一种重组O型口蹄疫病毒VP1基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗株及其制备方法和应用与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组o型口蹄疫病毒vp1基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗株及其制备方法和应用。

背景技术：

塞内卡病毒a(senecavirusa,sva)，也称塞内卡病毒(senecavirus)、塞尼卡谷病毒(senecavalleyvirus,svv)，属于小rna病毒科(picornaviridae)塞内卡病毒属(senecavirus)，也是该属的唯一成员。该病毒感染猪能够引起猪的原发性水泡病，与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎等引起的临床症状难以区分。sva感染后能引起断奶仔猪、保育、育肥和繁殖的各年龄段的猪发生水泡性病变，同时伴随跛行、发热、厌食、嗜睡等临床症状，新生仔猪除了上述症状外，还可能存在持续的腹泻、脱水等症状，甚至会突然死亡。

口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus,fmdv)属于微rna病毒科(picornaviridae)口蹄疫病毒属(aphthovirus)的单股正链rna病毒，包括a、o、c、asial、sat1、sat2、sat3七个血清型，型间无交叉保护。病毒基因组全长约8.5kb，由5’端非编码区、orf区和3’端非编码区组成。编码区编码一个多聚蛋白，经病毒自身蛋白酶和宿主细胞蛋白酶作用逐级降解，形成多种中间体和成熟的4种结构蛋白(vp4、vp2、vp3、vp1)和8种非结构蛋白(l^pro、2a、2b、2c、3a、3b、3c、3d)。其中，vp1作为结构蛋白基因编码所得的最重要的衣壳蛋白，是决定fmdv抗原性、诱导机体产生中和抗体和激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白，且在小rna病毒科中，vp1被公认为是免疫原性最强的蛋白，因此，作为fmdv的抗原基因，表达vp1蛋白，保持其生物学活性与免疫原性，在fmdv基因工程疫苗的研究方面有重要作用。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组o型口蹄疫病毒vp1基因的塞内卡病毒重组核酸、包含所述重组核酸的塞内卡重组病毒、由所述重组核酸编码的塞内卡重组病毒、包含所述塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株及其制备方法和应用。本发明通过对svv/fj/001株进行基因缺失突变改造，同时在svacdna中融合进o型口蹄疫病毒的vp1基因，得到塞内卡重组病毒，该重组病毒能够表达融合进的外源fmdvvp1基因，且表达产物具有良好的反应原性；制备得到的疫苗株抗原产能高、致病性显著降低甚至对猪无致病性；灭活疫苗免疫动物不仅能产生sva的免疫活性，且能产生针对融合基因的免疫活性。该疫苗株显著提高了生物安全性，可用于塞内卡病毒及一种或多种非塞内卡病毒的防控。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种塞内卡病毒重组核酸，所述重组核酸的序列包括对塞内卡病毒株的5'utr基因序列进行缺失突变改造，同时在塞内卡病毒cdna的sphⅰ和notⅰ酶切位点之间插入o型口蹄疫病毒的vp1基因。

优选的，对塞内卡病毒株的5'utr基因序列进行缺失突变改造后的5'utr基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；插入的o型口蹄疫病毒的vp1基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

优选的，所述塞内卡病毒株包括svv/fj/001株。

本发明还提供了所述重组核酸在制备重组o型口蹄疫病毒vp1基因的塞内卡病毒重组核酸或塞内卡重组疫苗株中的应用。

本发明还提供了一种包含所述重组核酸的重组o型口蹄疫病毒vp1基因的塞内卡重组病毒。

本发明还提供了一种由所述的重组核酸编码的重组o型口蹄疫病毒vp1基因的塞内卡重组病毒。

本发明还提供了一种包含所述的塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株。

优选的，所述塞内卡重组疫苗株不仅能够激发动物对塞内卡病毒的免疫活性，还能产生针对口蹄疫病毒的免疫活性。

本发明还提供了所述的塞内卡重组病毒的构建方法，包括如下步骤：

(1)以o/by/2010株的cdna为模板，用特异性引物对扩增得到o型fmdv的vp1基因；扩增所述vp1基因的特异性引物对包括上游引物和下游引物os-r，所述上游引物包括ovp1-f0和ovp1-f，所述上游引物ovp1-f0的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述上游引物ovp1-f的核苷酸序列如seqidno.4所示，所述下游引物os-r的核苷酸序列如seqidno.5所示；

(2)以svv/fj/001株的cdna为模板，利用特异性引物对分别扩增得到svv/fj/001株的s1片段和s20片段；扩增所述s1片段的特异性引物对包括上游引物和下游引物sva-1r，所述上游引物包括sva-1f0和sva-1f；所述上游引物sva-1f0的核苷酸序列如seqidno.6所示，所述上游引物sva-1f的核苷酸序列如seqidno.7所示；所述下游引物sva-1r的核苷酸序列如seqidno.8所示；

扩增所述s20片段的特异性引物对包括上游引物sva-2f0和下游引物sva-2r，所述上游引物sva-2f0的核苷酸序列如seqidno.9所示，所述下游引物sva-2r的核苷酸序列如seqidno.10所示；

