一种基于双扩增技术检测新型冠状病毒（2019-nCoV）的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于双扩增(rna恒温扩增+多生物素信号放大)技术检测呼新型冠状病毒(2019-ncov)核酸的试剂盒及其应用。

背景技术：

冠状病毒为不分节段的单股正链rna病毒，属于巢病毒目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridae)正冠状病毒亚科(orthocoronavirinae)，根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ和δ四个属。已知感染人的冠状病毒有6种，包括α属的229e和nl63，β属的oc43和hku1、中东呼吸综合征相关冠状病毒(mersr-cov)和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(sarsr-cov)。新型冠状病毒2019-ncov为一种属于β属的新型冠状病毒。目前对其理化特性认知相对较少，相关特性认知多来自对sars-cov和mers-cov的研究。

截至目前搜集到的病例，显示本次疫情以发热、乏力、干咳为主要表现。鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见。约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。值得注意的是重症、危重症患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。部分患者起病症状轻微，可无发热，多在1周后恢复。多数患者预后良好，少数患者病情危重，甚至死亡。

鉴于对病毒的来源、感染后排毒时间、发病机制等还不明确，且目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，为更好地控制此次疫情，减少和降低疾病传播几率，进一步加强对病例的早期发现、隔离和治疗，最大可能的减少医院感染发生，是当前控制传染源、降低发病率的关键，国家卫生健康委和国家中医药管理局发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》在确诊病例符合疑似病例标准的基础上，强调了对核酸的检测。随后1月11日和12日，国内外专家与世界卫生组织分享新型冠状病毒2019-ncov全基因组序列。基于国内外专家在gisaid平台上发布的新型冠状病毒2019-ncov基因组序列信息，进行相关引物和探针的设计制备新型冠状病毒2019-ncov核酸快速检测试剂盒，以辅助呼吸道感染性疾病新型冠状病毒的早期鉴别诊断，是十分必要的。目前新型冠状病毒2019-ncov的检测主要为荧光pcr法，可直接检测核酸，灵敏度高、特异性强，在缩短检测窗口期、提高病原体检出率方面具有相当的优势。但是pcr的方法对硬件设施有一定的要求，要有专门的pcr诊断实验室、昂贵的实验仪器，不利于在一些社区及偏远医院的普及应用。因此，人们仍然需要寻找一种操作简单、快速、价格低廉的2019-ncov的诊断方法。

技术实现要素：

鉴于以上所述疫情防控对于病原体快速检测的需求，本发明的目的在于提供一种基于rna恒温扩增-多生物素信号放大技术检测新型冠状病毒(2019-ncov)核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和t7rna聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的rna产物加入到包被有包被探针的微孔中进行杂交，同时加入的还有该包被探针对应的特异探针及放大探针。其中包被探针可以和每个指标的ces系列探针一端序列互补配对结合，ces系列探针的另一端可结合到rna产物上，使rna产物锚定到微孔中；每个指标的les系列探针的一端可结合到rna产物上，另一端与放大探针结合，实现信号放大过程。标记有多生物素的放大探针随后与链霉亲和素-hrp酶联物结合，最终形成包被探针-特异探针-rna扩增产物-特异探针-放大探针-链霉亲和素-hrp酶联物复合体，最后加入hrp酶化学发光底物，在化学发光仪上进行检测。实现病原体核酸的检测。因此，本发明没有复杂的rna提取过程，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，基于rna分子易降解的特点，本发明在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，对新型冠状病毒(2019-ncov)能做到快速高效检测，对疫情的蔓延和防治有极大的帮助。

为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：

第一方面，提供一种基于rna恒温扩增-多生物素信号放大技术检测新型冠状病毒(2019-ncov)核酸的试剂盒，包括：

1)扩增反应液：含40mmtris-hcl(ph8.0)，12mmmgcl2，70mmkcl，15％dmso，5mmdtt，每种dntp各1mm，每种ntp各2mm，扩增引物各0.2μm，其中扩增引物包括三对：新型冠状病毒(2019-ncov)orf1ab基因、e基因以及内质控(人18srrna)各一对扩增引物，具体的：

