一种牛支原体分泌性黏附蛋白MbovP581的制作方法

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及一种牛支原体分泌性黏蛋白mbovp581。

背景技术：

牛支原体(mycoplasmabovis,m.bovis)属于古柔膜体纲(mollicutes)，支原体目(mycoplasmatles)，支原体科，支原体属，能引起肉牛和奶牛肺炎、乳腺炎、关节炎等重要疾病，还可导致生殖道炎症、结膜炎、中耳炎等多种症状，平均发病率为40％，病死率为10％。牛支原体于1961年首次在美国从患乳房炎奶牛的牛奶中分离得到，1976年证实其是导致肺炎的重要病原体。2008年，湖北省从外地引进肉牛中流行呼吸道疾病，牛群引进后2周左右发病，表现为发热，咳嗽，流鼻涕，犊牛和体质弱的牛发病严重，华中农业大学农业微生物学国家重点实验室病毒分室率先确定该病为“传染性牛支原体肺炎”，此后，发现该病已在全国普遍流行。架子牛的牛支原体肺炎发病往往与肉牛异地育的运输应激有关，而初生犊牛可通过吮吸患牛支原体乳腺炎母牛的母乳而被感染，发生牛支原体肺炎、关节炎和耳炎(郭爱珍，2011)。当牛支原体肺炎发生后，又进一步导致牛体免疫力下降，导致其他条件致病菌如a型多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌、呼吸道合胞体病毒等继发感染，协同致病，加重临床症状，统称为牛呼吸疾病综合征(bovinerespiratorydiseases,brd)。

该病呈世界性流行。在法国，其患有肺炎的牛场中牛支原体的分离率30％；在不列颠，其患有肺炎的牛场中牛支原体抗体阳性率为20％-25％；在爱尔兰，其患有肺炎的牛场中牛支原体的分离率为13％-23％。新西兰于2017年7月首次报道奶牛感染牛支原体，此后数月多个农场受到影响，数万头奶牛被捕杀。该国政府正在通过大规模捕杀来实施根除计划，试图成为世界上第一个消灭牛支原体的国家。

目前尚缺乏特异性防控手段用于牛支原体病的防治，而创制特异性防控措施需要特异性分子靶标。确定牛支原体的毒力相关因子和免疫原性蛋白是发现牛支原体特异性靶标的前提。分泌蛋白常与病原体毒力和免疫反应相关，因此是寻找特异性分子靶标的优先考虑对象。然而，由于牛支原体基因组中大部分基因为未知基因，且支原体分泌蛋白的研究刚起步，所以，相关研究进展缓慢。本申请人通过双向电泳与质谱分析鉴定出mbovp581蛋白存在于牛支原体分泌蛋白组中，具有免疫原性。进一步证明该分泌蛋白是牛支原体的一种细胞黏附蛋白。鉴于黏附是感染发生的第一步，因此该蛋白是一种很有前途的分子靶标。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种牛支原体分泌性黏附蛋白mbovp581，该蛋白基因可望作为牛原体的特异性分子靶标，可用于研发牛支原体病特异性的防控。

本发明的技术方案如下所述：

申请人通过免疫荧光方法发现该蛋白可以黏附牛肺上皮细胞。

申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到一株牛支原体本地分离株hb0801，申请人将其命名为牛支原体hb0801，mycoplasmabovishb0801,于2010年2月1日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno：m2010040。

使用三氯醋酸(tca)丙酮沉淀法提取牛支原体hb0801株分泌蛋白组，利用双向电泳的裂解缓冲液溶解分泌蛋白组，通过常规westernblot方法，证明该蛋白为一种分泌蛋白。

以hb0801基因组为模板，克隆mbov_0581基因，将基因按照大肠杆菌密码子偏爱性进行修饰，表达和纯化重组rmbovp581。将该蛋白与牛肺上皮细胞(embryonicbovinelungcells，ebl)进行孵育，通过免疫荧光方法检测并证实rmbovp581蛋白能特异性地黏附到ebl细胞上，确认是牛支原体的一种黏附蛋白。

