一种污水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法与流程

本发明涉及污水处理
技术领域：
，特别涉及一种污水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法。
背景技术：
：世界卫生组织和美国疾病与控制中心等组织一致将细菌“抗生素抗性”列为二十一世纪人类健康的最大威胁之一。抗生素抗性基因是细菌获得抗生素抗性的根本原因。在众多环境介质中，污水处理系统被证明是抗生素抗性基因重要储存库之一，同时也是抗生素抗性基因污染传播至环境的主要来源。在污水处理系统中，抗生素抗性基因相关研究多围绕活性污泥展开，鲜见研究关注污水游离态抗生素抗性基因(即脱离活性污泥细胞游离于污水中的抗生素抗性基因)。游离态抗生素抗性基因能够持久存在于污水中，无法被紫外消毒、膜滤和氯消毒等深度处理工艺彻底消除，且可水平转移至环境细菌和病原菌中。最终，游离态抗生素抗性基因会随污水厂出水扩散至环境，造成潜在生态环境和人类健康风险。要实现对污水厂中游离态抗生素抗性基因环境行为特征的全面解析，最大的难点在于构建游离态抗生素抗性基因的分离和定量检测方法。由于污水厂中游离态dna浓度极低，加之游离态dna分离的外界干扰因素(如污水中盐类、有机物等杂质)较为复杂，这给后续游离态抗生素抗性基因的定量分析带来了极大挑战。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种污水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法。该方法克服了污水厂中游离态抗生素抗性基因浓度低和干扰因素复杂的瓶颈，为污水厂中痕量新型污染物游离态抗生素抗性基因的时空分布与去除特性研究提供了灵敏、可靠的分析手段。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种污水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法，包括如下步骤：步骤1，将样本进行预处理，得到滤液；样本为污水和/或污泥混合液；步骤2，游离态dna的分离：步骤2-1，将所得滤液与乙酸铵水溶液颠倒混匀，然后加入无水乙醇颠倒混匀，静置；步骤2-2，离心后移除上清液，在沉淀中加入乙醇水溶液混匀，得到乙醇/沉淀混合液；步骤2-3，将乙醇/沉淀混合液离心后移除上清液，加入无菌无酶水，得到游离态dna；步骤3，以游离态dna为模板，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qpcr)对抗生素抗性基因和16srdna进行扩增，利用外标法检测游离态抗生素抗性基因的浓度。作为优选，步骤1中预处理为：将污泥混合液离心，保留上清液；采用滤膜过滤上清液和/或污水，得到滤液。作为优选，滤膜的孔径为0.2～0.3μm。优选地，滤膜的孔径为0.22μm。作为优选，步骤2-1中，滤液、乙酸铵水溶液与无水乙醇的体积比为(7～9):(3～5):(22～26)。优选地，步骤2-1中，滤液、乙酸铵水溶液与无水乙醇的体积比为2:1:6。作为优选，乙酸铵水溶液浓度为7～8m。优选地，乙酸铵水溶液浓度为7.5m。作为优选，无水乙醇为0～4℃预冷无水乙醇。优选地，无水乙醇为4℃预冷无水乙醇。作为优选，静置的温度为0～4℃，时间为50～70min。优选地，静置的温度为0℃，时间为1h。作为优选，离心的条件为0～4℃、13000～15000g、20～40min。优选地，离心的条件为4℃、14000g、30min。作为优选，步骤2-1中滤液与步骤2-2中乙醇水溶液的体积比(7～9):(1～3)。优选地，步骤2-1中滤液与步骤2-2中乙醇水溶液的体积比4:1。作为优选，乙醇水溶液的体积百分浓度为70％～80％。优选地，乙醇水溶液的体积百分浓度为70％。作为优选，步骤2-2具体为：离心后移除上清液，在沉淀中加入相当于总用量1/2的乙醇水溶液混匀，将所得乙醇/沉淀混合液从容器1转移至容器2中；将容器2中乙醇/沉淀混合液离心，移除上清液；再次向容器1中加入剩余的乙醇水溶液混匀，将所得乙醇/沉淀混合液从容器1转移至容器2中；乙醇水溶液的加入量为0.6～0.8ml/次。