一种犬干扰素CaIFN-λ突变体及其应用的制作方法

本申请是中国发明申请“cn201810867859.0，一种重组犬干扰素caifn-λ及其应用”的分案申请。本发明属于基因工程、生物工程领域，具体涉及一种重组犬干扰素及其应用。
背景技术：
：干扰素(interferon，ifn)是一组由干扰素诱生剂诱导生物细胞产生的具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，它们具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等生物活性。干扰素不能直接灭活病毒，而是通过诱导细胞合成抗病毒蛋白(avp)发挥效应。同时还可增强自然杀伤细胞(nk细胞)、巨噬细胞和t淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。跟踪调查发现，干扰素在治疗中具有良好的抗病毒和抑制病毒复制等作用，尤其对犬类病毒性疾病具有一定的疗效。根据产生干扰素细胞来源不同、理化性质、生物学活性和其识别受体的差异，可分为ⅰ、ⅱ和ⅲ型。i型干扰素包括ifn-α、ifn-β、ifn-ω，ⅱ型干扰素仅包括ifn-γ。其中，i型干扰素的抗病毒活性较强，是乙型肝炎等病毒病的有效治疗药物。目前兽医临床使用的犬干扰素均为α干扰素，且主要是从大肠杆菌中获得的基因重组蛋白，仅表现单一亚形，如α-2b等。λ干扰素(ifn-λ)是最近发现的ⅲ型干扰素，虽然诱生机制和生物学活性与i型干扰素相似，但两者的基因、结构和受体不同。人ifn-λ包括ifn-λ1、ifn-λ2和ifn-λ3，能有效抑制乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒和甲型流感病毒的复制。犬ifn-λ(caifn-λ)的研究相对较少。技术实现要素：为了克服现有技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了一种重组犬干扰素caifn-λ及其应用。本发明目的通过以下技术方案来实现：本发明提供了一组重组犬干扰素caifn-λ蛋白，该蛋白为野生型caifn-λ的突变体蛋白，在野生型caifn-λ序列seqidno.11的基础上，所述重组犬干扰素caifn-λ蛋白包含至少一处以下突变：e84g，t94v，t101m。在某一具体案例中，所述重组犬干扰素caifn-λ蛋白包含2处突变，e84g和t94v、e84g和t101m、或t94v和t101m。在某一具体案例中，所述重组犬干扰素caifn-λ蛋白包含3处突变，e84g，t94v和t101m。在某一具体案例中，重组犬干扰素caifn-λ蛋白的氨基酸序列选自seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6。在某一具体案例中，重组犬干扰素caifn-λ蛋白的氨基酸序列在选自seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6的序列后加入连接序列gssss和标签蛋白hhhhhh。本发明提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码重组犬干扰素caifn-λ蛋白；优选的，所述核酸分子的核苷酸序列如seqidno.1、seqidno.3或seqidno.5所示。本发明提供了一种表达盒或载体，所述表达盒或载体包含编码重组犬干扰素caifn-λ蛋白的核酸分子。本发明提供了一种重组菌，所述重组菌含有上述核酸分子或表达盒或载体的。本发明提供了一种重组犬干扰素caifn-λ蛋白、编码重组犬干扰素caifn-λ蛋白的核酸分子、包含编码重组犬干扰素caifn-λ蛋白的核酸分子的表达盒或载体、和/或重组菌在制备重组犬干扰素caifn-λ中的用途。本发明提供了一种组合物，所述组合物包含上述重组犬干扰素caifn-λ蛋白中的一种或多种。本发明提供了一种重组犬干扰素的制备方法，包括如下步骤：培养包含编码重组犬干扰素caifn-λ蛋白的核酸分子的重组菌，得到所述重组犬干扰素。相应的，本发明提供了一种重组犬干扰素产品，所述产品由上述方法制备获得。优选的，所述产品包含本发明所述重组犬干扰素caifn-λ蛋白中的一种或多种。本发明提供了一种重组犬干扰素caifn-λ蛋白在治疗犬病毒感染中的应用；优选的，所述病毒感染为犬冠状病毒感染。本发明所述“应用”或“用途”，既可表示诊断或治疗目的的应用，也可表示非诊断或治疗目的的应用，例如，科学研究等。本发明的有益效果是：本发明通过对野生型犬干扰素caifn-λ蛋白进行突变，获得了5种突变体，其中3种突变体的生物学活性显著优于野生型犬干扰素caifn-λ。本发明提供的重组野生型犬干扰素caifn-λ蛋白，即犬干扰素caifn-λ突变体蛋白具有优良的抗病毒活性，具有开发成为抗病毒药物和兽医临床应用的巨大潜力和价值。