(1)新型冠状病毒(2019-ncov)orf1ab基因的一段保守区序列的扩增引物：

orf1ab-r引物：5’taatacgactcactatagggagagtctgaacaactggtgtaag3’(下划线处为t7启动子序列)；

orf1ab-f引物：5’ggttagatgatgatagtcaa3’；

(2)新型冠状病毒(2019-ncov)e基因的一段保守区序列的扩增引物：

e-r引物：5’taatacgactcactatagggagaaacaatattgcagcagtacg3’(下划线处为t7启动子序列)；

e-f引物：5’cgtttcggaagagacaggta3’；

(3)内参基因(人18srrna一段保守区序列)的扩增引物：

内参-r引物：5’taatacgactcactatagggagacaccagagacactcagctaagagca3’(下划线处为t7启动子序列)；

内参-f引物：5’cagcagccgcggtaattc3’；

本发明同时设计了新型冠状病毒(2019-ncov)orf1ab基因和e基因的扩增引物，任一基因检测阳性均证明该病毒检测阳性，双倍提升了该病毒的检测效率和灵敏性。本发明设计的各对引物r引物5’端都引入了t7rna聚合酶启动子序列。

2)扩增酶：包含三种，逆转录酶(如amv或m-mlv)、t7rna聚合酶和rnaseh；

3)细胞裂解液：购至美国signosis公司，货号cl-0001，可以裂解细胞，释放核酸；

4)放大探针：一种标有生物素的核酸序列，该探针可以和特异探针的les系列的一端结合，具体序列(5’-3’)为:agaaggcgtccgtctttgaggc-biotin-acccgatggataggtcggtgaa-biotin-taagcatcgtgccctttcgcag-biotin-accacgttcgcgttctcacatg；

5)特异探针：每个指标特异探针有两种，分别为ces系列和les系列，其中ces系列和les系列又可以设计多条，具体如下：

(1)新型冠状病毒(2019-ncov)orf1ab基因特异探针序列：

orf1ab-les1:5’cagacaactactattcaattttcatgtgagaacgcgaacgtggt3’；

orf1ab-les2:5’acaattgttgaggttcaattttcatgtgagaacgcgaacgtggt3’；

orf1ab-les3:5’cctcaattagagatggaattttcatgtgagaacgcgaacgtggt3’；

orf1ab-ces1:5’caaactgttggtcaacaattttctgtacgtatgtatgt3’；

orf1ab-ces2:5’gacggcagtgaggacaatttttctgtacgtatgtatgt3’；

(2)新型冠状病毒(2019-ncov)e基因特异探针序列：

e-les1：5’tcgtggtattcttgctagttttcatgtgagaacgcgaacgtggt3’；

e-les2：5’ttacactagccatccttattttcatgtgagaacgcgaacgtggt3’；

e-les3：5’ctgcgcttcgattgtgtgttttcatgtgagaacgcgaacgtggt3’；

e-ces1：5’cgttaatagttaatagcgttttctgtacgtatgtatgt3’；

e-ces2：5’tacttctttttcttgcttttttctgtacgtatgtatgt3’；

(3)人内参基因特异探针序列：

内参les1：5’aaagctcgtagttggatctttttcatgtgagaacgcgaacgtggt3’；

内参les2：5’ttgggagcgggcgggcggtttttcatgtgagaacgcgaacgtggt3’；

内参les3：5’tccgccgcgaggcgagcctttttcatgtgagaacgcgaacgtggt3’；

内参les4：5’accgcccgtccccgcccctttttcatgtgagaacgcgaacgtggt3’；

内参ces1：5’agctccaatagcgtatatttttctgtacgtatgtatgt3’；

内参ces2：5’taaagttgctgcagttaattttctgtacgtatgtatgt3’；

6)微孔板：每个微孔中包被包被探针，该包被探针可以和每个指标的ces系列探针一端序列互补配对结合，具体序列(5’-3’)为：5’acatacatacgtacag3’；

7)hrp-链霉亲和素酶联物：标记有链霉亲和素的hrp酶联物，该酶联物可以和放大探针上生物素结合；

8)配制杂交液、洗液a(5×)、洗液b(5×)、封闭液、底物稀释液，杂交液：含0.1％sds的5×ssc；洗液a(5×)：含0.5％sds的5×ssc；洗液b(5×)：含0.5％sds的5×pbs；封闭液：含0.5％bsa、1×pbs；底物稀释液：50mmph8.5tris-hcl；