作为优选，容器1的体积为40～60ml。优选地，容器1的体积为50ml。作为优选，容器2体积为1.5～5ml。优选地，容器2体积为2ml。作为优选，容器1和容器2为离心管。作为优选，以ml/μl计，步骤2-1中滤液与步骤2-3中无菌无酶水的体积比为8：(50～100)。优选地，以ml/μl计，步骤2-1中滤液与步骤2-3中无菌无酶水的体积比为1：10。作为优选，抗生素抗性基因为sul1和sul2。作为优选，步骤3中扩增所用引物序列为：sul1上游引物核苷酸序列如seqidno：1所示；sul1下游引物核苷酸序列如seqidno：2所示；sul2上游引物核苷酸序列如seqidno：3所示；sul2下游引物核苷酸序列如seqidno：4所示；16srdna上游引物核苷酸序列如seqidno：5所示；16srdna下游引物核苷酸序列如seqidno：6所示。作为优选，qpcr的扩增条件为：50℃尿嘧啶-dna糖基化酶处理2min；95℃热启动2min；95℃变性15s，退火15s，72℃延伸1min，共40个循环；sul1和sul2的退火温度为60℃，16srdna的退火温度为55℃。作为优选，qpcr反应体系如下：试剂体积(μl)pcr预混液(2x)10正向引物(10μm)0.6反向引物(10μm)0.6dna模板(1ng/μl)2无菌无酶水6.8合计20。作为优选，外标法所用质粒标准品的制备中，pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸7min；pcr反应体系为：试剂体积(μl)taq聚合酶(5u/μl)0.1缓冲液(含20mmmg2+)2dntp(各2.5mm)1.6正向引物(10μm)0.4反向引物(10μm)0.4dna模板(1ng/μl)1无菌无酶水14.5合计20。在本发明中，外标法具体为：以抗生素抗性基因和16srdna的质粒标准品为模板，进行qpcr实验；根据质粒标准品拷贝数浓度和抗生素抗性基因或16srdna扩增荧光阈值循环数的对应关系，绘制抗生素抗性基因和16srdna的定量标准曲线；质粒标准品制备步骤包括：以污水中游离态dna为模板，采用普通pcr扩增目的基因；普通pcr产物经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下割取目的基因条带，采用凝胶纯化试剂盒进行纯化；将凝胶纯化的目的基因调节至合适浓度后，连接至质粒载体，并将其转化入感受态细胞；挑取阳性克隆转化子后，用质粒提取试剂盒抽提质粒标准品，并保存至冰箱；对照抗生素抗性基因和16srdna的定量标准曲线，根据游离态dna中抗生素抗性基因和16srdna的扩增荧光阈值，获取模板游离态dna中抗生素抗性基因和16srdna的拷贝数浓度，并进一步计算污水样品中游离态抗生素抗性基因的绝对浓度和相对浓度。在本发明中，抗生素抗性基因或16srdna质粒标准品的拷贝数浓度范围为102～108copies，梯度数为6个，梯度值为10倍。本发明提供了一种污水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法。该方法包括：将样本进行预处理，得到滤液；样本为污水和/或污泥混合液；将所得滤液与乙酸铵水溶液颠倒混匀，然后加入无水乙醇颠倒混匀，静置；离心后移除上清液，在沉淀中加入乙醇水溶液混匀，得到乙醇/沉淀混合液；将乙醇/沉淀混合液离心后移除上清液，加入无菌无酶水，得到游离态dna；以游离态dna为模板，采用qpcr对抗生素抗性基因和16srdna进行扩增，利用外标法检测游离态抗生素抗性基因的浓度。本发明具有的技术效果为：本发明明确了污水厂中低浓度游离态抗生素抗性基因的定量检测方法，联合乙酸铵-乙醇沉淀和qpcr测试等技术，克服了污水厂中游离态抗生素抗性基因浓度低和干扰因素复杂的瓶颈，为污水厂中痕量新型污染物游离态抗生素抗性基因的时空分布与去除特性研究提供了灵敏、可靠的分析手段。