本发明具有以下优点：

本发明首次发现牛支原体分泌蛋白mbovp581是一种黏附蛋白，可望作为分子靶标开发和利用。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：pet-30a质粒图谱。

图2：本发明构建的重组质粒pet-30a-mbov_0581图谱。

图3：是本发明纯化的牛支原体重组mbovp581(或写作rmbovp581)蛋白电泳图谱。附图标记说明：rp表示纯化后的rmbovp581蛋白。蛋白分子量为80kda。

图4：是本发明牛支原体mbovp581蛋白分泌性验证的westernblot图谱。附图标记说明：m：蛋白marker；wp：牛支原体hb0801株全菌蛋白；sec：牛支原体hb0801株分泌蛋白组。

图5：是本发明牛支原体rmbovp581与人工感染牛支原体的牛血清反应的westernblot图谱。附图标记说明：m：蛋白marker；1：rmbovp581蛋白与牛支原体感染后的牛血清反应组；2：rmbovp581蛋白与牛支原体阴性牛血清反应组。

图6：是本发明牛支原体rmbovp581黏附ebl细胞图谱。附图标记说明：图6中的a图：黏附组中被dapi染色的细胞核；图6中的b图：黏附组中被罗丹明染色为红色的f-actin；图6中的c图：黏附到ebl细胞上的fitc标记的rmbovp581蛋白；图6中的d图：rmbovp581黏附组融合图；图6中的e图：对照组融合图。图6中的f图：流式细胞术检测rmbovp581蛋白黏附到ebl细胞(p<0.001)。

具体实施方式

对序列表的说明：

序列表seqidno:1是本发明牛支原体mbov_0581基因的核苷酸序列，序列长度为2103bp。

序列表seqidno:2是本发明牛支原体mbovp581蛋白的氨基酸序列，编码700个氨基酸。

序列表seqidno:3是本发明克隆的牛支原体mbov_0581基因依据大肠杆菌密码子偏爱性通过人工突变的核苷酸序列，序列长度为2103bp。

实施例1：牛支原体mbov_0581基因克隆和表达纯化

1.牛支原体mbov_0581基因克隆和表达和mbovp0581纯化

以牛支原体hb0801(基因组genbank登录号为cp002058)中的mbov_0581基因的核苷酸序列见seqidno:1，序列大小为2103bp。以该原始序列为模板，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，将该基因的密码子uga突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子ugg，突变后的序列见seqidno:3，序列大小为2103bp。将seqidno:3所示的序列送商业基因克隆公司进行合成。原基因序列和突变后的基因序列编码的蛋白质序列相同(序列见seqidno:2)，编码700个氨基酸。

将合成的mbov_0581基因的扩增产物，用xhoi和bamhⅰ酶切，同时将pet-30a质粒(图谱见图1)(购自默克中国有限公司)用xhoi和bamhⅰ进行双酶切。将酶切后的mbov_0581基因和pet-30a质粒用dna连接酶(t4dnaligase(购自neb公司))进行连接，得到重组质粒pet-30a-mbov_0581(图谱见图2)。用该重组质粒pet-30a-mbov_0581转化大肠杆菌dh5α后，置于37℃摇床在180r/min下培养12小时，提取质粒，用通用载体t7经过测序，确定插入序列正确后转化大肠杆菌bl21。将所得的重组大肠杆菌bl21在lb液体培养基中培养至od＝0.6时，取1ml菌液作为诱导前对照，同时加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.8mm，在37℃摇床上诱导表达3小时。取1ml菌液进行下一步处理：样品处理方法为12000r/min离心1min后弃掉上清，加入1ml磷酸盐缓冲液即pbs(配方：kcl0.2g，nacl8g，na2hpo41.44g，kh2po40.24g，1000ml蒸馏水，ph＝7.6)溶液重悬后再以12000r/min离心1min弃掉上清，然后加入30ul的pbs和30ul上样缓冲液(1mtris-hcl(ph＝6.8)1ml，200mmddt0.31g，4％sds0.4g，0.2％溴酚蓝0.02g，20％甘油2ml，7ml超纯水)重悬。在100℃沸水中煮沸10min。用12％sds-page凝胶电泳鉴定是否表达。rmbovp581蛋白大小为80kda。