(3)将步骤(1)中获得的vp1基因片段与所述s20基因片段融合，得s2-ovp1片段；

(4)将所述s1片段和s2-ovp1片段分别与pmd20t载体连接，得到亚克隆质粒pmd-s1和pmd-s2-ovp1；

(5)以所述亚克隆质粒pmd-s1为模板，用突变引物sva-m5utrf和sva-m5utrr进行扩增，得到亚克隆质粒pmd-ms1，所述sva-m5utrf的核苷酸序列如seqidno.11所示，所述sva-m5utrr的核苷酸序列如seqidno.12所示；

(6)将质粒pmd-ms1用paci和sphi双酶切、质粒pmd-s2-ovp1用sphi和noti双酶切后，回收基因片段，连接替换插入到经paci和noti双酶切后的真核转录质粒pro/cha/99中，得到重组质粒prsvv/fj-m-ovp1；

(7)将得到的所述重组质粒prsvv/fj-m-ovp1转染塞内卡病毒敏感细胞，获得重组o型fmdvvp1基因的塞内卡重组病毒。

优选的，步骤(3)中利用引物ovp1-f和sva-2r进行融合pcr，使基因片段融合；所述ovp1-f的核苷酸序列如seqidno.4所示，所述sva-2r的核苷酸序列如seqidno.10所示。

优选的，步骤(5)所述突变后的5'utr基因片段包括如seqidno.1所示的核酸序列，或包括所述的重组核酸。

优选的，步骤(7)所述塞内卡病毒敏感细胞包括bhk-21细胞、pk-15细胞、st细胞、sk-rst细胞、ibrs-2细胞、h1299细胞或293t细胞。

本发明还提供了所述重组o型fmdvvp1基因的塞内卡重组病毒或利用所述方法制备得到的塞内卡重组病毒在制备塞内卡重组疫苗中的应用。

本发明还提供了一种重组o型fmdvvp1基因的塞内卡重组疫苗。

本发明还提供了所述塞内卡重组疫苗株或所述塞内卡重组疫苗在制备用于预防和/或控制动物由塞内卡病毒和口蹄疫病毒引起的相关疾病的药物中的应用。

优选的，所述动物包括猪、牛或羊。

本发明提供一种重组o型口蹄疫病毒vp1基因的塞内卡病毒重组核酸、包含所述重组核酸的塞内卡重组病毒、由所述重组核酸编码的塞内卡重组病毒、包含所述塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株及其制备方法和应用。依据塞内卡病毒分子流行病学及前期积累的流行毒株等资源，利用已建立的高效反向遗传操作技术平台，通过对svv/fj/001株基因分析，构建出对该病毒株基因缺失突变改造的全长cdna，同时在svacdna中融合进o型口蹄疫病毒的vp1基因，经过病毒拯救、重组毒株生物学特性测定等，显示成功拯救的重组病毒具有与野生型相似的细胞感染特性和高产特性，同时，重组病毒能够表达融合进的o型fmdvvp1蛋白，且其具有良好的反应原性，致病性研究结果显示重组病毒致病性显著降低甚至对猪无致病性，显著提高了毒株的生物安全性，因此，可用利用该制备方法，以sva作为插入外源病原抗原基因的病毒骨架构建嵌合疫苗株，免疫动物后，以期同时获得针对亲本骨架毒株和插入的外源抗原基因的免疫活性。

本发明所述svv/fj/001株的抗原基因p1基因与我国报道的已分离的sva流行株基因同源性达98.6％以上，且与其他国家的流行毒株也具有很高的同源性，由于p1基因是sva的抗原基因，能够诱导机体产生中和抗体，因此，以svv/fj/001株为模板，利用反向遗传操作技术，经扩增与改造，构建sva感染性cdna克隆，同时将o型口蹄疫病毒抗原基因vp1插入sva感染性克隆中，成功拯救重组病毒，不仅实现了sva毒株抗原匹配性和免疫应答性，保证了其与流行毒株的针对性，且插入的口蹄疫抗原基因能够得到有效表达，表明利用这种构建方法，sva可以作为外源基因表达的病毒骨架，用于嵌合表达不同的外源病原的抗原基因，实现以sva为基础的嵌合疫苗的研究与应用。

本发明所述塞内卡重组病毒rsvv/fj-m-ovp1病毒滴度高，稳定传代后病变时间约12～18h，毒价为10^6.5tcid50/ml～10^10.0tcid50/ml。

本发明所述塞内卡重组病毒rsvv/fj-m-ovp1，在病毒的5'utr进行了部分缺失及突变的改造，同时嵌合了能高效表达的o型fmdvvp1基因，该重组毒株与svv/fj/001的致病性相比较，显著降低了毒株对猪的致病性，甚至对猪无致病性，显著提高了生物安全性。