9)底物：鲁米诺化学发光底物(购至thermofisher，货号37075)，遇到hrp酶催化后能够产生化学发光信号，被仪器检测到。

本发明提供利用上述基于rna恒温扩增-多生物素信号放大技术检测新型冠状病毒(2019-ncov)核酸的试剂盒检测新型冠状病毒(2019-ncov)核酸的方法，包括如下步骤：

(1)rna恒温扩增

本发明检测指标有3个：新型冠状病毒(2019-ncov)的orf1ab基因、e基因和人内参基因。针对每个指标设计一对(f/r引物)扩增引物，其中r引物5’端带有t7rna聚合酶启动子。本发明在同一扩增管内实现各个指标核酸的扩增，具体如下：扩增时，在带有t7启动子的r引物和逆转录酶的作用下，将待测rna转化为rna:cdna杂合体；扩增酶中的rnaseh消化rna:cdna中的rna，得到单链cdna；在f引物和反转录酶的dna聚合酶功能的作用下合成第二链，形成带有t7启动子的双链dna；带有t7启动子的双链dna在t7rna聚合酶的作用下转录生成rna分子产物。转录的rna分子产物可以进入循环扩增过程，首先f引物会结合转录的rna分子产物，在逆转录酶的作用下将转录的rna转化为rna:cdna杂合体；扩增酶中的rnaseh消化rna:cdna中的rna，得到单链cdna；接着r引物会结合到单链cdna上，在反转录酶的dna聚合酶功能的作用下合成第二链，再次富集合成更多的带有t7启动子的双链dna分子，为t7rna聚合酶提供更多的转录模板，进而在t7rna聚合酶的作用下转录生成大量的rna分子产物(如图1)。

本发明设计人内参基因检测的目的是为了监测样本采集的有效性、扩增体系的有效性。当样本采集合格时样本中一定会含有人脱落细胞，在检测时一定会被检测到，样本检测阴性时内参应该为阳性，否则整个检测需要重新采样进行重测。

(2)多生物素信号放大

a，设计特异探针、放大探针和包被探针

特异探针：每个指标特异探针包括在两种：ces系列和les系列，每种探针可以设计多条。其中ces探针包含两个部分，一端可以和扩增的rna产物特异性结合，另一端可以和包被在微孔板中的包被探针集合，起到固定扩增产物rna的作用，这两个部分用4～5个t链接。每条les探针也包含两个部分，一端可以和扩增的rna产物特异性结合，另一端可以和放大探针结合，起到链接放大探针的作用，这两个部分用4～5个t链接。

放大探针：放大探针为含有多个生物素的探针，该探针可以和特异探针les的一端结合，探针上的生物素可以和hrp-链霉亲和素酶联物结合。

包被探针：包被探针被固定在微孔板中，可以和特异探针ces的一端结合，起到固定的作用。

所诉特异探针在设计时必须要求同种指标不同探针之间无交叉，ces系列同放大探针以及包被探针无交叉，以保证检测的特异性。

所诉特异探针的ces系列和les系列设计多条的目的是为了提高多生物素放大步骤的灵敏度，从而增加检测体系的灵敏度。

b，检测结果判断

扩增检测时同时设置阴性对照，即在检测样本的同时也扩增阴性质控物(细胞裂解液，购至美国signosis公司，货号cl-0001)。每管扩增产物会被均分到四个微孔板微孔中，其中orf1ab微孔在杂交时会加入orf1ab特异探针；e微孔在杂交时会加入e特异探针；内质控微孔在杂交时会加入内参特异探针。杂交洗涤后加入化学发光底物，并进行化学发光值测定，对样本检测指标的比值r进行计算，其中r＝待测样本检测指标相对光单位(rlu)/(5×阴性质控物检测指标相对光单位(rlu)值)；根据比值r对样本进行定性判断，比值r大于1.0则判断为阳性，小于等于1.0则为阴性。