2.牛支原体rmbovp581的纯化

将重组的大肠杆菌bl21用0.8mmiptg按上述步骤1的方法诱导表达后，取菌液8000r/min离心10min后弃掉上清，用500ml的pbs洗一次后在8000r/min离心10min，再重复用500ml的pbs洗一次。弃掉上清后加入30ml的pbs重悬，加入蛋白酶抑制剂(购自上海罗氏制药有限公司)，使用液压破碎仪破碎。破碎后以12000r/min离心30min，取30μl上清加入30μl上样缓冲液，在沸水中煮沸10min作为上清组。取少许沉淀加入30μl的pbs和30μl上样缓冲液煮沸10min作沉淀组。经过sds-page凝胶电泳后，确定rmbovp581大部分表达于上清中。

rmbovp581蛋白具体纯化步骤如下：

(1)向亲和层析柱中加入1mlni-nta金属螯合his蛋白纯化介质填料(购自ge公司)；

(2)向亲和层析柱中加入12mlddh2o洗涤；

(3)加入12ml的bindingbuffer(20mmna3po4，0.5mnacl，20mm咪唑，ph＝7.4)平衡柱子；

(4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的蛋白表达上清，收集前几滴滤出的液体，编号为1；

(5)加入50mlbindingbuffer缓冲液平衡柱子，收集前几滴液体，编号为2；

(6)加入50mlwashingbuffer缓冲液(20mmna3po4，0.5mnacl，60mm咪唑，ph＝7.4)洗去杂蛋白，收集前几滴，编号为3；

(7)加入12mlelutebuffer缓冲液(20mmna3po4，0.5mnacl,1m咪唑，ph＝7.4)洗脱目的蛋白，收集前几滴，编号为4；

(8)将编号为1到4的管中各加入50μl上样缓冲液煮沸10min；

(9)配置12％sds-page聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中(20μl/每孔)，电泳(浓缩胶电泳条件为直流电压为80伏特，分离胶电泳条件为直流电压为120v)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白。

纯化后的rmbovp581蛋白大小为80kda，且条带单一(图3)。

实施例2：牛支原体mbovp581分泌性验证

使用ppplo培养基培养牛支原体hb0801株至对数期，在140000g离心20分钟，并使用0.22μm的滤器过滤上清。向上清中加入tca试剂至终浓度为10％，置于4℃孵育过夜。65000g离心20分钟，去上清后使用预冷的丙酮洗涤沉淀。清洗后的沉淀使用裂解缓冲液(8murea,4％chaps,2mthiourea,60mmdtt,2％amidosulfobetaine-14(asb-14),40mmtris-hclph8.8)溶解，即为分泌蛋白组提取物，使用2dquantkit测量蛋白质的浓度，向蛋白组中加入pmsf防止蛋白降解，-80℃保存。

同时，按以下方法提取全菌蛋白：取生长至对数期的牛支原体10ml，12000r/min离心10min，使用10mlpbs洗涤沉淀1次，然后再使用500ulpbs重悬沉淀一次，利用超声破碎仪破碎牛支原体(200w，5min)，破碎后的样品使用bca试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)测量蛋白浓度，存于-20℃备用。