本发明的方案实现了更为主动有效的sva重组/嵌合疫苗毒株构建方式，实现了sva毒种制备工艺的革新，具有重大应用价值。

附图说明

图1为实施例2中扩增svas1片段和s2-ovp1片段的电泳结果，其中1为s1片段扩增产物；2为s2-ovp1片段扩增产物；m为dl5000dnamarker；

图2为实施例2中塞内卡病毒重组质粒prsvv/fj-m-ovp1的构建方法示意图；

图3为实施例3中重组病毒rsvv/fj-m-ovp1株感染bhk-21细胞后引起的细胞病变效应(cpe)，其中a表示正常bhk-21细胞；b表示出现cpe的bhk-21细胞；

图4为实施例4中接种了重组病毒rsvv/fj-m-ovp1株的间接免疫荧光结果，其中a表示正常细胞对照，b表示接种重组病毒rsvv/fj-m-ovp1株后的检测结果；

图5为实施例4中重组病毒rsvv/fj-m-ovp1株与o型fmdv特异性抗体反应性的elisa检测结果；

图6为实施例4中重组病毒rsvv/fj-m-ovp1的westernblot分析结果。

具体实施方式

本发明提供了一种塞内卡病毒重组核酸，所述重组核酸的序列包括对塞内卡病毒株的5'utr基因序列进行缺失突变改造，同时在塞内卡病毒cdna的sphⅰ和notⅰ酶切位点之间插入o型口蹄疫病毒的vp1基因。

本发明所述塞内卡病毒株优选包括svv/fj/001株。本发明所述svv/fj/001株优选为保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno.v201802的svv/fj/001，且已经在中国授权专利“塞尼卡谷病毒疫苗及其制备方法和应用”zl201810003888.2中进行过公开。

本发明优选对svv/fj/001株的5'utr基因序列进行缺失突变改造，且改造后的svv/fj/001株的5'utr基因核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明所述插入的o型口蹄疫病毒的vp1基因的核苷酸序列优选如seqidno.2所示。

本发明还提供了所述重组核酸在制备重组o型口蹄疫病毒vp1基因的塞内卡病毒重组核酸或塞内卡重组疫苗株中的应用。

本发明还提供了一种包含所述的重组核酸的重组o型口蹄疫病毒vp1基因的塞内卡重组病毒。

本发明还提供了一种由所述的重组核酸编码的重组o型口蹄疫病毒vp1基因的塞内卡重组病毒。

本发明还提供了一种包含所述的塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株。

本发明所述塞内卡重组疫苗株不仅能够激发动物对塞内卡病毒的免疫活性，还能产生针对口蹄疫病毒的免疫活性。

本发明还提供了所述的塞内卡重组病毒的构建方法，包括如下步骤：

(1)以o/by/2010株的cdna为模板，用特异性引物对扩增得到o型fmdv的vp1基因；扩增所述vp1基因的特异性引物对包括上游引物和下游引物os-r，所述上游引物包括ovp1-f0和ovp1-f，所述上游引物ovp1-f0的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述上游引物ovp1-f的核苷酸序列如seqidno.4所示，所述下游引物os-r的核苷酸序列如seqidno.5所示；

(2)以svv/fj/001株的cdna为模板，利用特异性引物对分别扩增得到svv/fj/001株的s1片段和s20片段；扩增所述s1片段的特异性引物对包括上游引物和下游引物sva-1r，所述上游引物包括sva-1f0和sva-1f；所述上游引物sva-1f0的核苷酸序列如seqidno.6所示，所述上游引物sva-1f的核苷酸序列如seqidno.7所示；所述下游引物sva-1r的核苷酸序列如seqidno.8所示；

扩增所述s20片段的特异性引物对包括上游引物sva-2f0和下游引物sva-2r，所述上游引物sva-2f0的核苷酸序列如seqidno.9所示，所述下游引物sva-2r的核苷酸序列如seqidno.10所示；

(3)将步骤(1)中获得的vp1基因片段与所述s20基因片段融合，得s2-ovp1片段；

(4)将所述s1片段和s2-ovp1片段分别与pmd20t载体连接，得到亚克隆质粒pmd-s1和pmd-s2-ovp1；

(5)以所述亚克隆质粒pmd-s1为模板，用突变引物sva-m5utrf和sva-m5utrr进行扩增，得到亚克隆质粒pmd-ms1，所述sva-m5utrf的核苷酸序列如seqidno.11所示，所述sva-m5utrr的核苷酸序列如seqidno.12所示；

(6)将质粒pmd-ms1用paci和sphi双酶切、质粒pmd-s2-ovp1用sphi和noti双酶切后，回收基因片段，连接替换插入到经paci和noti双酶切后的真核转录质粒pro/cha/99中，得到重组质粒prsvv/fj-m-ovp1；