结合上述原理，对本发明上述方法的工作过程介绍如下：

(1)核酸提取

采集疑似新型冠状病毒(2019-ncov)患者的咽拭子样本，使用细胞裂解液裂解的方法释放病毒rna分子。

(2)rna恒温扩增

向17μl的含有新型冠状病毒(2019-ncov)和内参引物的扩增反应液中加入2μl核酸提取物，95℃加热两分钟，42℃预热2分钟，加入1μl扩增酶，42℃恒温扩增1小时。待测样本中若有新型冠状病毒(2019-ncov)核酸，扩增时会对指标rna分子进行大量扩增富集。

(3)多生物素信号放大

a，将rna恒温扩增产物与特异探针(包括ces系列探针与les系列探针)、放大探针及杂交液同时加入到微孔板中，53℃恒温孵育1小时。

扩增出的rna分子与特异探针(包括ces系列探针与les系列探针)互补配对结合。ces系列探针一端同rna分子杂交互补配对，另一端同微孔板中的包被探针结合，可以将rna分子固定在微孔板中；les系列探针一端同rna分子杂交互补配对，另一端可以与放大探针互补配对，形成ces探针-rna分子-les探针-放大探针复合物，该复合物被固定在微孔板上(如图2)。

b，用洗液a洗去未结合于微孔板上的rna分子、特异探针和放大探针。

c，加入封闭液，室温封闭1～2分钟，封闭非特异性位点。

d，将hrp-链霉亲和素酶联物加入微孔板孵育，该酶联物可以和放大探针上的生物素结合，最终形成ces探针-rna分子-les探针-放大探针-hrp-链霉亲和素酶联物，并被固定在微孔板上。

e，用洗液b洗去游离的hrp-链霉亲和素酶联物。

f，按照底物a:底物b:底物稀释液＝1:1:8的比例配置底物，向每个微孔加入底物，并进行化学发光值测定。

g，计算待测样本各个标的比值r。

r＝待测样本检测指标相对光单位(rlu)/(5×阴性质控物检测指标相对光单位(rlu)值)。

比值r大于1.0则判断为阳性，小于等于1.0则为阴性。

第二方面，提供上述基于rna恒温扩增-多生物素信号放大技术检测新型冠状病毒(2019-ncov)的试剂盒在制备新型冠状病毒(2019-ncov)检测试剂中的应用。

本发明和现有技术相比较，具有如下有益效果：

1、本发明通过rna恒温扩增的方法在同一管内能够同时扩增新型冠状病毒(2019-ncov)orf1ab基因、e基因和内参基因三种指标，所扩增出的核酸产物为rna，rna在自然环境中容易降解，相比较于pcr的方法扩增出dna更容易起到防止污染的效果。rna恒温扩增是在42℃环境中进行，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，最大限度的降低了实验仪器的要求。

2、本发明在设计引物时经过多轮测试，保证了各单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰，整体扩增效果好。

3、本发明在设计时引入的特异探针ces系列和特异探针les系列有桥分子成分的作用，两种探针成功的将放大探针和rna核酸扩增片段串联结合到一块，实现指标rna核酸片段的特异检测。正是这种两套探针的使用，使得其中任何一套探针和指标核酸扩增片段杂交失败，都不能够被成功的固定在微孔板上，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高检测的灵敏度。本发明试剂盒对新型冠状病毒(2019-ncov)orf1ab和e基因rna拷贝的最低检测限为100拷贝/ml。本发明试剂与参比试剂对551例临床样本测定结果进行比较，通过计数资料的χ²检验表明两种方法的检测结果无差别，阳性符合率、阴性符合率、总符合率都在95％以上，一致性kappa值在0.75以上，说明本发明试剂与参比试剂符合性、一致性良好，而且与临床确诊/排除结果符合性达到100％、一致性系数kappa(k)为1。

附图说明

图1rna恒温扩增原理图；

图2多生物素信号放大原理图；

图396孔微孔板布板示意图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。实施例中所用的化学发光检测仪器为厦门天众达科技股份有限公司的化学发光免疫分析仪，型号tzd-cl-200g。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版(newyork:coldspringharborlaboratorypress,2005)中所述的条件进行。

【实施例1】灵敏度测试

选取已知浓度的含有2019-ncov靶基因的假病毒，进行10倍浓度梯度稀释，每个梯度的稀释液单独重复3份，将具有100％阳性检出率的最低稀释度浓度作为估计检测限，估计检测限确定后，将2019-ncov假病毒稀释到估计检测限浓度值附近，并用试剂盒进行检测，每个浓度检测20次，以对最低检测限浓度进行进一步精确确定(选阳性率在95％以上的稀释度作为本试剂盒检测限灵敏度)。

