高效抑菌斑节对虾抗脂多糖因子LBD区突变体及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其涉及高效抑菌斑节对虾抗脂多糖因子lbd区突变体及其应用。

背景技术：

斑节对虾是东南亚水产养殖的常见品种，但近年来存在频受弧菌感染的情况，因此，急需找到有效的抗弧菌制剂。抗菌肽具有抗菌活性高、稳定性好且不易产生耐药性的优点，可能成为抗弧菌感染的新的选择。抗脂多糖因子(alf)是一种重要的甲壳类动物抗菌肽，具有高效抑菌活性。alf含有一个脂多糖结合区(lbd)，由20个氨基酸残基和一对半胱氨酸组成，该区域对alf发挥抗菌活性具有重要作用。本实验室前期研究中，发现了一种新型alf(alfpm11)，并通过实验证实其lbd区具有高效抑菌活性，能够杀灭多种水生革兰氏阳性、阴性细菌。然而，alfpm11-lbd对弧菌、嗜水气单胞菌的抑制能力较差(最小抑菌浓度>128μm)。如果能够通过分子改造提高alfpm11-lbd对水生病原菌的抑制能力，将具有十分重要的应用价值。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高效抑菌斑节对虾抗脂多糖因子lbd区突变体及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

为了进一步提高alfpm11-lbd的抗菌活性，本发明对其进行了分子改造。根据alf的lbd区具有正电荷氨基酸与疏水氨基酸(主要是芳香族氨基酸)交替出现的规律，推测可能对抑菌活性有重要影响。本发明对野生型进行改造，增加正电荷氨基酸以及疏水氨基酸的个数，并使其交替出现，从而使抑菌活性显著提高，尤其大大增加了对弧菌的抑菌能力。本发明是这样实现的，一种高效抑菌斑节对虾抗脂多糖因子lbd区突变体，所述突变体序列为：

alfpm11-lbd-d1：ycsyktrykflrwklkfktkiwcp-nh2

或alfpm11-lbd-d2：yckykyrykfkrwklkfkykfrcp-nh2；

或alfpm11-lbd-d3：yckykyrykfkwrlkfkykfrwcp-nh2；

或alfpm11-lbd-d4：kcyskyrkyfkrwkryfktwfkcp-nh2。

如上述的高效抑菌斑节对虾抗脂多糖因子lbd区突变体在制备抗菌肽中的应用。

如上述的高效抑菌斑节对虾抗脂多糖因子lbd区突变体在制备抗芽孢杆菌t2，金黄色葡萄球菌，鳗弧菌，无乳链球菌，副溶血弧菌，嗜水气单胞菌或芽孢杆菌中的至少一种菌的试剂中的应用。

如上述的高效抑菌斑节对虾抗脂多糖因子lbd区突变体在培育具有抗芽孢杆菌t2，金黄色葡萄球菌，鳗弧菌，无乳链球菌，副溶血弧菌，嗜水气单胞菌或芽孢杆菌中的至少一种菌的斑节对虾优良品种中的应用。

如上述的高效抑菌斑节对虾抗脂多糖因子lbd区突变体在制备防治对虾弧菌病的药剂中的应用。

进一步地，所述对虾弧菌病包括急性肝胰腺坏死病。

如上述的高效抑菌斑节对虾抗脂多糖因子lbd区突变体在水体净化或水产品保鲜中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明通过在alfpm11-lbd中增加带正电荷氨基酸与芳香族氨基酸交替出现的特征序列，获得了三种有高效抗菌活性的新型抗菌肽突变体，该突变体能够高效杀灭鳗弧菌，并显著提高了alf-lbd对多种水生病原菌以及金黄色葡萄球菌的抑制活性。通过增加赖氨酸个数使d1的溶解度获得提高。本发明可用于对虾弧菌病(如急性肝胰腺坏死病)的防治、水体净化以及水产品的保鲜等。