附图说明图1.野生型caifn-λ的rt-pcr扩增结果：1、caifn-λ；2、阴性对照。图2.野生型和突变体重组caifn-λ的表达分析：m、marker；1、野生型caifn-λ；2、caifn-λ-mut1；3、caifn-λ-mut2；4、caifn-λ-mut3；5、caifn-λ-mut4；6、caifn-λ-mut5。图3.纯化后野生型和突变体重组caifn-λ的westernblot分析：1、野生型caifn-λ；2、caifn-λ-mut1；3、caifn-λ-mut2；4、caifn-λ-mut3；5、caifn-λ-mut4；6、caifn-λ-mut5。图4.不同浓度梯度下标准蛋白样品的od562值标准曲线。具体实施方式通过以下实施例对本发明作进一步的详细描述，但应理解本发明并不受以下内容所限制。未详细说明的方法和步骤参照本领域常规的实验方法和步骤进行。实施例1：caifn-λ野生型和突变体的表达载体构建1、野生型caifn-λ表达载体构建：根据genbank登陆的caifn-λ基因序列(kc754970.1)，使用dnastar进行分析，去除信号肽的序列后，使用oligo6.软件设计引物，上游引物ifnλ-f为cgccatatgatgggccctgtccctacttccaa(ndei)(seqidno.12)，下游引物ifnλ-r为cccaagcttgacgcacaggtctctactgg(hindⅲ)(seqidno.13)，扩增全长总共534bp，引物由北京华大基因合成。参考liminyang等的文章(liminetal.,2013)获得扩增模板，对caifn-λ的全长进行扩增。rt-pcr的反应体系如下：模板1μl；ifnλ-f/r各1.0μl；dntps(2.5mm)1.0μl；lataq(5u/μl)0.5μl；10×lataqbufferⅱ(mg2+plus)2.0μl；ddh2o补足至20μl。pcr反应条件：预变性95℃5min；变性95℃45s；退火55℃45s；延伸72℃7min；终延伸72℃10min。反应结束后，以1.0％的琼脂糖进行核酸电泳检测(图1)。用限制性内切酶ndei和hindⅲ对pet-21a载体和回收的pcr产物进行双酶切，反应体系如下：10μlpcr回收产物(100ng/μl)或pet-21a载体(100ng/μl)，1.0μlndei，1.0μlhindⅲ，2.0μl10×cutsmart，ddh2o补足至20μl，混匀后置于金属浴上，37℃反应0.5h。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测。将大小正确的酶切产物回收。应用takara公司的t4dna连接酶对回收的酶切产物caifn-λ目的片段和pet-21a载体进行连接。连接体系：1.0μlt4dnaligase(350u/μl)；1.0μl10×t4dnaligasebuffer；6.0μlcaifn-λ目的片段；2.0μlpet-21a载体；ddh2o补足至10.0μl，混匀后置于金属浴上，16℃反应5-6h。转化感受态细胞bl21(de3)扩增后测序鉴定重组阳性克隆，获得pet-21a-ifn-λ。在pet-21a-ifn-λ插入片段的c端插入gsssshhhhhh的编码核酸序列。2、caifn-λ突变体表达载体构建：设计5种caifn-λ突变体，其编码核酸序列和氨基酸序列信息见下表：表1.caifn-λ突变体序列信息突变体编码核酸序列突变体氨基酸序列突变点mut1seqidno.1seqidno.2t101mmut2seqidno.3seqidno.4t94vmut3seqidno.5seqidno.6e84gmut4seqidno.7seqidno.8w44pmut5seqidno.9seqidno.10e29g编码核酸序列(seqidno.1、3、5、7、9)c端添加gsssshhhhhh的编码核酸序列，之后两端添加ndei和hindⅲ酶切位点，全序列由南京金斯瑞科技公司合成，克隆至pet-21a载体，转化扩增后测序鉴定重组阳性克隆，获得pet-21a-ifn-λ-mut1、pet-21a-ifn-λ-mut2、pet-21a-ifn-λ-mut3、pet-21a-ifn-λ-mut4、pet-21a-ifn-λ-mut5，具体操作方法参照上述野生型caifn-λ表达载体构建。实施例2：重组蛋白的诱导表达和纯化1、诱导表达重组蛋白：将测序正确的阳性菌按照1:100的比例接种于含氨苄抗性的10mllb液体培养基中，37℃恒温培养箱中培养至对数生长期(od600值达0.8)，取出5ml作为阴性对照，余下5ml菌液中加入iptg在25℃条件下过夜诱导。