将全菌蛋白上样量1μg，分泌蛋白组上样量是50μg中加入5×sds-page蛋白上样缓冲液，总量均8μl，沸水加热5分钟，使蛋白充分变性。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到12％sds-page胶加样孔。上层胶电泳电压为80v，下层胶电泳电压为120v。电泳完成后，采用湿转法使用硝酸纤维素膜转印蛋白，电压为100v，转膜时间为1小时。转膜完毕后，使用5％脱脂牛奶封闭膜，置于4℃封闭过夜。使用tbst(10mmtris-hcl，150mmnacl，tween-20(0.05％(v/v))，ph7.4)洗膜三次，每次间隔5分钟，然后与使用tbst稀释的抗rmbovp581蛋白的小鼠抗血清(体积比为1:500)于室温孵育3小时。使用tbst洗膜五次，每次间隔5分钟，然后与使用tbst稀释的抗小鼠igg抗体(southernbiotech)(体积比为1:5000)于室温孵育1小时。孵育完成后，用tbst洗膜五次，每次间隔5分钟，并使用化学发光显色和图像获取。结果表明，mbovp581蛋白存在于分泌蛋白组中，验证了该蛋白为牛支原体分泌蛋白，分子量为80kda(图4)。

实施例3：牛支原体mbovp581天然抗原性验证

纯化的rmbovp581蛋白，加入5×sds-page蛋白上样缓冲液处理，煮沸5分钟。冷却至室温后，将蛋白样品直接上样到sds-page胶加样孔。上层胶电泳电压为80v，下层胶电泳电压为120v。电泳完成后，使用硝酸纤维素膜转印蛋白，本实施例采用湿转法，电压为100v，转膜时间为1小时。转膜完毕后，使用5％脱脂牛奶封闭膜，置于4℃封闭过夜。使用tbst洗膜三次，每次间隔5分钟，然后与使用tbst稀释的牛支原体hb0801人工感染试验中5头牛的混合血清(实验室留存)(体积比为1:500)于室温孵育3小时。未感染的牛血清(实验室留存)(体积比为1:500)被用作阴性对照。使用tbst洗膜五次，每次间隔5分钟，然后与使用tbst稀释的抗牛igg抗体(southernbiotech)(体积比为1:5000)于室温孵育1小时。孵育完成后，用tbst洗膜五次，每次间隔5分钟，并使用化学发光显色和图像获取。试验结果表明：rmbovp581蛋白可以与人工感染牛支原体的牛阳性血清反应，而且不与阴性血清反应，证明mbovp581蛋白在牛支原体人工感染中能诱导免疫反应，具有抗原性(图5)。

实施例4：牛支原体mbovp581黏附细胞功能验证

1.定性黏附试验

将牛肺上皮细胞(ebl)细胞接种于铺有细胞爬片的6孔板中，培养过夜，待细胞贴壁后，补加500μl细胞完全培养基。细胞使用4％多聚甲醛固定10min，然后再使用0.5％的tritonx-100在室温通透5min。用pbs洗一次后，使用1％的bsa(牛血清白蛋白)在37℃下封闭2h。本黏附试验分为2个孔：第一孔中加入10μg的rmbovp581蛋白，第二孔中加入10μlpbs作为空白对照。将上述液体加入到固定和渗透好的ebl细胞孔中，于37℃孵育1h。用pbs洗涤3次后，向每个孔中加入含1％bsa蛋白的pbs稀释的鼠抗rmovp581蛋白多克隆抗体(按照常规方法制备)(体积比为1:300)，于4℃孵育过夜。洗涤3次后，每孔中加入fitc标记的羊抗鼠igg(southernbiotech)(体积比为1:1000)，在37℃孵育1h。用pbs洗一次，然后加入罗丹明染料(thermofisher)(100nmol/l)在室温下作用30min，洗涤一次后加入dapi染色细胞核(购自碧云天生物科技有限公司)(5min)。再次洗涤，捞片，倒放入滴有抗荧光淬灭剂的载玻片上，在日本奥林巴斯fv1000ix81激光共聚焦显微镜成像系统进行成像观察。试验结果见图6中的a图-e图。ebl细胞核被dapi染为蓝色(见图6中的a图)，f-actin蛋白被染色为红色(见图6中的b图)，黏附到ebl细胞的rmbovp581蛋白被标记为绿色(图6c)，融合的图片显示rmbovp581蛋白黏附到ebl细胞上(见图6中的d图)，而空白对照组未检测到绿色荧光(见图6中的e图)。