附图说明图116srdna、sul1和sul2的qpcr测试代表性定量标准曲线；图2是七座实际污水厂内进水和出水中游离态抗生素抗性基因的绝对浓度；图3是七座实际污水厂内进水和出水中游离态抗生素抗性基因的相对浓度；图4是七座实际污水厂内生化池水中游离态抗生素抗性基因的绝对浓度；图5是七座实际污水厂内生化池水中游离态抗生素抗性基因的相对浓度。具体实施方式本发明公开了一种污水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供了一种污水厂中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法，包括以下步骤：(1)样品预处理从实际污水厂取污泥混合液和污水样品。污泥混合液离心分离后，保留上清液。采用滤膜过滤上清液和污水，取滤液保存于冰箱。(2)游离态dna的分离①取步骤(1)中滤液，置于离心管a中。加入乙酸铵，颠倒混匀。加入预冷无水乙醇，再次颠倒混匀后，于冰上静置；②离心后，小心移除上清液。往离心管a加入预冷乙醇。轻微混匀后，将乙醇/沉淀混合液转移至新的离心管b中；③离心管b离心后，小心移除上清液。再次向离心管a加入预冷乙醇。轻微混匀后，将乙醇/沉淀混合液转移至离心管b中；④离心管b离心后，小心移除上清液。加入适量体积无菌无酶水，即获得浓缩的游离态dna溶液。(3)游离态抗生素抗性基因的定量检测①以游离态dna为模板，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qpcr)对实际污水厂中抗生素抗性基因和16srdna进行扩增；②以抗生素抗性基因和16srdna的质粒标准品为模板，进行qpcr实验。根据质粒标准品拷贝数浓度和抗生素抗性基因或16srdna扩增荧光阈值循环数的对应关系，绘制抗生素抗性基因和16srdna的定量标准曲线；备注说明：质粒标准品制备步骤包括以污水中游离态dna为模板，采用普通pcr扩增目的基因；普通pcr产物经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下割取目的基因条带，采用凝胶纯化试剂盒进一步纯化；将凝胶纯化的目的基因调节至合适浓度后，连接至质粒载体，并将其转化入感受态细胞。挑取阳性克隆转化子后，用质粒提取试剂盒抽提质粒标准品，并保存至冰箱。③对照抗生素抗性基因和16srdna的定量标准曲线，根据游离态dna中抗生素抗性基因和16srdna的扩增荧光阈值，获取模板游离态dna中抗生素抗性基因和16srdna的拷贝数浓度，并进一步计算污水样品中游离态抗生素抗性基因的绝对浓度和相对浓度。作为优选，所述步骤(1)中污泥混合液取自于实际污水厂的膜生物反应池或好氧池；污水取自于实际污水厂的进水和出水；作为优选，所述步骤(1)中污水/污泥混合液置于灭菌棕色玻璃瓶中，并采用冰袋于2h内运输至实验室；作为优选，所述步骤(1)中污泥混合液、进水和出水体积为10ml；作为优选，所述步骤(1)中滤膜孔径为0.22μm；作为优选，所述步骤(1)中冰箱温度设置为–20℃；作为优选，所述步骤(1)中离心条件为：5000g、4℃、5min。作为优选，所述步骤(2)-①中滤液体积为8ml；作为优选，所述步骤(2)-①中离心管a体积为50ml；作为优选，所述步骤(2)-①中乙酸铵浓度为7.5m；作为优选，所述步骤(2)-①中乙酸铵体积为4ml；作为优选，所述步骤(2)-①中无水乙醇体积为24ml；作为优选，所述步骤(2)-①中无水乙醇预冷温度为4℃；作为优选，所述步骤(2)-①中冰浴时间为1h；作为优选，所述步骤(2)-②中离心条件为：4℃、14000g、30min；作为优选，所述步骤(2)-②和(2)-③中乙醇预冷温度为4℃，乙醇浓度为70％；作为优选，所述步骤(2)-②和(2)-③中离心管b体积为2ml；作为优选，所述步骤(2)-③和(2)-④中离心条件为：4℃、14000g、30min；作为优选，所述步骤(2)-④中无菌无酶水体积为80μl。