12,000rpm离心2min收集诱导和未诱导的菌体，用pbs重悬后分别与5×sds-page上样缓冲液按照1:4的比例混匀，之后将蛋白样品置于沸水浴中加热5min，冷却至室温后，以1500rpm离心30s，取适量上清，进行15％聚丙烯酰氨凝胶电泳(sds-page)，之后观察目的蛋白的表达情况。应用美国伯乐出品的半干转印仪进行转膜操作，操作过程简述如下：(1)电泳后从胶板上取下sds-page凝胶，同厚滤纸板和硝酸纤维素膜(nc膜)在半干转膜液中浸泡5min；(2)第一层滤板垫在半干转膜仪上，将nc膜放在第一层滤纸上，再将sds-page凝胶放在nc膜上，再盖上一层滤板，赶出气泡，最后盖上仪器电极，接通电源；转印条件：18v，30min。westernblot：(1)取出转印的nc膜，用tbst冲去膜表面残存的半干转膜液，放入5％脱脂乳(脱脂乳：tbst＝1:20)中37℃封闭2h；(2)封闭结束后，用tbst洗涤nc膜3次，每次5min，加入1:2000稀释后的小鼠抗his标签的一抗，室温孵育2h；(3)一抗孵育结束后，用tbst洗涤nc膜3次，每次5min，加入用1:2000稀释后的山羊抗小鼠hrp标记二抗，室温孵育45min；(4)用tbst洗涤nc膜5次，每次5min，用江苏康为世纪科技有限公司的dab底物显色试剂盒进行显色，室温作用5min。染色后，在约20kda处出现与预期大小相符的目的条带，初步判定ifn-λ-his成功表达(图2)。2、重组蛋白的纯化和定量将1.5l诱导后收集的野生型和突变体的重组菌菌体用pbs清洗后，冻融三次以破裂菌体，按照海狸纳米的beaverbeadstmhis-tagproteinpurification试剂盒进行重组蛋白的纯化，得到的目的蛋白通过超滤管浓缩，并将洗脱液换pbs，并按照碧云天蛋白定量试剂盒(产品编号：p0010s)的说明书，测定并计算纯化后的蛋白含量。ifn-λ-his蛋白经过磁珠纯化后，经westernblot检测，结果显示得到单一的大小约为20kda的特异性目的条带，表明蛋白的纯度较好(图3)。根据试剂盒测得的不同浓度梯度下标准蛋白样品的od562值，绘制标准曲线，并得到该曲线的公式(图4)。将酶标仪测定的重组caifn-λ的od562值代入公式，计算出纯化得到的目的蛋白的浓度如表2所示：表2.重组caifn-λ的蛋白浓度重组caifn-λ蛋白浓度(mg/ml)野生型0.134caifn-λ-mut10.135caifn-λ-mut20.156caifn-λ-mut30.133caifn-λ-mut40.125caifn-λ-mut50.122caifn-λ-mut1+20.171caifn-λ-mut1+30.168实施例3：重组caifn-λ抗病毒活性检测1、vsvtcid50的测定：取生长良好的crfk、mdck细胞，按照100μl/well铺到96孔板中进行培养，待长至单层，倒掉培养基，用dmem冲洗，加入dmem倍比稀释的vsv(10倍梯度)，每孔加100μl，每个浓度做6孔，继续细胞培养，每隔12-16h观察一次，按reed-muench法计算vsv的tcid50。2、重组caifn-λ抗vsv活性测定将生长状态良好的crfk、mdck细胞消化后计数，以100μl/well均匀的铺到96孔板中，培养至细胞长至单层，吸出培养基，用pbs缓冲液轻轻冲洗3次，将4％fbs的dmem培养基10倍倍比稀释纯化后的重组caifn-λ加入细胞培养板中，每孔100μl，每个稀释度做6孔，放入37℃5％co2培养箱中作用18h，弃掉含重组caifn-λ的培养基，用dmem培养基轻轻冲洗3次，每孔加入100μl含100tcid50的vsv病毒，37℃5％co2培养箱中培养，同时设阴性对照(不加病毒只加入干扰素)、阳性对照(不加重组caifn-λ，只加vsv病毒)和空白对照(只有细胞，不加病毒和干扰素)。每12h于倒置显微镜下观察细胞生长情况，待75％以上阳性对照孔的crfk、mdck细胞可观察到明显病变时，统计各稀释度的细胞孔中的病变情况，以抑制半数细胞病变的干扰素的稀释度为1个干扰素单位(iu)。按reed-muench法计算重组caifn-λ的活性，结果见表3。3、重组caifn-λ抗ccov活性测定测定方法同上，在crfk/ccov、mdck/ccov系统上，测定caifn-λ抗ccov的活性，结果见表3。表3.重组caifn-λ抗vsv和ccov活性由此可见，重组caifn-λ-mut1、caifn-λ-mut2、caifn-λ-mut3、caifn-λ-mut1+2和caifn-λ-mut1+3的抗病毒活性显著优于野生型caifn-λ，并且重组caifn-λ具有广谱抗病毒功效，对细胞免受vsv、ccov感染具有保护作用，无明显的细胞毒性，证明重组caifn-λ对犬冠状病毒病具有潜在的治疗作用。