水平，因此在接种试验中菌株应选择培养6-8天使用。此研究为深色有隔内生真菌的应用提供理论基础。

实施例3、针a2-7的生长规律应用于运输

综合考虑针a2-7的生长曲线、增长速率曲线及运输时差(一般10-12h)，选择在培养菌株至第6天的生命力最强时，开始运输最佳。

由于针a2-7具有重大的应用推广价值，因此实际应用中涉及将针a2-7进行不同地域的运输。运输中建议按照如下规程进行操作：

(1)在培养针a2-7至第6天，菌的生命力最强时开始运输最佳；

(2)运输过程中，由于在途中的晃动过程仍是对菌液的一个培养过程，因此对于容器的选择最好为扁形、大口径容器，以便增加菌液与容器空气的接触面积；

(3)结合室内菌液培养情况，容器需要留出一定的空间(总容器的1/3-1/2，以容器大小而定)，得以保证有一定的氧气供应，使菌能够继续生长达到最大菌丝量；

(4)菌液运输时间建议为10-12h，菌液运输至目的地后，应在第8天前(从初始接种开始计的第8天前)接种于植物根际，保证其既具有活性较强又具有较高生物量。

实施例4、菌液对玉米生长的影响

供试菌株分别为：针a2-7和针a1-3和深色有隔内生真菌001。

玉米品种为中糯一号(认证号：0103006-2000，北京中农作科技发展有限公司)。中糯一号又称为中糯1号。

一、针a2-7菌液的制备和稀释

1、取针a2-7的直径6mm菌饼，接种至100ml液体mmn培养基，25℃振荡培养，得到菌液。培养过程：先180r/min振荡培养1天，然后160r/min振荡培养7天。

2、检测菌浓度

完成步骤1后，取样1ml菌液，通过滤纸过滤收集菌丝，检测菌丝干重。计算菌液的菌浓度，菌浓度的单位为mg/ml，即每毫升菌液中的菌丝干重(mg)。

3、取步骤1得到的菌液，根据步骤2的检测结果，采用无菌水调整菌浓度，得到菌浓度为2.39mg/ml的针a2-7菌液。

4、菌液的稀释

用无菌水将步骤3得到的针a2-7菌液进行稀释，得到五个浓度的针a2-7菌液，具体如下：

20％针a2-7菌液：取步骤3得到的针a2-7菌液20ml，用无菌水稀释至100ml；

40％针a2-7菌液：取步骤3得到的针a2-7菌液40ml，用无菌水稀释至100ml；

60％针a2-7菌液：取步骤3得到的针a2-7菌液60ml，用无菌水稀释至100ml；

80％针a2-7菌液：取步骤3得到的针a2-7菌液80ml，用无菌水稀释至100ml；

100％针a2-7菌液：步骤3得到的针a2-7菌液。

二、针a1-3菌液的制备和稀释

1、取针a1-3的直径6mm菌饼，接种至100ml液体mmn培养基，25℃振荡培养，得到菌液。培养过程：先180r/min振荡培养1天，然后160r/min振荡培养7天。

2、检测菌浓度

完成步骤1后，取样1ml菌液，通过滤纸过滤收集菌丝，检测菌丝干重。计算菌液的菌浓度，菌浓度的单位为mg/ml，即每毫升菌液中的菌丝干重(mg)。

3、取步骤1得到的菌液，根据步骤2的检测结果，采用无菌水调整菌浓度，得到菌浓度为2.39mg/ml的针a1-3菌液。

4、菌液的稀释

用无菌水将步骤3得到的针a1-3菌液进行稀释，得到五个浓度的针a1-3菌液，具体如下：

20％针a1-3菌液：取步骤3得到的针a1-3菌液20ml，用无菌水稀释至100ml；

40％针a1-3菌液：取步骤3得到的针a1-3菌液40ml，用无菌水稀释至100ml；

60％针a1-3菌液：取步骤3得到的针a1-3菌液60ml，用无菌水稀释至100ml；

80％针a1-3菌液：取步骤3得到的针a1-3菌液80ml，用无菌水稀释至100ml；

100％针a1-3菌液：步骤3得到的针a1-3菌液。

三、深色有隔内生真菌001菌液的制备和稀释

1、取深色有隔内生真菌001的直径6mm菌饼，接种至100ml液体mmn培养基，25℃振荡培养，得到菌液。培养过程：先180r/min振荡培养1天，然后160r/min振荡培养7天。