(7)将得到的所述重组质粒prsvv/fj-m-ovp1转染塞内卡病毒敏感细胞，获得重组o型fmdvvp1基因的塞内卡重组病毒。

本发明以o/by/2010株的cdna为模板，用特异性引物对扩增得到o型fmdv的vp1基因；扩增所述vp1基因的特异性引物对包括上游引物和下游引物os-r，所述上游引物包括ovp1-f0和ovp1-f，所述上游引物ovp1-f0的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述上游引物ovp1-f的核苷酸序列如seqidno.4所示，所述下游引物os-r的核苷酸序列如seqidno.5所示。本发明优选根据o型口蹄疫病毒的o/by/2010株基因序列(genebank：jn998085)设计合成扩增vp1的引物：

ovp1-f0：5'-gatgcaatcaggcgacgtcgagaccaaccctggccctatgaccacttcgacgggcgag-3'(seqidno.3)；

ovp1-f：5'-cccagcatgcttccctttcgcagctacaagcagaagatgctgatgcaatcaggcgacgtc-3'(seqidno.4)，横线部分为sphⅰ酶切位点；

os-r：5'-caggatcgggttgtcagaagcgggcccagggttggactccac-3'(seqidno.5)。

本发明优选提取o/by/2010株的总rna，反转录合成第一链cdna，以反转录的第一链cdna为模板，用引物ovp1-f0和os-r扩增，以该扩增产物为模板，用引物ovp1-f和os-r进行第二轮扩增，获得含o型口蹄疫病毒vp1的基因片段，具体如seqidno.2所示。本发明所述pcr的扩增条件优选为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃50s，35个循环后；72℃10min。

本发明以svv/fj/001株的cdna为模板，利用特异性引物对分别扩增得到svv/fj/001株的s1片段和s20片段；扩增所述s1片段的特异性引物对包括上游引物和下游引物sva-1r，所述上游引物包括sva-1f0和sva-1f；所述上游引物sva-1f0的核苷酸序列如seqidno.6所示，所述上游引物sva-1f的核苷酸序列如seqidno.7所示；所述下游引物sva-1r的核苷酸序列如seqidno.8所示；扩增所述s20片段的特异性引物对包括上游引物sva-2f0和下游引物sva-2r，所述上游引物sva-2f0的核苷酸序列如seqidno.9所示，所述下游引物sva-2r的核苷酸序列如seqidno.10所示。

本发明对所述svv/fj/001株的cdna的来源并没有特殊限定，优选通过提取rna后反转录得到。

本发明扩增s1片段和s20片段所使用的各引物序列如下所示：

sva-1f0：5'-gtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtcttgaaagggggggctgggcc-3'(seqidno.6)；

sva-1f：5'-ataggtttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactatagga-3'(seqidno.7)，横线部分为pacⅰ酶切位点；

sva-1r：5'-gggaagcatgctggggcaccaggcac-3'(seqidno.8)，横线部分为sphⅰ酶切位点；

sva-2f0：5'-gtggagtccaaccctgggcccgcttctgacaacccgatcctg-3'(seqidno.9)；

sva-2r：5'-ttttctagagcggccgct38-3'(seqidno.10)，横线部分为noti酶切位点，t38表示38nt的poly(t)。

在本发明中，扩增s1片段所用上游引物sva-1f、sva-1f0中引入paci酶切位点和榔头锤酶核心序列，以保证在转录后经剪切修饰产生具有感染性的病毒rna，其下游引物sva-1r含sphi酶切位点；扩增s20片段的上游引物为sva-2f0，用于扩增且与ovp1片段融合，其下游引物sva-2r含noti酶切位点和38nt的poly(t)。本发明在扩增所述s1片段时，优选包括首先用引物sva-1f0和sva-1r扩增，以该扩增产物为模板，然后用引物sva-1f和sva-1r进行第二轮扩增，获得所述s1片段。

本发明对所述s1片段和s20片段的扩增体系和程序并没有特殊限定，优选按照《精编分子生物学实验指南》(f.m.奥斯伯，r.e.金斯顿，j.g.赛德曼等主编，马学军，舒跃龙译，北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行即可。

本发明将步骤(1)中获得的vp1基因片段与所述s20基因片段融合，得s2-ovp1片段。本发明优选利用引物ovp1-f和sva-2r进行融合pcr，使基因片段融合；所述ovp1-f的核苷酸序列如seqidno.4所示，所述sva-2r的核苷酸序列如seqidno.10所示。本发明所述融合pcr的扩增条件优选为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃4min30s，30个循环后；72℃10min。

本发明将所述s1片段和s2-ovp1片段分别与pmd20t载体连接，得到亚克隆质粒pmd-s1和pmd-s2-ovp1。本发明优选将得到的扩增产物，分别通过胶回收的方式收集所述s1片段和s2-ovp1片段。本发明对所述连接的体系和程序并没有特殊限定。

本发明以所述亚克隆质粒pmd-s1为模板，用突变引物sva-m5utrf和sva-m5utrr进行扩增，得到亚克隆质粒pmd-ms1，所述sva-m5utrf的核苷酸序列如seqidno.11所示，所述sva-m5utrr的核苷酸序列如seqidno.12所示。本发明所述突变引物的序列分别为：

sva-m5utrf：5’-gttctagcctactcgttttttcccctactcactcattcgtgttgtaactacaggat-3’(seqidno.11)；

sva-m5utrr：5’-atcctgtagttacaacacgaatgagtgagtaggggaaaaaacgagtaggctagaac-3’(seqidno.12)。