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所<120>一种犬干扰素caifn-λ突变体及其应用<130>cp11802269c-div2<160>15<170>patentinversion3.3<210>1<211>513<212>dna<213>caifn-λ突变体1核苷酸序列<400>1ggccctgtccctacttccaaacccaccacaaccaggaggggctgccacatggacaggttc60cagtctctgtcacccagggagctagaagccttcaagaaggccaaggatgccttggaagag120tcgctctcctggaagaactggagctgcagctctcgcctcttccctagatccagggacctg180agactcctgcaggcctgggagcgtcctgtggccttggaggctgagctagacttgacactg240aaggtcctggagaacatgactgactcatcgctgggggtcaccctggaccagcccctccgc300atgctgcaccacatccactcggagctccaggcttgtgtcccggctcagcccacagcagac360cccaggccccacggccgcctccaccactggctgcaccggctccagaaggcccccaaggag420tcccagggctgcctcgaggcctccatcacgttcaacctcttccgcctcctcacacgggac480ctgaaatgtgttgccagtagagacctgtgcgtc513<210>2<211>171<212>prt<213>caifn-λ突变体1氨基酸序列<400>2glyprovalprothrserlysprothrthrthrargargglycyshis151015metaspargpheglnserleuserproarggluleuglualaphelys202530lysalalysaspalaleuglugluserleusertrplysasntrpser354045cysserserargleupheproargserargaspleuargleuleugln505560alatrpgluargprovalalaleuglualagluleuaspleuthrleu65707580lysvalleugluasnmetthraspserserleuglyvalthrleuasp859095glnproleuargmetleuhishisilehissergluleuglnalacys100105110valproalaglnprothralaaspproargprohisglyargleuhis115120125histrpleuhisargleuglnlysalaprolysgluserglnglycys130135140leuglualaserilethrpheasnleupheargleuleuthrargasp145150155160leulyscysvalalaserargaspleucysval165170<210>3<211>513<212>dna<213>caifn-λ突变体2核苷酸序列<400>3ggccctgtccctacttccaaacccaccacaaccaggaggggctgccacatggacaggttc60cagtctctgtcacccagggagctagaagccttcaagaaggccaaggatgccttggaagag120tcgctctcctggaagaactggagctgcagctctcgcctcttccctagatccagggacctg180agactcctgcaggcctgggagcgtcctgtggccttggaggctgagctagacttgacactg240aaggtcctggagaacatgactgactcatcgctgggggtcgtcctggaccagcccctccgc300acgctgcaccacatccactcggagctccaggcttgtgtcccggctcagcccacagcagac360cccaggccccacggccgcctccaccactggctgcaccggctccagaaggcccccaaggag420tcccagggctgcctcgaggcctccatcacgttcaacctcttccgcctcctcacacgggac480ctgaaatgtgttgccagtagagacctgtgcgtc513<210>4<211>171<212>prt<213>caifn-λ突变体2氨基酸序列<400>4glyprovalprothrserlysprothrthrthrargargglycyshis151015metaspargpheglnserleuserproarggluleuglualaphelys202530lysalalysaspalaleuglugluserleusertrplysasntrpser354045cysserserargleupheproargserargaspleuargleuleugln505560alatrpgluargprovalalaleuglualagluleuaspleuthrleu65707580lysvalleugluasnmetthraspserserleuglyvalvalleuasp859095glnproleuargthrleuhishisilehissergluleuglnalacys100105110valproalaglnprothralaaspproargprohisglyargleuhis115120125histrpleuhisargleuglnlysalaprolysgluserglnglycys130135140leuglualaserilethrpheasnleupheargleuleuthrargasp145150155160leulyscysvalalaserargaspleucysval165170<210>5<211>513<212>dna<213>caifn-λ突变体3核苷酸序列<400>5ggccctgtccctacttccaaacccaccacaaccaggaggggctgccacatggacaggttc60cagtctctgtcacccagggagctagaagccttcaagaaggccaaggatgccttggaagag120tcgctctcctggaagaactggagctgcagctctcgcctcttccctagatccagggacctg180agactcctgcaggcctgggagcgtcctgtggccttggaggctgagctagacttgacactg240aaggtcctggggaacatgactgactcatcgctgggggtcaccctggaccagcccctccgc300acgctgcaccacatccactcggagctccaggcttgtgtcccggctcagcccacagcagac360cccaggccccacggccgcctccaccactggctgcaccggctccagaaggcccccaaggag420tcccagggctgcctcgaggcctccatcacgttcaacctcttccgcctcctcacacgggac480ctgaaatgtgttgccagtagagacctgtgcgtc513<210>6<211>171<212>prt<213>caifn-λ突变体3氨基酸序列<400>6glyprovalprothrserlysprothrthrthrargargglycyshis151015metaspargpheglnserleuserproarggluleuglualaphelys202530lysalalysaspalaleuglugluserleusertrplysasntrpser354045cysserserargleupheproargserargaspleuargleuleugln505560alatrpgluargprovalalaleuglualagluleuaspleuthrleu65707580lysvalleuglyasnmetthraspserserleuglyvalthrleuasp859095glnproleuargthrleuhishisilehissergluleuglnalacys100105110valproalaglnprothralaaspproargprohisglyargleuhis115120125histrpleuhisargleuglnlysalaprolysgluserglnglycys130135140leuglualaserilethrpheasnleupheargleuleuthrargasp145150155160leulyscysvalalaserargaspleucysval165170<210>7<211>513<212>dna<213>caifn-λ突变体4核苷酸序列<400>7ggccctgtccctacttccaaacccaccacaaccaggaggggctgccacatggacaggttc60cagtctctgtcacccagggagctagaagccttcaagaaggccaaggatgccttggaagag120tcgctctccccgaagaactggagctgcagctctcgcctcttccctagatccagggacctg180agactcctgcaggcctgggagcgtcctgtggccttggaggctgagctagacttgacactg240aaggtcctggagaacatgactgactcatcgctgggggtcaccct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