作为优选，所述步骤(3)-①中目的抗生素抗性基因类型为sul1、sul2；作为优选，所述步骤(3)-①中qpcr测试中引物序列为：sul1上游引物核苷酸序列：cgcaccggaaacatcgctgcac；sul1下游引物核苷酸序列：tgaagttccgccgcaaggctcg；sul2上游引物核苷酸序列：tccggtggaggccggtatctgg；sul2下游引物核苷酸序列：cgggaatgccatctgccttgag；16srdna上游引物核苷酸序列：actcctacgggaggcagcag；16srdna下游引物核苷酸引物序列：attaccgcggctgctgg；作为优选，所述步骤(3)-①中qpcr测试条件为：50℃尿嘧啶-dna糖基化酶处理2min；95℃dual-locktmtaqdna聚合酶热启动2min；95℃变性15s，退火15s，72℃延伸1min，共40个循环。sul1和sul2的退火温度为60℃，16srdna的退火温度为55℃；作为优选，所述步骤(3)-①中qpcr测试反应体系体积为20μl，具体组成如下：作为优选，所述步骤(3)-②中抗生素抗性基因或16srdna质粒标准品的拷贝数浓度范围为102～108copies，梯度数为6个，梯度值为10倍。作为优选，所述备注说明中普通pcr扩增目的基因包括sul1、sul2和16srdna；所述凝胶纯化试剂盒为takaraminibestagarosegeldnaextractionkit；所述质粒载体为pmd18-t；所述感受态细胞为大肠杆菌jm109；所述质粒提取试剂盒为minibestplasmidpurificationkit；所述冰箱保存温度为-20℃。作为优选，所述步骤(3)-②中质粒标准品拷贝数浓度的计算公式为：cc＝cm×na/[(lpmd18-t+lx)×m0]，式中cc为质粒标准品拷贝数浓度，copies/μl；cm为质粒标准品质量浓度，ng/μl；lpmd18-t为pmd18-t质粒载体长度，2692bp；lx为插入的目的基因长度，bp；m0为每对碱基的平均分子量，660g/m；na为阿伏伽德罗常数，6.02×1023。作为优选，所述备注说明中普通pcr扩增目的基因(sul1、sul2和16rdna)采用的引物序列参考步骤(3)。作为优选，所述备注说明中普通pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸7min。作为优选，所述备注说明中普通pcr反应体系体积采用20μl，具体组成如下：作为优选，所述步骤(3)-③中污水样品中游离态抗生素抗性基因绝对浓度的计算公式为：游离态抗生素抗性基因绝对浓度＝游离态抗生素抗性基因的拷贝数浓度×样品浓缩倍数/游离态dna回收率。作为优选，样品浓缩倍数的计算公式为：样品浓缩倍数＝滤液体积/无菌无酶水体积，具体参数参见权利要求步骤(2)。游离态dna回收率的计算公式为：游离态dna回收率＝质粒标准品的实际质量浓度/质粒标准品的理论质量浓度。其中，质粒标准品的理论质量浓度为100或1ng/μl；质粒标准品的实际质量浓度可采用质粒标准品取代权利要求1步骤(2)中滤液后按照该步骤求得。作为优选，所述步骤(3)-③中污水样品中游离态抗生素抗性基因相对浓度的计算公式为：游离态抗生素抗性基因相对浓度＝游离态抗生素抗性基因的拷贝数浓度/16srdna拷贝数浓度。本发明提供的污水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1实际污水厂内污水厂中游离态抗生素抗性基因的定量检测步骤一：样品预处理从江苏省无锡市七座实际污水厂的进水和出水点取污水样品，置于灭菌棕色玻璃瓶中，并采用冰盒于2h内运输至实验室。采用0.22μm滤膜过滤污水，取滤液保存于–20℃冰箱。步骤二：游离态dna的分离与检测(1)取步骤一中8ml滤液，置于50ml离心管中。加入4ml7.5m乙酸铵，颠倒混匀。加入24ml4℃预冷无水乙醇，再次颠倒混匀后，于冰上静置1h；(2)于4℃、14,000g、30min离心后，小心移除上清液。往离心管加入1ml4℃预冷70％乙醇。轻微混匀后，将乙醇/沉淀混合液转移至新的2ml离心管中；(3)于4℃、14,000g、30min离心后，小心移除上清液。