利用本发明所述方案，经过突变后的5'utr基因片段包括优选如seqidno.1所示的核酸序列，或包括上述重组核酸。

本发明将质粒pmd-ms1用paci和sphi双酶切、质粒pmd-s2-ovp1用sphi和noti双酶切后，回收基因片段，连接替换插入到经paci和noti双酶切后的真核转录质粒pro/cha/99中，得到重组质粒prsvv/fj-m-ovp1。本发明所述重组质粒prsvv/fj-m-ovp1内含改造的svv/fj/001全长基因同时嵌合o型fmdvvp1基因。

本发明将得到的所述重组质粒prsvv/fj-m-ovp1转染塞内卡病毒敏感细胞，获得重组o型fmdvvp1基因的塞内卡重组病毒。本发明所述塞内卡病毒敏感细胞包括bhk-21细胞、pk-15细胞、st细胞、sk-rst细胞、ibrs-2细胞、h1299细胞或293t细胞。

本发明还提供了所述重组o型fmdvvp1基因的塞内卡重组病毒或利用所述方法制备得到的塞内卡重组病毒在制备塞内卡重组疫苗中的应用。

本发明还提供了一种重组o型fmdvvp1基因的塞内卡重组疫苗。本发明对所述塞内卡重组疫苗的制备方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法制备疫苗即可。

本发明还提供了所述塞内卡重组疫苗株或所述塞内卡重组疫苗在制备用于同时预防和/或控制动物由塞内卡病毒和口蹄疫病毒引起的相关疾病的药物中的应用。

本发明所述动物优选包括猪、牛或羊。

在本发明中，所述塞内卡重组病毒/疫苗株优选的还可以包含一种或多种非塞尼卡谷病毒株的抗原基因，所述非塞尼卡谷病毒株优选包括：口蹄疫病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒，因此以上述塞内卡重组病毒制备得到的相应的塞内卡重组疫苗，除预防和/或控制动物塞尼卡谷病毒外，还可以预防和/或控制一种或多种非塞尼卡谷病毒引起的相关疾病。

下面结合实施例对本发明提供的一种塞内卡病毒重组核酸及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(f.m.奥斯伯，r.e.金斯顿，j.g.赛德曼等主编，马学军，舒跃龙译，北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

实施例1

o型口蹄疫病毒vp1基因的获得

o/by/2010毒株由农业部兽医局指定国家口蹄疫参考实验室保藏，公众可通过农业部兽医局批示的委托函获得。根据o/by/2010株基因序列(genebank：jn998085)设计合成扩增vp1的引物：

ovp1-f0：5'-gatgcaatcaggcgacgtcgagaccaaccctggccctatgaccacttcgacgggcgag-3'(seqidno.3)；

ovp1-f：5'-cccagcatgcttccctttcgcagctacaagcagaagatgctgatgcaatcaggcgacgtc-3'(seqidno.4)；

os-r：5'-caggatcgggttgtcagaagcgggcccagggttggactccac-3'(seqidno.5)。

在以上的特异引物中，扩增ovp1片段所用上游引物ovp1-f、ovp1-f0中引入sphi酶切位点和sva基因序列，其下游引物为os-r，用于扩增且与sva-s20片段融合。

用rnaeasyminikit(qiagen)提取o/by/2010的总rna，用引物oligodt反转录合成第一链cdna，用具有极强延伸能力的primescriptreversetranscriptase(takara公司)反转录酶，按照产品说明书配制20μl反应体系，于42℃反应1h备用，以反转录的第一链cdna为模板，用引物ovp1-f0和os-r扩增，以该扩增产物为模板，用引物ovp1-f和os-r进行第二轮扩增，获得含o型口蹄疫病毒vp1的基因片段，上述扩增用适合长片段扩增、性能优良的la(takara公司)dna聚合酶，按照产品说明书配制50μl反应体系，扩增条件为：94℃5min，94℃30s，57℃30s，72℃50s，35个循环后，72℃10min，纯化回收pcr扩增产物。测序结果显示o型口蹄疫病毒vp1是seqidno.2所示的核苷酸序列。

实施例2

重组o型口蹄疫病毒vp1基因的塞内卡病毒感染性克隆的构建

所用svv/fj/001毒株保藏于中国典型培养物保藏中心(微生物保藏号：cctccno:v201802)，(公开于授权专利“塞尼卡谷病毒疫苗及其制备方法和应用”zl201810003888.2中，其全文通过引用并入本申请中)，根据sva基因组序列(genebank：ky747510)，设计合成扩增引物：

sva-1f0：5'-gtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtcttgaaagggggggctgggcc-3'(seqidno.6)；

sva-1f：5'-ataggtttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactatagga-3'(seqidno.7)；

sva-1r：5'-gggaagcatgctggggcaccaggcac-3'(seqidno.8)；

sva-2f0：5'-gtggagtccaaccctgggcccgcttctgacaacccgatcctg-3'(seqidno.9)；

sva-2r：5'-ttttctagagcggccgct38-3'(seqidno.10)；

sva-m5utrf：5'-gttctagcctactcgttttttcccctactcactcattcgtgttgtaactacaggat-3'(seqidno.11)；

sva-m5utrr：5'-atcctgtagttacaacacgaatgagtgagtaggggaaaaaacgagtaggctagaac-3'(seqidno.12)。