2.定量黏附检测

将10⁶个ebl细胞在1.5mlep管中与10μgrmovp581蛋白或者pbs在37℃孵育1h。转速为1000rpm，室温下离心5min，弃上清，每管加入1mlpbs重悬细胞，按以上条件离心洗涤3次后，在ep管中加入鼠抗rmovp581多克隆抗体(体积比为1:300)。将ep管放在37℃作用30min，按前述条件洗涤3次后，加入fitc标记的羊抗鼠igg(southernbiotech)(体积比为1:1000)，在37℃作用30min。按前述条件洗涤后使用流式细胞仪检测rnox蛋白对ebl细胞的黏附情况。试验结果表明，相比对照组，rmbovp581蛋白对ebl细胞的黏附率(约50％)显著高于到对照组(1％)(p<0.001)(图6f)。

附录：说明书中名词术语说明：

牛支原体mbovp581重组蛋白，以rmbovp581表示。

牛支原体mbovp581蛋白的编码基因，以mbov_0581表示。

牛支原体本地分离株，以牛支原体hb0801表示。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种牛支原体分泌性黏附蛋白mbovp581

<141>2020-03-26

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2103

<212>dna

<213>牛支原体(mycoplasmabovis)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2103)

<400>1

atgatttgactaaaaaaacttattgataatgttaaattatcaacagcaaaagtcactgat60

aatgatatagctgaatatgatagactctcggcaaaaatacttaattcagataaaaatgca120

gaagaaattcctgcaattgaattaaaaaatgtaatcattgacttcggcgaaacattggct180

gttgataatgtaagttttaaaattcctaatggtaagttagttacccttttaggtccttct240

ggtagtggcaaaactacaacacttaatgctataagtgggctactaagaataactagtggt300

aacgtatactttaatggtaaagacgtgactaatttatcgcctcagcaaagaaaattaggt360

tttgttttccaaaactatgcactttatccacatatgagtgtttttgataacatcgcattc420

ccattaaaaaatgatattaagtgacaaaataaggcaattgacaaaaaaaatagtgcaatt480

atcaaaatcaaaaacttgtatttaaaaagtcttggtgcttctgatgaagagattaacaaa540

atcaatgatttatgaaatatttatactaatattgataaagaagttgattatgaacttaat600

aattttgtggtcaaaaacaataaaattattgaaaaagcaaaaactgattataaattagct660

aaaatccactatgaaggggagttggctacaatttcaaaaacaattttaaaagcatttaac720

agcttgaaaaagtcatacaagcttaaaaaagacaatattaaaaaacatttcaatttactt780

aagcttaataatgatcttaaaaatgagtcagaatatcctaagtgtgaatttttagctaat840

cttgatactcaattgctttcatacaaaaaagttgctaatgtagatgaagctactgaaaag900

tatcataatttacaagaggttatttctgatatatcaactctagattgaaaggtctattca960

gaaaaagatcaatatgagcttttaaaagtcgaaaacaaacttcttaaagcaagtttatac1020

tacaaatattgtatgaacacactaaaagctattgaaaacggagagcaagaagtagctaaa1080

gctaaagaagcgcttaaagaagctaaaatagctaacaaagagttaaaggctaataacaag1140

gaagacttaaaaagattaaagcacaacttcaaacatatgcgttttgttgcctataagatt1200

tttaaatcttttgctgatgaaatttatgctaaatataatcttgatgaagttatgaaagat1260

gacaatgagcataaaaatgctaatttgtccgaagcacaaagagatgaaatttatgaactt1320

tcaaaagacataatttcaattaaaaaagctatttttaatgaagttatggaagttgctaaa1380

agagttgaaattcttcctattttgcaaaagaaacctacaagactttcaggtggtcaacaa1440

caacgtgttgctatcgcccgtgctattgttaaaaagcctgacattttattaatggatgaa1500

ccgctttcaaaccttgatgctaaattacgtatatcaacaagacaatgaattagacaaatt1560

caaagaaatcttggtattacaacagtttttgttactcacgaccaagaagaagctatgtct1620

attagtgatattgttgtatgtatgtcaacatcaaaagttcaacaactaggctcaccatta1680

gaactatataatagacctaaaaataaatttgtggctcgtttcttgggtatgcctgaaatg1740

ggactattcccaggtaaatatgaaaacggaaaacttagcgtattaggcaaaccagttgat1800

ggcattacattttctgaatatgaccaatttacctgtaatgtaggggtaagagccgaagac1860

tttgatattgtaaaatcaagcgcagatgctaattactttggattagttaaagctgttgaa1920

aactttggtaaagaaagcaaattaattgttgaagttcctgaagctggtgacgttaacttc1980

ttggtctcaaatgactatgtgtacaacgttagagacaaaatttacttcaatctaccaact2040

aacaggcttcacatatttgacaaagcaaatgatgaaagagtagagtatgaaattaaaaaa2100

tag2103

<210>2

<211>2103

<212>dna

<213>牛支原体(mycoplasmabovis)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2103)

<220>

<221>cds

<222>(1)..(2103)