再次向步骤(1)中50ml离心管加入1ml4℃预冷70％乙醇。轻微混匀后，再次将乙醇/沉淀混合液彻底转移至步骤(2)的2ml离心管中；(4)于4℃、14,000g、30min离心后，小心移除上清液。加入80μl无菌无酶水，即获得浓缩的游离态dna溶液；步骤三：游离态抗生素抗性基因的定量检测(1)以步骤二中游离态dna为模板，采用qpcr测试对实际污水厂中抗生素抗性基因(sul1、sul2)和16srdna进行扩增；qpcr测试中引物序列为：sul1上游引物核苷酸序列为cgcaccggaaacatcgctgcac；sul1下游引物核苷酸序列为tgaagttccgccgcaaggctcg；sul2上游引物核苷酸序列为tccggtggaggccggtatctgg；sul2下游引物核苷酸序列为cgggaatgccatctgccttgag；16srdna上游引物核苷酸序列为actcctacgggaggcagcag；16srdna下游引物核苷酸引物序列为attaccgcggctgctgg。qpcr测试条件为：50℃尿嘧啶-dna糖基化酶处理2min；95℃dual-locktmtaqdna聚合酶热启动2min；95℃变性15s，退火15s，72℃延伸1min，共40个循环。sul1和sul2的退火温度为60℃，16srdna的退火温度为55℃。qpcr测试反应体系体积为20μl，具体组成如下：表1qpcr测试反应体系(2)制备抗生素抗性基因(sul1和sul2)和16srdna质粒标准品，并计算质粒标准品的拷贝数浓度。将已知拷贝数的质粒标准品依次进行10倍梯度稀释，选取浓度范围位于108～102copies六个梯度的质粒标准品进行qpcr测试。根据质粒标准品拷贝数浓度和抗生素抗性基因或16srdna扩增荧光阈值循环数的对应关系，绘制抗生素抗性基因和16srdna的定量标准曲线，代表性定量标准曲线如图1所示；备注说明：①质粒标准品拷贝数浓度的计算公式为：cc＝cm×na/[(lpmd18-t+lx)×m0]，式中cc为质粒标准品拷贝数浓度，copies/μl；cm为质粒标准品质量浓度，ng/μl；lpmd18-t为pmd18-t质粒载体长度，2692bp；lx为插入的目的基因长度，bp；m0为每对碱基的平均分子量，660g/m；na为阿伏伽德罗常数，6.02×1023。②质粒标准品制备步骤包括：以步骤二中污水厂中游离态dna为模板，采用普通pcr扩增目的基因(sul1、sul2和16srdna)；普通pcr产物经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下割取目的基因条带，采用凝胶纯化试剂盒(takaraminibestagarosegeldnaextractionkit)进行纯化；将凝胶纯化的目的基因调节至合适浓度后，连接至质粒载体(pmd18-t)，并将其转化入感受态细胞(大肠杆菌jm109)。挑取阳性克隆转化子后，用质粒提取试剂盒抽(minibestplasmidpurificationkit)提质粒标准品，并保存至-20℃冰箱。③质粒标准品制备中，普通pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸7min。④质粒标准品制备中，普通pcr反应体系体积采用20μl，具体组成如下：表2普通pcr反应体系体积试剂体积(μl)extaq(5u/μl)0.110×extaqbuffer(含20mmmg2+)2dntpmixture(各2.5mm)1.6正向引物(10μm)0.4反向引物(10μm)0.4dna模板(1ng/μl)1无菌无酶水14.5合计20(3)对照抗生素抗性基因和16srdna的定量标准曲线，根据游离态dna中抗生素抗性基因和16srdna的扩增荧光阈值，获取模板游离态dna中抗生素抗性基因和16srdna的拷贝数浓度。最终，根据公式“游离态抗生素抗性基因绝对浓度＝游离态抗生素抗性基因的拷贝数浓度×样品浓缩倍数/游离态dna回收率”计算出样品中游离态抗生素抗性基因的绝对浓度(式中，样品浓缩倍数的计算公式为：样品浓缩倍数＝滤液体积/无菌无酶水体积，即8ml/80μl＝100倍。