在以上的特异引物中，扩增s1片段所用上游引物sva-1f、sva-1f0中引入paci酶切位点和榔头锤酶核心序列，以保证在转录后经剪切修饰产生具有感染性的病毒rna，其下游引物sva-1r含sphi酶切位点；扩增s20片段的上游引物为sva-2f0，用于扩增且与ovp1片段融合，其下游引物sva-2r含noti酶切位点和38nt的poly(t)。sva-m5utrf和sva-m5utrr是对s1片段上的5’utr基因进行缺失和定点突变的引物。

用rnaeasyminikit(qiagen)提取svv/fj/001的总rna，用引物sva-2r反转录合成第一链cdna，用具有极强延伸能力的primescriptreversetranscriptase(takara公司)反转录酶，按照产品说明书配制20μl反应体系，于42℃反应1h备用，以反转录的第一链cdna为模板，用引物sva-1f0和sva-1r扩增，以该扩增产物为模板，用引物sva-1f和sva-1r进行第二轮扩增，获得第一个基因片段s1；以反转录的第一链cdna为模板，用引物sva-2f0和sva-2r扩增获得第二个基因片段s20。上述扩增用适合长片段扩增、性能优良的la(takara公司)dna聚合酶，按照产品说明书配制50μl反应体系，扩增条件为：94℃5min，94℃30s，57℃30s，72℃3min30s，35个循环后，72℃10min，纯化回收pcr扩增产物。

将实施例1中得到的含o型口蹄疫病毒vp1的基因片段与上述扩增得到的s20基因片段为模板，进行融合pcr，反应加入引物ovp1-f和sva-2r，得到svas2-ovp1片段，扩增条件为：94℃5min，94℃30s，57℃30s，72℃4min30s，30个循环后，72℃10min，纯化回收pcr扩增产物。上述扩增产物的电泳结果如图1所示，s1和s2-ovp1大小分别为3506bp和4587bp，与预期大小相符。

将上述s1和s2-ovp1基因片段分别进行胶回收，与pmd20t载体连接，转化jm109感受态细胞，筛选、测序鉴定阳性克隆，分别命名为pmd-s1和pmd-s2-ovp1。以质粒pmd-s1为模板，用引物sva-m5utrf和sva-m5utrr扩增，缺失并突变s1片段上的5’utr基因，扩增使用高保真性的hs(takara公司)dna聚合酶，按照产品说明书配制50μl反应体系，扩增条件为：95℃5min；95℃1min，55℃1min，68℃6min，20个循环后；68℃10min，扩增产物用dpni消化去除模板质粒后，转化dh5α感受态细胞，筛选、测序鉴定阳性克隆，命名为pmd-ms1，测序结果显示ms1含有经缺失突变改造的5’utr基因，是如seqidno.1所示的核苷酸序列。

将质粒pmd-ms1用paci和sphi双酶切、质粒pmd-s2-ovp1用sphi和noti双酶切后，分别回收目的片段，然后将含有o型口蹄疫病毒o/cha/99株拯救系统的质粒pro/cha/99(公开于授权专利“asia1型口蹄疫重组病毒及其制备方法和应用”zl201310175323.x和“a型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用”zl201310175324.4中，其全文通过引用并入本申请中)用paci和noti双酶切，纯化回收载体片段，经t4连接酶连接、转化至jm109感受态细胞中，经酶切、测序鉴定阳性克隆，获得含5'utr改造的嵌合o型口蹄疫病毒vp1基因的sva重组质粒prsvv/fj-m-ovp1，构建方法如图2所示。

实施例3

重组o型口蹄疫病毒vp1基因的塞内卡重组病毒的拯救及不同细胞的培养特性

3.1重组塞内卡病毒的拯救

用plasmidplusmaxikit(qiagen公司)制备由实施例2得到的重组质粒prsvv/fj-m-ovp1，当bhk-21细胞生长至80％时用于转染，在脂质体lipofectamine^tm2000(invitrogen)的介导下将4μg重组质粒转染bhk-21细胞，同时设立脂质体对照和正常细胞对照，放置于含5％co2的37℃培养箱中，转染6h后弃去上清，加入mem培养基，继续培养，观察细胞状态及细胞病变情况，待细胞出现90％左右病变时收获病毒，反复冻融3次后再次接种bhk-21细胞，直到病毒能稳定地产生细胞病变，出现细胞变圆、脱落，逐渐形成空斑、崩解成碎片的病变现象。将得到的重组病毒命名为rsvv/fj-m-ovp1，在图3中，a：为正常对照bhk-21细胞图片；b：拯救的重组病毒rsvv/fj-m-ovp1感染bhk-21。

3.2重组塞内卡病毒在不同细胞的培养特性

将上述3.1拯救获得的重组塞内卡病毒rsvv/fj-m-ovp1株感染不同细胞，结果发现该重组毒株能够在bhk-21细胞、pk-15细胞、st细胞、sk-rst细胞、ibrs-2细胞、h1299细胞或293t细胞等细胞中增殖，并引起典型的细胞病变，与野生亲本毒株svv/fj/001株在上述不同细胞上的培养特性相似。