<400>2

atgatctggctgaaaaagctgattgacaacgttaaactgagcaccgcc48

metiletrpleulyslysleuileaspasnvallysleuserthrala

151015

aaggttaccgataacgacattgcagaatacgatcgcctgtccgccaag96

lysvalthraspasnaspilealaglutyraspargleuseralalys

202530

attttaaacagcgacaaaaatgccgaagaaattccagcaatcgaactg144

ileleuasnserasplysasnalaglugluileproalailegluleu

354045

aaaaatgtgattatagatttcggcgagaccctggcagttgacaatgtg192

lysasnvalileileasppheglygluthrleualavalaspasnval

505560

tcctttaaaattcccaatggcaaactggtgaccctgctggggccgagt240

serphelysileproasnglylysleuvalthrleuleuglyproser

65707580

ggtagtggtaaaacgacaaccctgaatgcgatcagcggtctgttacgt288

glyserglylysthrthrthrleuasnalaileserglyleuleuarg

859095

ataaccagcggtaatgtttattttaatggcaaagatgtgacgaatctt336

ilethrserglyasnvaltyrpheasnglylysaspvalthrasnleu

100105110

agtccgcaacaacgtaaattaggtttcgtgttccagaattatgcactg384

serproglnglnarglysleuglyphevalpheglnasntyralaleu

115120125

tatccgcacatgtcagtttttgacaatatcgcatttccgctgaagaac432

tyrprohismetservalpheaspasnilealapheproleulysasn

130135140

gatattaaatggcaaaataaggccattgataagaaaaacagcgcaatt480

aspilelystrpglnasnlysalaileasplyslysasnseralaile

145150155160

attaagatcaagaacctgtatctgaagagcctgggggcaagcgatgaa528

ilelysilelysasnleutyrleulysserleuglyalaseraspglu

165170175

gaaattaataaaattaacgatctttggaacatctacaccaatatagac576

gluileasnlysileasnaspleutrpasniletyrthrasnileasp

180185190

aaagaagtggattatgaactgaacaactttgtggtgaaaaataataag624

lysgluvalasptyrgluleuasnasnphevalvallysasnasnlys

195200205

atcatcgagaaagcaaagacagattataaactggcaaaaatacactac672

ileileglulysalalysthrasptyrlysleualalysilehistyr

210215220

gaaggtgaactggcaaccattagcaaaaccattctgaaagcattcaac720

gluglygluleualathrileserlysthrileleulysalapheasn

225230235240

tccctgaaaaagagctacaaactgaaaaaggataacataaagaagcac768

serleulyslyssertyrlysleulyslysaspasnilelyslyshis

245250255

ttcaacctgctgaaactgaataatgatctgaaaaatgagagcgaatac816

pheasnleuleulysleuasnasnaspleulysasngluserglutyr

260265270

ccaaaatgcgaatttctggcaaatcttgacacccagctgctgagctac864

prolyscysglupheleualaasnleuaspthrglnleuleusertyr

275280285

aaaaaggtcgccaatgtggatgaggcaaccgaaaaataccataacctg912

lyslysvalalaasnvalaspglualathrglulystyrhisasnleu

290295300

caagaagtgataagcgatatttcaaccctggattggaaagtttactca960

glngluvalileseraspileserthrleuasptrplysvaltyrser

305310315320

gaaaaagatcaatacgagctgctgaaagttgaaaataaactgctgaaa1008

glulysaspglntyrgluleuleulysvalgluasnlysleuleulys

325330335

gcaagcctgtactacaaatactgtatgaataccctgaaagcaattgaa1056

alaserleutyrtyrlystyrcysmetasnthrleulysalaileglu

340345350

aatggtgaacaggaagtggccaaagcaaaagaagcattaaaagaagca1104