表12019-ncov假病毒实验结果-估计检测限的确定

表22019-ncov假病毒实验结果-检测限的确定

以上结果显示，本产品的灵敏度为1×10²copies/ml。

【实施例2】特异性验证

与2019新型冠状病毒种属相近或引起症状相似的其他病原体(如季节性甲型h1n1流感病毒，新型甲型h1n1(2009)流感病毒，甲型流感h3n2，h5n1，h7n9，乙型流感yamagata，乙型流感victoria，呼吸道合抱病毒a型，呼吸道合抱病毒b型，副流感i型，副流感ii型，副流感iii型，鼻病毒a、b、c组，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，肠道病毒a、b、c、d型，人间质肺病毒(人偏肺病毒)，eb病毒，麻疹病毒，人巨细胞病毒，轮状病毒，诺如病毒，腮腺炎病毒，水痘-带状疱疹病毒，肺炎支原体，肺炎衣原体，军团菌，百日咳杆菌，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，化脓性链球菌，肺炎克雷伯杆菌，结核分枝杆菌，烟曲霉，白色念珠菌，光滑念珠菌，新生隐球菌，冠状病毒(hku1，oc43，nl63，229e)，mers冠状病毒)进行了交叉反应测试，以验证试剂盒检测的特异性，结果如下：

表3其他病原微生物的交叉反应验证数据

结论：从以上数据可以看出，本试剂盒对其余微生物的检测结果都为阴性，证明该试剂盒与其他微生物之间没有交叉反应，体现试剂盒检测病原体的特异性强。

【实施例3】临床样本的验证

1、本发明试剂与参比试剂检测结果分析

在临床单位应用本发明试剂和参比试剂共测定样本551例，其中咽拭子样本498例，痰液样本153例，样本按照本发明试剂盒和参比试剂说明书进行检测，结果如下：

表4本发明试剂和参比试剂检测结果(四格表)

阳性符合率/临床灵敏度：213/(213+0)×100％＝100％

阴性符合率/临床特异性：337/(1+337)×100％＝99.70％

总符合率：(213+337)/(213+1+0+337)×100％＝99.82％

一致性系数kappa(k)值计算＝0.99(kappa≥0.75表明两者一致性良好，0.75>kappa≥0.4表明一致性一般，kappa<0.4则表明二者一致性较差)，本试验中kappa值＝0.99，大于0.75，可认为二者一致性良好。

不一致的样本医院诊断结果为“新型冠状病毒肺炎，ct检测为两肺感染，考虑病毒性肺炎”，即医院诊断结果为新型肺炎确诊病例，本试剂盒检测结果和医院诊断结果一致。

2、本发明试剂检测结果与临床确诊/排除结果比较分析

临床验证以《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》、《新型冠状病毒感染的肺炎病例监测方案(第二版)》推荐方法得到的确诊/排除结果做比对，在临床试验中共入组有“临床确诊/排除”结果的病例数为531例，将本发明试剂盒试剂检测结果与临床确诊/排除结果进行统计分析如下：

表5本发明试剂检测结果和临床确诊/排除结果(四格表)

临床灵敏度：203/(203+0)×100％＝100％

临床特异性：328/(0+328)×100％＝100％

总符合率：(201+328)/(201+0+0+328)×100％＝100％

一致性系数(kappa≥0.75表明两者一致性良好，0.75>kappa≥0.4表明一致性一般，kappa<0.4则表明二者一致性较差)。本试验中kappa值＝1，大于0.75，可认为二者结果一致。

由上述结果可知，对本发明试剂与参比试剂对临床样本测定结果进行比较，通过计数资料的χ2检验表明两种方法的检测结果无差别，阳性符合率、阴性符合率、总符合率都在95％以上，一致性kappa值在0.75以上，说明本发明试剂与参比试剂符合性、一致性良好，与临床确诊/排除结果符合性、一致性良好。因此，本发明试剂盒具有良好的临床应用性能。

序列表

<110>武汉中帜生物科技股份有限公司

<120>一种基于双扩增技术检测新型冠状病毒（2019-ncov）的试剂盒及其应用

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