实施例4

重组o型口蹄疫病毒vp1基因的塞内卡重组病毒的鉴定

4.1rt-pcr鉴定重组病毒的稳定性

将稳定传代的rsvv/fj-m-ovp1株感染bhk-21细胞的上清用rnaeasyminikit(qiagen)提取总rna，反转录后，扩增融合ovp1基因的s2-ovp1基因片段及含5'utr的s1基因，纯化回收后送测序，结果显示获得的插入外源基因的片段及5'utr基因与理论序列一致。将传代5代、10代、15代、20代的重组病毒用同样方法扩增上述两个片段，经测序显示，重组病毒在传代过程中插入的ovp1基因和5'utr的定点缺失突变能够稳定存在。

4.2间接免疫荧光鉴定sva病毒抗原

将rsvv/fj-m-ovp1株感染bhk-21细胞的培养物反复冻融后，接种至底部放置了载玻片的生长有bhk-21细胞的六孔板里(单层细胞生长至60％～70％)，置于含5％co2的37℃培养箱中，24h后按常规方法做间接免疫荧光，一抗为sva豚鼠阳性血清，二抗为fitc标记山羊抗豚鼠igg(sigma公司)，同时设正常细胞对照。接种rsvv/fj-m-ovp1株培养物的细胞中可见绿色特异性荧光，而正常细胞对照无可见荧光产生(图4)。

4.3elisa检测

将svv/fj/001株、rsvv/fj-m-ovp1株、o/by/2010株培养物反复冻融后分别灭活，用包被液稀释后包被elisa反应板，设正常细胞培养物为对照，按间接elisa的方法检测包被抗原与o型fmdv特异性抗体的反应性，一抗为o型fmdv特异性单抗，二抗为hrp标记羊抗鼠igg(sigma公司)。rsvv/fj-m-ovp1株可以与o型fmdv抗体特异性结合，和o/by/2010株与该抗体的反应性相似，svv/fj/001株、细胞培养物均不与o型fmdv特异性抗体反应(图5)。

4.4westernblot分析

收取svv/fj/001株、rsvv/fj-m-ovp1株、o/by/2010株感染的细胞和正常对照细胞，按照westernblot方法处理细胞蛋白样品后进行sds-page电泳、转膜，封闭，一抗为o型fmdv兔多抗，二抗为hrp标记山羊抗兔igg(sigma公司)。结果显示，rsvv/fj-m-ovp1株感染的细胞样品在25kd左右能检测到特异性的反应条带，较o/by/2010株样品条带略大，原因推测是2a融合表达。而svv/fj/001株样品和正常细胞对照均未出现蛋白条带(图6)。

实施例5

重组o型口蹄疫病毒vp1基因的塞内卡重组病毒的致病力试验

5.1重组塞内卡病毒对细胞的致病力试验

按照常规方法消化sva的易感细胞，如实施例3中的bhk-21细胞、pk-15细胞、st细胞、ibrs-2等细胞，加入含10％胎牛血清的dmem完全培养基，将细胞铺于12孔板中，于37℃含有5％co2的培养箱中培养，待细胞单层长到80％～90％时备用。用dmem以10倍倍比稀释病毒液，将各稀释度(10^-5.0～10^-10.0)的病毒液分别加入细胞板中，每个稀释度4孔，放入37℃含有5％co2的培养箱中进行培养，观察4天，用reed-muench氏法测定病毒对bhk-21细胞等不同细胞的半数感染量(tcid50)。按照该法测定rsvv/fj-m-ovp1株在bhk-21等不同细胞上的病毒滴度，计算rsvv/fj-m-ovp1株的tcid50为10^-6.5/ml～10^-10.0/ml。

reed-muench计算方法是本领域的已有技术，现有文献“reed,l.j.andmuench,h.(1938)."asimplemethodofestimatingfiftypercentendpoints".theamericanjournalofhygiene27:493–497”中对此已经进行了详细地描述，该文献在此通过引用方式并入本申请用作参考。

5.2重组塞内卡病毒对猪的致病力试验

从非疫区筛选试验用猪9头，并经中和实验检测，svv中和抗体效价＜1：4。根据已经建立的svv/fj/001株对猪的攻毒模型的条件，将制备的rsvv/fj-m-ovp1株采用注射途径进行攻毒，攻毒剂量设立两个梯度，分别为2×10⁹tcid50，2×10¹⁰tcid50，同时设立svv/fj/001株细胞毒为对照，攻毒剂量为2×10⁹tcid50，2ml/头，连续观察13天，观察并记录记录发病情况，根据蹄部、鼻镜、口唇出现水泡等症状判定动物发病情况，并计分(5分制，判定标准参照口蹄疫判分标准制定，分数越高表明临床症状越严重)。攻毒结果显示，对照野生亲本毒svv/fj/001株攻毒后从第二天开始出现典型临床症状，蹄部出现水泡，之后有的在鼻镜上出现水泡。而重组塞内卡病毒rsvv/fj-m-ovp1株攻毒后，两个攻毒剂量组均未出现任何临床症状，结果见表1。