2、检测菌浓度

完成步骤1后，取样1ml菌液，通过滤纸过滤收集菌丝，检测菌丝干重。计算菌液的菌浓度，菌浓度的单位为mg/ml，即每毫升菌液中的菌丝干重(mg)。

3、取步骤1得到的菌液，根据步骤2的检测结果，采用无菌水调整菌浓度，得到菌浓度为2.39mg/ml的深色有隔内生真菌001菌液。

4、菌液的稀释

用无菌水将步骤3得到的深色有隔内生真菌001菌液进行稀释，得到五个浓度的深色有隔内生真菌001菌液，具体如下：

20％深色有隔内生真菌001菌液：取步骤3得到的深色有隔内生真菌001菌液20ml，用无菌水稀释至100ml；

40％深色有隔内生真菌001菌液：取步骤3得到的深色有隔内生真菌001菌液40ml，用无菌水稀释至100ml；

60％深色有隔内生真菌001菌液：取步骤3得到的深色有隔内生真菌001菌液60ml，用无菌水稀释至100ml；

80％深色有隔内生真菌001菌液：取步骤3得到的深色有隔内生真菌001菌液80ml，用无菌水稀释至100ml；

100％深色有隔内生真菌001菌液：步骤3得到的深色有隔内生真菌001菌液。

四、菌液浸种玉米种子

1、选取大小相近，颗粒饱满的玉米种子，先用30％次氯酸钠浸种10min，然后用无菌水清洗5遍，随后用70％的酒精浸种5min，然后无菌水清洗5遍。

2、取完成步骤1的玉米种子，设置34个组别，分别处理如下：

第一组：用无菌水浸种12h；

第二组：用液体mmn培养基浸种12h；

第三组：用20％针a2-7菌液浸种12h；

第四组：用40％针a2-7菌液浸种12h；

第五组：用60％针a2-7菌液浸种12h；

第六组：用80％针a2-7菌液浸种12h；

第七组：用100％针a2-7菌液浸种12h；

第八组：用20％针a1-3菌液浸种12h；

第九组：用40％针a1-3菌液浸种12h；

第十组：用60％针a1-3菌液浸种12h；

第十一组：用80％针a1-3菌液浸种12h；

第十二组：用100％针a1-3菌液浸种12h；

第十三组：用20％深色有隔内生真菌001菌液浸种12h；

第十四组：用40％深色有隔内生真菌001菌液浸种12h；

第十五组：用60％深色有隔内生真菌001菌液浸种12h；

第十六组：用80％深色有隔内生真菌001菌液浸种12h；

第十七组：用100％深色有隔内生真菌001菌液浸种12h；

第十八组：用无菌水浸种16h；

第十九组：用液体mmn培养基浸种16h；

第二十组：用20％针a2-7菌液浸种16h；

第二十一组：用40％针a2-7菌液浸种16h；

第二十二组：用60％针a2-7菌液浸种16h；

第二十三组：用80％针a2-7菌液浸种16h；

第二十四组：用100％针a2-7菌液浸种16h；

第二十五组：用20％针a1-3菌液浸种16h；

第二十六组：用40％针a1-3菌液浸种16h；

第二十七组：用60％针a1-3菌液浸种16h；

第二十八组：用80％针a1-3菌液浸种16h；

第二十九组：用100％针a1-3菌液浸种16h；

第三十组：用20％深色有隔内生真菌001菌液浸种16h；

第三十一组：用40％深色有隔内生真菌001菌液浸种16h；

第三十二组：用60％深色有隔内生真菌001菌液浸种16h；

第三十三组：用80％深色有隔内生真菌001菌液浸种16h；

第三十四组：用100％深色有隔内生真菌001菌液浸种16h。

每组至少浸种30粒玉米种子。

3、完成步骤2后，用镊子取出玉米种子并播种至塑料杯中(每个塑料杯装有125g无菌土，每个塑料杯播种5粒种子)，然后进行培养。培养过程：第1-3天，22℃黑暗培养，空气相对湿度为70％；第4-13天，光暗交替培养(16h光照/8h黑暗，光照培养时的光照强度为1800lux，光照培养时的温度为25℃，黑暗培养时的温度为22℃)，空气相对湿度为70％。

五、侵染情况

步骤四的3的培养过程中，第7-13天，每天每组随机取3株植株幼苗，检测供试菌株定殖率(又称为侵染率)。检测定殖率的方法：取幼苗的根，切成长度约为1cm的根段，每株幼苗得到100个以上根段；每株幼苗随机取100个根段，采用酸性品红染色法进行处理，在显微镜下进行镜检，计算定殖率(定殖率＝dse定殖的根段数/总根段数)。

针a2-7菌液浸种12小时的结果见图4。针a2-7菌液浸种16小时的结果见图5。针a1-3菌液浸种12小时的结果见图6。针a1-3菌液浸种16小时的结果见图7。深色有隔内生真菌001菌液浸种12小时的结果见图8。深色有隔内生真菌001菌液浸种16小时的结果见图9。图4至图9均为3株植株的平均值。结果显示，各个浓度的针a2-7菌液浸种后，植株培养第7-13天侵染率随时间的增加不断增加，第13天时侵染率均达到90％以上。针a1-3菌液浸种后，植株的侵染率较低，第13天时侵染率在80％左右。深色有隔内生真菌001菌液浸种后，植株的侵染率较低，第13天时侵染率在80％左右。结果显示，从经济节约角度来看，20％针a2-7菌液浸种12小时，可以达到其他高浓度菌液和长浸种时间的侵染率。

六、对玉米生长的影响

步骤四的3的培养过程中，第13天，每组随机取3株植株幼苗，检测单株株高、单株叶绿素含量(spad值)和单株地上部干重。

以第一组处理后的植株作为参比植株，计算第三组至第十七组的菌液贡献率。以第十八组处理后的植株作为参比植株，计算第二十组至第三十四组的菌液贡献率。对于株高来说，菌液贡献率＝(各组处理后的植株的株高-参比植株的株高)/参比植株的株高。对于spad值来说，菌液贡献率＝(各组处理后的植株的spad值-参比植株的spad值)/参比植株的spad值。对于地上部干重来说，菌液贡献率＝(各组处理后的植株的地上部干重-参比植株的地上部干重)/参比植株的地上部干重。第一组处理后植株的平均单株株高为28.97cm，平均单株spad值为34.8，平均单株地上部干重为0.09g。第十八组处理后植株的平均单株株高为26.03cm，平均单株spad值为35.10，平均单株地上部干重为0.09g。

菌液贡献率的结果见表1(3株植株的平均值)。菌液浸种的玉米植株的株高、叶绿素含量和地上部干重均高于无菌水浸种的玉米植株。20％针a2-7菌液浸种12小时对玉米植株综合指标的贡献率明显高于其他各组。结果表明，20％针a2-7菌液浸种12小时能够有效促进玉米种子和幼苗的生长。

表1不同菌液处理对植物促生长的贡献率

序列表

<110>中国矿业大学（北京）

北京合生元生态环境工程技术有限公司

<120>一种深色有隔内生真菌菌液高效规模化产运联动生产方法

<130>gncyx200793

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>589

<212>dna

<213>darksideasp.

<400>1

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