asnglygluglngluvalalalysalalysglualaleulysgluala

355360365

aagatagcaaataaggagctgaaagcaaataataaagaggatctgaaa1152

lysilealaasnlysgluleulysalaasnasnlysgluaspleulys

370375380

cggctgaaacataattttaaacacatgagattcgttgcatacaaaatt1200

argleulyshisasnphelyshismetargphevalalatyrlysile

385390395400

tttaagagcttcgcagatgaaatctacgcaaaatacaatttagacgaa1248

phelysserphealaaspgluiletyralalystyrasnleuaspglu

405410415

gtgatgaaagacgataatgaacataaaaacgcaaacctgagcgaagcg1296

valmetlysaspaspasngluhislysasnalaasnleusergluala

420425430

cagcgcgatgaaatttacgaactgagcaaagacataataagcattaaa1344

glnargaspgluiletyrgluleuserlysaspileileserilelys

435440445

aaggcaatcttcaacgaagtgatggaagtggcaaaacgggtggaaatc1392

lysalailepheasngluvalmetgluvalalalysargvalgluile

450455460

ctgccgatattacagaaaaagccaacccggctgagcggcggacaacaa1440

leuproileleuglnlyslysprothrargleuserglyglyglngln

465470475480

caaagagtggcgattgcgagagcaattgtgaaaaagccagatattctg1488

glnargvalalailealaargalailevallyslysproaspileleu

485490495

ctgatggatgaaccgctgagcaatctggatgcaaaactgagaatcagc1536

leumetaspgluproleuserasnleuaspalalysleuargileser

500505510

acccgtcagtggataagacagatccagcgtaatctggggataaccacc1584

thrargglntrpileargglnileglnargasnleuglyilethrthr

515520525

gttttcgtgacccatgaccaagaagaagcaatgagcatttcagacatt1632

valphevalthrhisaspglngluglualametserileseraspile

530535540

gttgtttgcatgagcaccagcaaagttcaacagctggggagcccgtta1680

valvalcysmetserthrserlysvalglnglnleuglyserproleu

545550555560

gagctgtataatcgcccaaaaaataaatttgttgcacgttttctgggt1728

gluleutyrasnargprolysasnlysphevalalaargpheleugly

565570575

atgccggaaatgggtctgtttccgggtaaatatgaaaatggtaaactg1776

metproglumetglyleupheproglylystyrgluasnglylysleu

580585590

agcgttctgggtaaaccggttgatggtattacctttagcgaatatgat1824

servalleuglylysprovalaspglyilethrpheserglutyrasp

595600605

cagtttacctgtaatgttggtgttcgtgcagaagattttgatattgtt1872

glnphethrcysasnvalglyvalargalagluasppheaspileval

610615620

aaaagcagcgcagatgcaaattattttggtctggttaaagcagttgaa1920

lysserseralaaspalaasntyrpheglyleuvallysalavalglu

625630635640

aattttggtaaagaaagcaaactgattgttgaagttccggaagcaggt1968

asnpheglylysgluserlysleuilevalgluvalproglualagly

645650655

gatgttaattttctggttagcaatgattatgtttataatgttcgtgat2016

aspvalasnpheleuvalserasnasptyrvaltyrasnvalargasp

660665670

aaaatttattttaatctgccgaccaatcgtctgcatatttttgataaa2064

lysiletyrpheasnleuprothrasnargleuhisilepheasplys

675680685

gcaaatgatgaacgtgttgaatatgaaattaaaaaataa2103

alaasnaspgluargvalglutyrgluilelyslys

690695700

<210>3

<211>700

<212>prt

<213>牛支原体(mycoplasmabovis)