附图说明

图1是alfpm11-lbd-wthplc与质谱图(理论分子量：3112.68)；

图2是alfpm11-lbd-d1hplc与质谱图(理论分子量：3184.88)；

图3是alfpm11-lbd-d2hplc与质谱图(理论分子量：3369.12)；

图4是alfpm11-lbd-d3hplc与质谱图(理论分子量：3427.15)；

图5是alfpm11-lbd-d4hplc与质谱图(理论分子量：3339.01)；

图6是alfpm11-lbdwt与突变体对8种指示菌的抑制活性检测结果；x轴为抑菌剂的种类；y轴为18h与0hod600值的差别。amp,氨苄青霉素。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了一种高效抑菌斑节对虾抗脂多糖因子lbd区突变体及其应用，具体如下各实施例所示。

实施例

1、突变体的设计

alf的lbd区会形成两亲结构，可能对细菌细胞膜结构具有破坏性，从而杀灭细菌。斑节对虾alfpm11的lbd具有正电荷氨基酸与疏水氨基酸交替出现的特征，但并没有分布在全部区域。本发明通过增加交替出现的正电荷氨基酸与疏水氨基酸的个数来增强抗菌活性。分别设计了alfpm11-lbd-d1、alfpm11-lbd-d2和alfpm11-lbd-d3三种突变体，其中d1相比wt只改变了四个氨基酸残基(序列用加粗进行标记)，d2相比野生型增加了6个正电荷氨基酸和4个芳香族氨基酸，d3相比d2改变了中间位置的氨基酸(见加粗同时加下划线位置)，使所有序列为正电荷氨基酸与疏水氨基酸交替。alfpm11-lbd-d4也设计为正电荷氨基酸与芳香族氨基酸交替出现的序列，但在排列方式上，部分区域为2：2的规律。具体突变体序列如下：

alfpm11-lbd-wt：ycsystrpyflrwqlkfktkiwcp-nh2

alfpm11-lbd-d1：ycsyktrykflrwklkfktkiwcp-nh2

alfpm11-lbd-d2：yckykyrykfkrwklkfkykfrcp-nh2

alfpm11-lbd-d3：yckykyrykfkwrlkfkykfrwcp-nh2

alfpm11-lbd-d4：kcyskyrkyfkrwkryfktwfkcp-nh2。

2、突变体合成

由第三方公司通过化学合成的方法获得野生型和四种突变体多肽，并形成二硫键。通过高压液相(hplc)和质谱检测多肽的纯度和分子量，见图1-图5。

3、抑菌活性测定

本发明所用的芽孢杆菌t2分离自江苏太湖，副溶血弧菌os4分离于染病的赤点石斑鱼，嗜水气单胞菌cgmcc1.2017购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，无乳链球菌gim1.768，金黄色葡萄球菌gim1.221，芽孢杆菌，哈维氏弧菌，鳗弧菌均来源于中国水产科学研究院南海水产研究所。本发明将分别检测野生型alfpm11-lbd和四种突变体对上述细菌的抑菌活性。

抑菌活性测定实施方式：

(1)将多肽粉末溶解于pbs，配制终浓度为128μm的母液。

(2)将芽孢杆菌t2，金黄色葡萄球菌，哈维氏弧菌，鳗弧菌用lb培养基，37℃培养至对数期(od600＝0.5)；将无乳链球菌，副溶血弧菌，嗜水气单胞菌，芽孢杆菌用lb培养基，30℃培养至对数期(od600＝0.5)。

(3)将对数期菌液用lb稀释500倍以用于活性检测。

(4)在96孔板中添加50μl母液和50μl稀释后的菌液，混匀后，测定od600值；37度培养18h后再次测定od600值。分别以pbs和氨苄青霉素(终浓度500μg/ml)为阴性和阳性对照。

抑菌活性检测结果见图6，结果表明，d1与wt活性相似，只对芽孢杆菌t2有杀灭作用，而d2、d3和d4抑菌活性有明显提高，能够完全杀灭鳗弧菌，对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、芽孢杆菌有显著的抑制作用，对两种典型水体病源微生物副溶血弧菌和嗜水气单胞菌也具有较强的抑制活性，但不能够抑制哈维氏弧菌。因此，经过改造的alf-lbd具有很高的抑菌活性。此外，d1相比wt有更好的溶解性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。