游离态dna回收率的计算公式为：游离态dna回收率＝质粒标准品的实际质量浓度/质粒标准品的理论质量浓度，其中质粒标准品的理论质量浓度为10ng/ml；质粒标准品的实际质量浓度采用sul1质粒标准品取代步骤二中滤液后按照该步骤求得。根据公式“游离态抗生素抗性基因相对浓度＝游离态抗生素抗性基因的拷贝数浓度/16srdna拷贝数浓度”计算出样品中游离态抗生素抗性基因的相对浓度。检测结果如图2和图3所示。实际污水厂内进水中游离态sul1和sul2的绝对浓度均值范围分别为：2.8×102～2.3×105copies/ml、未检出～3.3×104copies/ml；游离态sul1和sul2的相对浓度均值范围分别为：0.003～0.519copies/copies16srdna、0.003～0.100copies/copies16srdna。实际污水厂内出水中游离态sul1和sul2的绝对浓度均值范围分别为：1.3×103～9.5×104copies/ml、未检出～2.8×104copies/ml；游离态sul1和sul2的相对浓度均值范围分别为：0.109～0.619copies/copies16srdna、未检出～1.402copies/copies16srdna。实施例2实际污水厂内污泥混合液中游离态抗生素抗性基因的定量检测本实施例与实施例1不同之处在于：样品为源于生化池(膜生物反应池或好氧池)的污泥混合液。故需将污泥混合液离心(5,000g、4℃、5min)分离后，保留上清液；采用0.22μm滤膜过滤上清液，最终获得游离态抗生素抗性基因定量检测所需的滤液样品。其他操作与实施例1相同。最后得到实际污水厂内污泥混合液中游离态sul1和sul2的绝对浓度均值范围分别为：1.2×103～1.4×107copies/ml、2.1×102～4.2×107copies/ml；游离态sul1和sul2的相对浓度均值范围分别为：0.043～3.598copies/copies16srdna、0.039～0.782copies/copies16srdna。对比例1本对比例与实施例1不同之处在于：在游离态dna的分离步骤(2)中，直接往8ml滤液中加入16ml4℃预冷无水乙醇。此外，代表性地选取了sul1质粒标准品取代实施例1步骤二中滤液。其他操作与实施例1相同。最后得到实际污水厂内污泥混合液中游离态sul1的绝对浓度均值范围：未检出～5.4×105copies/ml。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>南华大学<120>一种污水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法<130>mp2002408<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgcaccggaaacatcgctgcac22<210>2<211>22<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tgaagttccgccgcaaggctcg22<210>3<211>22<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tccggtggaggccggtatctgg22<210>4<211>22<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cgggaatgccatctgccttgag22<210>5<211>20<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5actcctacgggaggcagcag20<210>6<211>17<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6attaccgcggctgctgg17当前第1页12