<400>3

metiletrpleulyslysleuileaspasnvallysleuserthrala

151015

lysvalthraspasnaspilealaglutyraspargleuseralalys

202530

ileleuasnserasplysasnalaglugluileproalailegluleu

354045

lysasnvalileileasppheglygluthrleualavalaspasnval

505560

serphelysileproasnglylysleuvalthrleuleuglyproser

65707580

glyserglylysthrthrthrleuasnalaileserglyleuleuarg

859095

ilethrserglyasnvaltyrpheasnglylysaspvalthrasnleu

100105110

serproglnglnarglysleuglyphevalpheglnasntyralaleu

115120125

tyrprohismetservalpheaspasnilealapheproleulysasn

130135140

aspilelystrpglnasnlysalaileasplyslysasnseralaile

145150155160

ilelysilelysasnleutyrleulysserleuglyalaseraspglu

165170175

gluileasnlysileasnaspleutrpasniletyrthrasnileasp

180185190

lysgluvalasptyrgluleuasnasnphevalvallysasnasnlys

195200205

ileileglulysalalysthrasptyrlysleualalysilehistyr

210215220

gluglygluleualathrileserlysthrileleulysalapheasn

225230235240

serleulyslyssertyrlysleulyslysaspasnilelyslyshis

245250255

pheasnleuleulysleuasnasnaspleulysasngluserglutyr

260265270

prolyscysglupheleualaasnleuaspthrglnleuleusertyr

275280285

lyslysvalalaasnvalaspglualathrglulystyrhisasnleu

290295300

glngluvalileseraspileserthrleuasptrplysvaltyrser

305310315320

glulysaspglntyrgluleuleulysvalgluasnlysleuleulys

325330335

alaserleutyrtyrlystyrcysmetasnthrleulysalaileglu

340345350

asnglygluglngluvalalalysalalysglualaleulysgluala

355360365

lysilealaasnlysgluleulysalaasnasnlysgluaspleulys

370375380

argleulyshisasnphelyshismetargphevalalatyrlysile

385390395400

phelysserphealaaspgluiletyralalystyrasnleuaspglu

405410415

valmetlysaspaspasngluhislysasnalaasnleusergluala

420425430

glnargaspgluiletyrgluleuserlysaspileileserilelys

435440445

lysalailepheasngluvalmetgluvalalalysargvalgluile

450455460

leuproileleuglnlyslysprothrargleuserglyglyglngln

465470475480

glnargvalalailealaargalailevallyslysproaspileleu

485490495

leumetaspgluproleuserasnleuaspalalysleuargileser

500505510

thrargglntrpileargglnileglnargasnleuglyilethrthr

515520525

valphevalthrhisaspglngluglualametserileseraspile

530535540

valvalcysmetserthrserlysvalglnglnleuglyserproleu

545550555560

gluleutyrasnargprolysasnlysphevalalaargpheleugly

565570575

metproglumetglyleupheproglylystyrgluasnglylysleu

580585590

servalleuglylysprovalaspglyilethrpheserglutyrasp

595600605

glnphethrcysasnvalglyvalargalagluasppheaspileval

610615620

lysserseralaaspalaasntyrpheglyleuvallysalavalglu

625630635640

asnpheglylysgluserlysleuilevalgluvalproglualagly

645650655

aspvalasnpheleuvalserasnasptyrvaltyrasnvalargasp

660665670

lysiletyrpheasnleuprothrasnargleuhisilepheasplys

675680685

alaasnaspgluargvalglutyrgluilelyslys

690695700