表1重组塞内卡病毒对猪致病力试验临床症状

实施例6

重组o型口蹄疫病毒vp1基因的塞内卡重组疫苗的制备和免疫试验

6.1疫苗制备

将获得的rsvv/fj-m-ovp1株按照实施例3的方法培养，将病毒按培养液量的1％接入已形成单层的易感细胞中，当病变达到80％以上时，收获含病毒的细胞培养液，经反复冻融后，-70℃保存备用。按照实施例5所述测定病毒含量，按照reed-muench法计算病毒的tcid50，结果每毫升病毒液不低于10^6.5tcid50。用终浓度为1.5mmol/l二乙烯亚胺(binaryethylenimine,bei)(sigma公司)，于30℃灭活36h，加入阻断剂硫代硫酸钠溶液，4℃过夜，保存备用。灭活抗原经安检后与isa206佐剂(法国seppic)以1：1比例乳化制备成水包油包水剂型疫苗，分装备用。

6.2疫苗免疫试验

将得到的安检合格的塞内卡重组病毒灭活疫苗免疫5头猪，同时设2头非免疫对照，测定其免疫效力。实验用猪购自非疫区，并经中和实验检测，sva中和抗体效价＜1：4；经国家口蹄疫参考实验室生产的fmd液相阻断elisa(lpb-elisa)检测o型抗体均＜1：4。于一免28d进行二免，并在免疫后7天、14天、21天、28天和42天采血、分离血清，sva进行中和抗体检测并统计检测结果，42d血清检测o型fmdv抗体，结果表明，该疫苗具有很好的免疫原性，能有效激发血清sva中和抗体(表2)，并能产生fmdv的特异性抗体，效价均≥64。

表2塞内卡重组疫苗免疫后sva中和抗体水平检测结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种重组o型口蹄疫病毒vp1基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗株及其制备方法和应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>655

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ttgaaagggggggctgggccctcatgcccagtccttcctttccccttccggggggtaaac60

cggctgtgtttgctagaggcacagaggagcaacatccaacctgcttttgtggggaacagt120

gcggctccaattcctgcgtcgccaaaggtgttagcgcacccaaacggcgcatctaccaat180

gctattggtgtggtctgcgagttctagcctactcgttttttcccctactcactcattcgt240

gttgtaactacaggatttggccctcgcacgggatgtgcgataaccgcaagattgactcaa300

gcgcggaaagcgttgtaaccacatgctgttagtccctttatggctgtgagatggctatcc360

acctcggatcactgaactggagctcgaccctccttagtaagggaaccgagaggccttcct420

gcaacaagctccgacacagagtccacgtgattgctaccaccatgagtacatggttctccc480

ctctcgacccaggacttctttttgaatatccacggctcgatccagagggtggggcatgat540

ccccctagcatagcgagctacagcgggaactgtagctaggccttagcgtgccttggatac600

tgcctgatagggcgacggcctagtcgtgtcggttctataggtagcacatacaaat655

<210>2

<211>693

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atgaccacttcgacgggcgagtcggctgaccccgtgactgccaccgttgagaattacggt60

ggcgagacacaggtccagaggcgccaccacacagacgtctcattcatattggacagattt120

gtgaaagtcacaccaaaagactcaataaatgtattggacctgatgcagaccccctcccac180

accctagtaggggcgctcctccgcactgccacttactatttcgctgatctagaggtggca240

gtgaaacacgagggggaccttacctgggtgccaaatggagcacctgaagcagccttggac300

aacaccaccaacccaacggcgtaccataaggcgccgcttactcggcttgcattgccctac360

acggcaccacaccgtgttttggccaccgtttacaacgggaactgcaaatacgccgggggc420

tcactgcccaacgtgagaggcgatctccaagtgctggctcagaaggcagcgaggccgctg480

cctacttctttcaactacggtgccatcaaagccactcgggtgacagaactgctgtaccgc540

atgaagagggccgagacgtactgtcctcggcccctcttggctgttcacccgagtgcggcc600

agacacaaacagaaaatagtggcgcctgtaaagcagtccttgaactttgatctgctcaag660

ttggcaggggacgtggagtccaaccctgggccc693

<210>3

<211>58

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gatgcaatcaggcgacgtcgagaccaaccctggccctatgaccacttcgacgggcgag58

<210>4

<211>60

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cccagcatgcttccctttcgcagctacaagcagaagatgctgatgcaatcaggcgacgtc60

<210>5

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

caggatcgggttgtcagaagcgggcccagggttggactccac42

<210>6

<211>57

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtcttgaaagggggggctgggcc57

<210>7

<211>55

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ataggtttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactatagga55

<210>8

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gggaagcatgctggggcaccaggcac26

<210>9

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gtggagtccaaccctgggcccgcttctgacaacccgatcctg42

<210>10

<211>55

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

ttttctagagcggccgctttttttttttttttttttttttttttttttttttttt55

<210>11

<211>56

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

gttctagcctactcgttttttcccctactcactcattcgtgttgtaactacaggat56

<210>12

<211>56

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

atcctgtagttacaacacgaatgagtgagtaggggaaaaaacgagtaggctagaac56